Summary
Aquí, presentamos un protocolo para reducir significativamente el número de copias de ADN mitocondrial en un ovocito bovino (P < 0,0001). Este método utiliza la centrifugación y la bisección para reducir sustancialmente las mitocondrias de los ovocitos y puede permitir una mayor probabilidad de desarrollo en los embriones de transferencia nuclear de células somáticas entre especies reconstruidos.
Abstract
La transferencia nuclear de células somáticas entre especies (iSCNT) se puede utilizar para rescatar especies en peligro de extinción, pero existen dos poblaciones distintas de ADN mitocondrial (ADNmt) dentro del embrión reconstruido: una dentro del ooplasma receptor y otra dentro de la célula somática donante. Esta heteroplasmia mitocondrial puede conducir a problemas de desarrollo en el embrión y el feto. Los protocolos de clonación hechos a mano incluyen la bisección de ovocitos, que se puede utilizar para disminuir el número de copias de ADNmt, reduciendo el grado de heteroplasmia mitocondrial en un embrión reconstruido. La centrifugación de ovocitos bovinos maduros y desnudos produjo una fracción visible densa en mitocondrias en un polo del ovocito. Los ovocitos zonae pellucidae se eliminaron por exposición a una solución de pronasa. La bisección se realizó utilizando una microcuchilla para eliminar la fracción visible de mitocondrias. La qPCR se utilizó para cuantificar el ADNmt presente en muestras de ADN extraídas de ovocitos enteros y ooplastos bisectados, proporcionando una comparación de los números de copias de ADNmt antes y después de la bisección. Los números de copia se calcularon utilizando valores umbral de ciclo, la fórmula de línea de regresión de una curva estándar y una relación que incluía los tamaños respectivos de los productos de PCR de ADNmt y los productos de PCR genómica. Un ovocito bovino tenía un número promedio de copias de ADNmt (desviación estándar ±) de 137.904 ± 94.768 (n = 38). Un ooplasto agotado de mitocondrias tenía un número promedio de copias de ADNmt de 8.442 ± 13.806 (n = 33). Las copias promedio de ADNmt presentes en un ooplasto rico en mitocondrias fueron de 79.390 ± 58.526 copias de ADNmt (n = 28). Las diferencias entre estos promedios calculados indican que la centrifugación y la posterior bisección pueden disminuir significativamente el número de copias de ADNmt presentes en el ooplasto agotado de las mitocondrias en comparación con el ovocito original (P < 0,0001, determinado por ANOVA unidireccional). La reducción del ADNmt debería disminuir el grado de heteroplasmia mitocondrial en un embrión reconstruido, posiblemente fomentando el desarrollo embrionario y fetal estándar. La suplementación con extracto mitocondrial de la célula donante somática también puede ser esencial para lograr un desarrollo embrionario exitoso.
Introduction
La transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) incluye la fusión de un ovocito enucleado de un animal y una célula somática de un animal de la misma especie. En la mayoría de los casos, el ovocito y la célula somática se originan en la misma especie, y las tasas de nacidos vivos están por debajo del 6%1. Algunas investigaciones involucran el uso de SCNT entre especies (iSCNT), que incluye la fusión de una célula somática y un ovocito que se originan a partir de dos especies diferentes. En estos estudios, las tasas de nacidos vivos son incluso más bajas que en SCNT, típicamente menos del 1%1. Sin embargo, iSCNT tiene la capacidad de ser utilizado como un método de rescate de especies en peligro de extinción, ya que las células somáticas de estos animales son más accesibles que sus células germinales1. Los ovocitos receptores utilizados en iSCNT son a menudo especies domésticas o comunes de laboratorio, como vacas, cerdos y ratones. Algunos intentos realizados hasta ahora han producido con éxito crías vivas, aunque las crías producidas han sido animales intragenéricos (las especies de ovocitos receptores y las especies de células donantes eran miembros del mismo género)2,3,4. Los modelos intergenéricos (que utilizan un ovocito y una célula somática de animales de diferentes géneros) aún no han producido animales vivos, y la mayoría de los embriones reconstruidos se detienen en la etapa de 8-16 células del desarrollo in vitro 5,6,7,8. Una posible explicación de este paro embrionario del desarrollo es la aparición de heteroplasmia mitocondrial en los embriones, la presencia de más de un tipo de ADN mitocondrial (ADNmt) en una sola célula. La heteroplasmia puede conducir a problemas como la ineficiencia del desarrollo o la falla en el embrión o en el animal vivo1. La patogénesis también puede ocurrir más adelante en la vida del animal9. Aunque este problema también está presente en la descendencia de SCNT, el componente interespecífico dentro de los embriones de iSCNT exacerba el problema.
Cuando el ADNmt embrionario proviene de dos especies diferentes, las mitocondrias de los ovocitos receptores, que representan la mayoría, no funcionan de manera eficiente o efectiva con el núcleo1,10 de la célula donante. Las brechas taxonómicas más grandes entre las dos especies utilizadas en iSCNT probablemente intensifican este problema; Se demostró que la descendencia viva intragenérica producida (descendencia de Bos gaurus y Bos indicus utilizando ovocitos de Bos taurus), así como la descendencia producida a través de SCNT tradicional (por ejemplo, descendencia de Ovis aries que usa ovocitos de Ovis aries) eran quimeras (el ADNmt de dos individuos estaba presente en estos animales 11,12,13). Sin embargo, se desarrollaron mucho más allá de los embriones intergenéricos scnt14,15. El intercambio de información entre las mitocondrias del ovocito y el núcleo de la célula donante podría tener más éxito en el embrión intragenérico que en el embrión intergenérico16.
La cantidad de ADNmt en un ovocito bovino maduro es aproximadamente 100 veces mayor que la cantidad encontrada en una célula somática12. La reducción de esta proporción podría alentar a las mitocondrias de las células somáticas a proliferar dentro del embrión reconstruido, permitiendo que una mayor población de mitocondrias productivas esté presente16. Esto a su vez podría proporcionar más energía para satisfacer los requisitos del embrión en desarrollo15. Los intentos anteriores realizados para reducir el número de copias de ADNmt del ovocito o embrión incluyen la aplicación química, la micromanipulación y la suplementación del ovocito o embrión con mitocondrias adicionales de la especie de célula donante 16,17,18,19,20. Sin embargo, la aplicación química (como la 2',3'-didesoxicitidina) no es ideal para el desarrollo embrionario, y ha reducido el número de copias de ADNmt de ovocitos en aproximadamente la mitad18. La reducción previa del ADNmt de ovocitos por micromanipulación solo ha eliminado un promedio del 64% del ADNmt del ovocito17. Aunque la suplementación de mitocondrias de células donantes podría ser una opción viable, su uso aún no ha producido un animal intergenérico vivo dentro de los estudios iSCNT21.
El uso de la bisección para reducir el número de copias de ADNmt de ovocitos aún no se ha utilizado en los estudios publicados. La bisección de ovocitos con la intención de fusionar los ooplastos con una célula somática es la premisa de la clonación hecha a mano (HMC), que generalmente utiliza la bisección como método para eliminar el cuerpo polar y la placa metafásica del ovocito metafase II (MII). HMC ha producido con éxito descendencia en varias especies, incluyendo cabras, vacas, cerdos, ovejas y caballos 22,23,24,25,26, pero no suele incluir un paso de centrifugación antes de la bisección. La integración de la centrifugación de alta velocidad del ovocito permite el aislamiento de las mitocondrias (y por lo tanto del ADNmt) en un polo del ovocito, que luego se puede dividir en dos utilizando una microcuchilla para eliminar esas fracciones densas en mitocondrias. Dos ooplastos agotados por las mitocondrias se pueden fusionar con una célula somática, como es el caso en HMC, para formar un embrión reconstruido que contiene considerablemente menos ADNmt de la especie de ovocitos.
La pregunta que intentamos responder con este protocolo es cómo reducir el ADNmt en el ovocito bovino para producir un embrión reconstruido viable que contenga menos ADNmt heteroplásmico. En este protocolo, los ovocitos fueron centrifugados y bisectados. Se calcularon los números de copias de ADNmt de ooplastos y ovocitos intactos para determinar la efectividad de esta técnica en la reducción del número de copias de ADNmt del ovocito bovino.
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Protocol
El siguiente protocolo sigue las pautas de cuidado y ética animal proporcionadas por la Universidad Estatal de Utah.
1. Preparación de los medios
- Antes de la manipulación de ovocitos, prepare las siguientes soluciones, como se describe en la Tabla 1: 400 μL de solución de hialuronidasa, 500 μL de medios T2, 1.020 μL de medios T20 y 800 μL de medios T10.
- Divida el medio T10 en dos pocillos de una placa de cuatro pocillos, 400 μL por pozo. Etiquete uno bien con "M" y el segundo pozo con "MR". Coloque en una incubadora de CO2 al 5% hasta después de la bisección.
- Preparar 500 μL de citocalasina B (CB)/líquido oviductal sintético con HEPES (HSOF). Alícuota 50 μL de solución cb/HSOF en un tubo de centrífuga separado de 1,5 ml.
- Preparar 40 μL de solución de pronasa. Centrífuga durante al menos 30 s a 2.680 x g. Mezclar 20 μL del sobrenadante con 20 μL de T2 en un nuevo tubo de centrífuga; esto forma una solución diluida de 5 mg/ml de pronasa.
- Preparar 3 ml de HSOF. En una placa de búsqueda, deposite por separado cuatro gotas de 400 μL; coloque esta placa debajo de un estereomicroscopio.
- Preparar 500 μL de solución CB/T20.
2. Maduración in vitro (IVM) de ovocitos bovinos
- IVM: Cultivo de complejos cúmulos-ovocitos (AOC) aspirados a 38,5 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 21 h en un plato de cuatro pocillos de medios de maduración que contiene 10% de FBS, 0,26 UI/ml de FSH y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina.
- Realice los siguientes pasos para desnudar los ovocitos.
- Recoja el número deseado de AOC utilizando una pipeta de 200 μL y deposite en la parte inferior de un tubo de centrífuga de 1,5 μL.
- Añadir el mismo volumen de 0,6 mg/ml de hialuronidasa al tubo centrífugo con los ovocitos (es decir, si el volumen de ovocitos y medios de IVM es de 100 μL, añadir 100 μL de hialuronidasa).
- Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo sin crear burbujas, hasta que se hayan eliminado todas las células del cúmulo.
- Comprobar la maduración de los ovocitos.
- Use la pipeta para agregar 200 μL de HSOF de una de las cuatro gotas de HSOF en la placa de búsqueda a la solución de ovocitos/hialuronidasa.
- Transfiera los ovocitos de la gota de hialuronidasa/HSOF y colóquelos en 400 μL de gota de HSOF no utilizada. Lávelos con dos gotas adicionales de HSOF para ayudar a eliminar la hialuronidasa y los restos de células cúmulos.
- Usando una pipeta bucal (o una pipeta y punta de 10 μL) y un alto aumento microscópico, enrolle y seleccione los ovocitos en función de la presencia del cuerpo polar.
- Después de clasificar los ovocitos, recoja el número deseado de ovocitos MII a dividir y colóquelos en 400 μL de gota HSOF.
NOTA: Si los ovocitos han estado fuera de la incubadora durante más de 30 minutos, los ovocitos pueden colocarse de nuevo en un pozo de medios de maduración y colocarse en una incubadora controlada con CO2 para descansar durante al menos 30 minutos. Limite el número de ovocitos a dividir a una cantidad que sea factible terminar de dividir en aproximadamente 30 minutos para minimizar el tiempo fuera de la incubación. Si los ooplastos se van a fusionar con una célula somática, activarse y cultivarse como embriones, los ovocitos deben enuclearse en este momento.
3. Centrifugación de los ovocitos
NOTA: Si los ovocitos se colocaron en la incubadora en medios de maduración, muévalos a la gota HSOF de la que se recolectaron más recientemente.
- Usando una pipeta bucal, recoja los ovocitos maduros seleccionados de la gota HSOF y colóquelos en el tubo de 1,5 ml que contiene 50 μL de la solución HSOF/CB. Centrifugar los ovocitos a 15.000 x g durante 12 min.
NOTA: No es perjudicial que las burbujas estén presentes en el tubo de la centrífuga. - Mientras se centrifugan los ovocitos, prepara la placa de bisección.
- Haga el patrón como se muestra en la Figura 1 en la tapa de una placa de Petri de 60 mm (20 μL por gota) y cubra completamente las gotas con aceite mineral.
- Usando un marcador de punta delgada, marque las líneas debajo del plato, como se muestra en la Figura 2.
- Dibuja una caja alrededor de la gota de pronasa y una línea entre las gotas CB/T20 y la fila inferior de gotas T20.
- Cubra el plato con una tapa opaca hasta que se complete la centrifugación para evitar cambios de osmolaridad de las microgotas.
- Tan pronto como se complete la centrifugación, use una pipeta de 200 μL para recolectar los ovocitos dentro de la solución y muévalos a una porción vacía de una nueva placa de búsqueda con cuatro gotas de HSOF de 400 μL.
- Recoger y lavar los ovocitos a través de las cuatro gotas de HSOF.
Figura 1: Placa de bisección. Todas las gotas mostradas tienen un volumen de 20 μL. La placa tiene un diámetro de 60 mm. Las gotas han sido completamente cubiertas con aceite mineral. Los ovocitos se colocarán primero en la gota T2 superior e izquierda (indicada aquí con una estrella). PRO/T2: 10 μL de pronasa y 10 μL de T2, combinados antes de crear microgotas. CB/T20: 1 μL de citocalasina B por 1 mL de T20, combinado antes de crear microgotas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Placa de bisección marcada. Las líneas se dibujan con un marcador de punta delgada en la parte inferior de la placa, para proporcionar referencias de ubicación para observaciones y transferencias de ovocitos y ooplastos realizadas debajo del microscopio. Los ovocitos se colocarán primero en la gota T2 superior e izquierda (indicada aquí con una estrella). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Preparación del ovocito para la bisección
NOTA: El siguiente proceso implica la preparación de los ovocitos para la bisección.
- Encienda la etapa de calentamiento a 37 °C.
- Use una pipeta bucal para mover los ovocitos centrifugados de la gota HSOF a la gota T2 superior izquierda de la placa de bisección, luego lave los ovocitos a través de las siguientes tres gotas en la fila superior (T2, T20, T20).
- Deposite los ovocitos en una de las gotas de pronasa, asegurando que haya poco o ningún contacto entre ellos.
NOTA: La eliminación de la zona pelúcida puede tomar cantidades variables de tiempo, pero generalmente ocurre entre 30-120 s con el uso de una etapa de calentamiento. La ausencia de una etapa de calentamiento se extenderá este tiempo. - Observar los ovocitos hasta que haya una deformación clara de la zonae pellucidae (ver Figura 3).
- Una vez que una sola zona pelúcida de ovocitos se ha deformado, mueva ese ovocito a la vecina gota T2. Repita a medida que los ovocitos adicionales se deformen, hasta que todos los ovocitos se hayan eliminado de la pronasa y se hayan colocado en la gota T2.
- Observe los ovocitos hasta que solo quede una capa delgada de la zona pelúcida.
- Lave los ovocitos a través de las siguientes tres gotas dentro de la fila (T2, T20, T20), luego deposite en líneas verticales dentro de las gotas CB / T20 (ver Figura 4).
- Comience con menos ovocitos en las líneas verticales y aumente el número de ovocitos por gota a medida que progresan las habilidades de bisección.
Figura 3: Eliminación de la zona pelúcida usando pronasa. (80x) Una zona pelúcida de ovocitos comenzará a aparecer deformada cuando la pronasa haya afectado a la zona pelúcida lo suficiente como para que el ovocito se mueva a la gota T2 adyacente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Orientación de los ovocitos en gotas de bisección. (80x) Los ovocitos libres de zona se depositan en una orientación casi vertical dentro de cada gota CB/T20 antes de la bisección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Bisección de los ovocitos
- Concéntrese en la primera gota DE CB/T20 (bisección) más a la izquierda que contiene ovocitos, y use una pipeta bucal para rotar los ovocitos, de modo que la porción densa en mitocondrias de cada ovocito esté orientada hacia o lejos del brazo del microscopio.
NOTA: La porción densa en mitocondrias no contendrá lípidos, que aparecen como la porción más oscura del ovocito después de la centrifugación. - Coloque la punta de la microcuchilla a la izquierda del ovocito superior, en línea con el espacio directamente sobre la porción densa en mitocondrias. Manteniendo la punta de la cuchilla en el mismo lugar, baje cuidadosamente la cuchilla para cortar todo el camino a través del ovocito.
- Asegúrese de que el ooplasto denso en mitocondrias y el ooplasto reducido en mitocondrias sean similares en tamaño; la bisección debe cortar cada ovocito por la mitad para producir dos ooplastos.
NOTA: Los tamaños comparativos de los ooplastos producidos a partir de un solo ovocito pueden variar según los objetivos de la investigación; si los ooplastos reducidos en mitocondrias se van a fusionar con una célula somática, su volumen debe ser mayor que el de los ooplastos densos en mitocondrias». - Asegúrese de que la cuchilla esté dividiendo el ovocito por encima de la porción densa en mitocondrias y por debajo de la porción densa en lípidos, en el segmento más claro del ovocito centrifugado.
- Asegúrese de que el ooplasto denso en mitocondrias y el ooplasto reducido en mitocondrias sean similares en tamaño; la bisección debe cortar cada ovocito por la mitad para producir dos ooplastos.
- Al levantar la cuchilla, asegúrese de que se mantenga la misma línea y que la punta de la cuchilla permanezca en el mismo lugar, luego levante suavemente la punta de la placa.
- Repita los pasos de bisección para todos los ovocitos dentro de la primera gota de bisección. Si los ovocitos están presentes en gotas adicionales, oriente y bisecle los ovocitos restantes.
- Usando una pipeta bucal, recolecte ooplastos reducidos en mitocondrias de la primera gota de bisección. Colóquelos en la gota T20 de la mano izquierda ubicada en la fila inferior de la placa. Repita para todas las gotas de bisección restantes.
NOTA: Los ooplastos reducidos en mitocondrias contendrán lípidos, que son de color más oscuro que el resto del ovocito. - Usando una pipeta bucal, recolecte ooplastos densos en mitocondrias de la primera gota de bisección. Colóquelos en la gota T20 derecha ubicada en la fila inferior de la placa. Repita para todas las gotas de bisección restantes.
NOTA: Las regiones densas en mitocondrias tendrán un conglomerado visible de orgánulos que será de color gris claro en apariencia. - Recupere el plato de cuatro pocillos T10 de la incubadora. Usando una pipeta bucal, mueva todos los ooplastos reducidos en mitocondrias a la "RM" bien etiquetada y mueva los ooplastos densos en mitocondrias a la bien etiquetada "M".
- Vuelva a colocar la placa de cuatro pocillos en la incubadora controlada por CO2. Permita que los ooplastos descansen durante al menos 30 minutos antes de la cuantificación del ADNmt.
6. Cuantificación del ADNmt
- Utilice un kit de extracción de ADN diseñado para extraer material de una pequeña muestra para extraer ADN de muestras individuales (ovocitos individuales, ooplastos densos en mitocondrias individuales, ooplastos agotados de mitocondrias individuales).
- Utilice un método de cuantificación de ADN de la elección para asegurarse de que el ADN se extrajo con éxito de cada muestra. Si la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) no se completa en ese momento, congele el ADN extraído en un tubo marcado en un congelador de -80 °C.
- Realizar qPCR
- Consulte la Tabla 2 para determinar el volumen de cada reactivo que se agregará a cada tubo de qPCR, junto con las secuencias de imprimación. Estos cebadores están diseñados para amplificar la región 12S del ADNmt bovino.
- Establezca el tiempo de desnaturalización inicial durante 10 min, seguido de 35 ciclos de: 30 s de desnaturalización a 94 °C, 15 s de recocido a 60 °C y 15 s de extensión a 72 °C. Cuando se complete la reacción, registre los valores del umbral de ciclo (Ct).
NOTA: Para obtener valores relativos de número de copia de ADNmt, se debe producir una curva estándar utilizando muestras con cantidades conocidas de números de copia de ADNmt, que aumentan exponencialmente. Los valores umbral del ciclo deben manipularse utilizando las siguientes fórmulas para determinar los números de copia relativos del ADNmt. - Obtenga la concentración del ADN utilizando la siguiente ecuación:
Concentración de ADN = (10(Ct-intercept/slope)) x volumen probado - Obtenga el número de copia utilizando la siguiente ecuación:
Número de copia =
- Obtenga el número de copia utilizando la siguiente ecuación:
Número de copia por celda = 2 x
Figura 5: Curva estándar de ADNmt de células somáticas. Esta curva estándar se creó a través de la cuantificación del ADNmt de las concentraciones logarítmicas de células somáticas bovinas utilizando los reactivos y el programa qPCR como se describe en el paso 6.3 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Los resultados cuantitativos de la PCR (qPCR) se utilizan para determinar las cantidades relativas de ADNmt presentes en cada ooplasto. La reacción descrita está diseñada para amplificar la región 12S del ADNmt bovino.
Si la bisección fue exitosa, las muestras de ovocitos enteros y ooplastos densos en mitocondrias tendrán valores similares de Ct . Las muestras de ooplastos reducidos en mitocondrias tendrán valores más altos de Ct en comparación con las muestras de los otros dos grupos. A continuación se muestra un gráfico Ct que muestra los resultados exitosos de la bisección. Estos resultados indican que la bisección redujo efectivamente el contenido de ADNmt en los ooplastos reducidos por mitocondrias (Figura 6).
Figura 6: Resultados exitosos de la qPCR de bisección. El gráfico que compara el número de ciclo y la fluorescencia muestra los valores umbral del ciclo de ovocitos individuales, ooplastos reducidos en mitocondrias (representados por líneas púrpuras) y ooplastos densos en mitocondrias. Los valores de Ct de los ooplastos reducidos por mitocondrias tienen un promedio de 29.931 (líneas púrpuras), mientras que el valor promedio de Ct de los ovocitos individuales es de 20.802 (líneas rojas y verdes), y el valor promedio de Ct de los ooplastos densos en mitocondrias es de 21.389 (líneas azules y doradas). El aumento de los valores de Ct de las muestras de ooplasto reducidas por mitocondrias indica una disminución en el número de copias de ADNmt dentro de estas muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En la Figura 7 se muestra un gráfico Ct que muestra resultados de bisección fallidos. Estos resultados indican que la bisección no redujo efectivamente el contenido de ADNmt en los ooplastos reducidos en mitocondrias:
Figura 7: Resultados fallidos de la qPCR de bisección. El gráfico de líneas que compara el número de ciclo y la fluorescencia muestra los valores umbral del ciclo de ovocitos individuales (líneas verde oscuro y verde claro), ooplastos reducidos por mitocondrias (líneas púrpuras) y ooplastos densos en mitocondrias (líneas azul y dorada), todos los cuales tienen valores de Ct dentro del rango de 20.232-20.757. Esto indica la ausencia de un cambio significativo en el número de copias de ADNmt en las muestras de ooplastos reducidos por mitocondrias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tras la producción de una curva estándar y el uso de las fórmulas de número de copias de ADNmt proporcionadas, se ha logrado una reducción promedio del ADNmt de ovocitos del 93,88% utilizando este protocolo (Figura 8).
Figura 8: Diagrama de caja que compara el número relativo de copias de ADN mitocondrial obtenido de ovocitos enteros, ooplastos reducidos en mitocondrias y ooplastos densos en mitocondrias. Ovocitos enteros (n = 38), ooplastos reducidos en mitocondrias (n = 34) y ooplastos densos en mitocondrias (n = 29). Los ooplastos reducidos por mitocondrias tienen significativamente menos números de copias en comparación con los otros dos grupos (P < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Volumen total | Solvente | Soluto |
| Solución de hialuronidasa | 400 μL | 1 mL M-199 | 0,6 mg de hialuronidasa |
| Medios T2 | 500 μL | M-199 | Suero bovino fetal al 2% (v/v) |
| Medios T20 | 1020 μL | M-199 | Suero bovino fetal al 20% (v/v) |
| Medios T10 | 800 μL | 400 μL T2 | 400 μL T20 |
| CB/HSOF | 500 μL | 499,5 μL de líquido oviductal sintético con HEPES (HSOF) | 0,5 μL de 10 mg/ml de citocalasina B (CB) |
| Solución Pronase | 40 μL | 1 mL M-199 | 10 mg de pronasa |
| T20/CB | 500 μL | 499,5 μL T20 | 0,5 μL de 10 mg/ml cb |
Tabla 1: Soluciones requeridas. Proporciona volúmenes de solutos y disolventes para cada solución requerida dentro del protocolo.
| Reactivo | Volumen |
| Mezcla maestra de qPCR | 10 μL |
| Imprimación delantera | 0,6 μL |
| Imprimación inversa | 0,6 μL |
| Muestra de ADN | 4,4 μL |
| Agua libre de DNasa | 4,4 μL |
| Volumen total | 20 μL |
| Cartilla delantera GGGCTACATTCTCTACACAAG | |
| Imprimación inversa GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | |
Tabla 2: Composición cuantitativa de la PCR. Proporciona secuencias de imprimación hacia adelante y hacia atrás y volúmenes de todos los reactivos necesarios para cada tubo de PCR cuantitativo.
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Discussion
Los métodos utilizados anteriormente para disminuir el número de copias de ADNmt en ovocitos tienen sus respectivas desventajas. La eliminación basada en la micromanipulación de las mitocondrias de los ovocitos disminuye el número de copias de ADNmt en un promedio del 64%27. Un método único, utilizado anteriormente para la enucleación, implica el uso de pipetas Pasteur de pequeño diámetro y la división de un ovocito libre de pellúcidas en el borde entre una microgota de medio y el aceite mineral circundante. Junto con la utilización de la centrifugación de ovocitos, este enfoque podría producir ooplastos viables reducidos en mitocondrias28. Sin embargo, aún no se ha informado que la combinación de centrifugación y este método de división de ovocitos produzca embriones. Los métodos químicos de reducción de mitocondrias (como la exposición de ovocitos a 2′,3′-didesoxicitidina (ddC), un inhibidor de la síntesis de ADNmt) han reducido el número de copias de ADNmt de ovocitos hasta en un 50% y requieren que los AOC estén expuestos a la sustancia química durante más de 40 h durante la maduración in vitro (MIV)16,27. Aunque la incubación de ovocitos porcinos en un medio suplementado con ddC durante 40 h no ha presentado problemas para los embriones reconstruidos16, aún no hay datos publicados sobre la exposición de ovocitos bovinos a ddC durante su IVM de 20-22 h o cualquier desarrollo embrionario posterior. El método descrito en este trabajo reduce el número relativo de copias de ADNmt en aproximadamente un 93,88%, de un promedio de 45.565 ± 37.169 copias (media ± DE) a 8.396 ± 13.287.
Varios pasos dentro del protocolo son críticos para obtener resultados satisfactorios en términos de reducir efectivamente el número de copias de ADN mitocondrial (ADNmt) de un ovocito. Centrifugar los ovocitos a la velocidad optimizada (15.000 x g) y el tiempo (12 min) creará una fracción mitocondrial más concentrada en un polo de cada ovocito. El volumen correcto de citochalasina B/líquido oviductal sintético con solución HEPES (CB/HSOF) (50 μL) probablemente eliminará la lisis de ovocitos debido a la centrifugación. Después de la centrifugación, la zona pelúcida (ZP) se elimina mediante la exposición a una solución de pronasa; La eliminación completa de la ZP asegurará una bisección más precisa y también debe separar las células cúmulos restantes de los ovocitos. El uso de una etapa de calentamiento en el microscopio mientras se retira el ZP es opcional, pero acelera la eliminación del ZP en al menos 1 minuto. La orientación de los ovocitos libres de zona pelúcida (ZF) en gotas de bisección es fundamental para dividirlos con precisión. La fracción mitocondrial, que se encuentra en un polo de cada ovocito, debe ser claramente visible y estar ubicada en la parte superior o inferior del ovocito antes de la bisección. El polo opuesto contendrá gotas de lípidos oscuros. Después de la bisección, la selección y la clasificación correcta de los ooplastos (como mitocondrias densas o agotadas de mitocondrias) es crucial para obtener una evaluación precisa de la bisección. También es importante seleccionar qué ovocitos de Metafase II (MII) dividir. Asegurarse de que los ovocitos utilizados sean esféricos y tengan un citoplasma homogéneo probablemente marcará una diferencia en el número de copias de ADNmt contenidos en cada ovocito y ooplasto. Al diseñar y sintetizar reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) individuales, es importante garantizar que se utilicen los cebadores y las concentraciones correctas de reactivos en cada reacción para obtener resultados precisos. Si se produce una curva estándar, debe crearse con la mayor precisión posible, y todas las reacciones deben realizarse por triplicado para lograr una mayor precisión. Los tiempos y temperaturas de cada fase de qPCR deben seguir siendo los mismos para cada carrera.
Algunos problemas pueden surgir al seguir el protocolo. Al agregar aceite a la placa de bisección, asegúrese de que las gotas estén cubiertas; demasiado aceite hará que el uso de la pipeta sea menos eficiente, mientras que muy poco conducirá a la evaporación de las gotas. Esta evaporación provocaría un cambio en la osmolaridad de las soluciones, lo que puede ser perjudicial para los ovocitos y ooplastos. Si los ovocitos se lisan después de la digestión de la ZP, esto probablemente se deba a uno o ambos de los siguientes, según la experiencia personal y la observación: los ovocitos no se centrifugaron durante el tiempo y la velocidad prescritos, y / o los ovocitos se expusieron a la pronasa durante demasiado tiempo. Es posible que algunos ovocitos ZF no recuperen una forma completamente esférica dentro de las gotas de bisección. Tenga en cuenta que no todos los ovocitos ZF podrán colocarse de manera óptima para la bisección. En este caso, hay tres opciones: dar a los ovocitos ZF tiempo adicional para recuperar una forma esférica; sostenga suavemente los ovocitos en una posición más vertical con la microcuchilla antes de la bisección; no bisecto ovocitos que no puedan colocarse correctamente. Determinar qué ooplastos son densos en mitocondrias o agotados después de la bisección afectará los resultados de cuantificación. Si la clasificación de los ooplastos es difícil, coloque los ovocitos que se dividirán en dos para que la fracción mitocondrial siempre apunte hacia la parte superior o inferior de la gota, y / o busque una porción oscura del ovocito en uno de sus polos (estas gotas de lípidos se concentran en el polo opuesto de la fracción mitocondrial). A veces, los ooplastos pueden adherirse entre sí y / o la hendidura hecha por la microcuchilla en la placa. A veces, proporcionar a los ooplastos tiempo adicional para recuperar una forma esférica ayudará con la separación. Otras opciones incluyen golpear suavemente la placa, succionarlas suavemente dentro y fuera de la pipeta y / o usar el borde de la pipeta para separar suavemente los ooplastos.
Este método de reducción del número de copias de ADNmt tiene sus limitaciones; uno se basa en la fuente de ovocitos, y el otro se debe a la eliminación de la ZP del ovocito. La fuente de ovocitos (el animal en sí, el ovario específico y el folículo específico) influirá en gran medida en el número de copias de ADNmt dentro de ese ovocito específico. Hay una gran desviación estándar alrededor del número promedio de copias de ADNmt de un solo ovocito, lo que indica cuán variable puede ser el número de copias. Se requieren muchas reacciones de cuantificación de ovocitos individuales para tener un número de copia estándar robusto de un solo ovocito que se comparará con los ooplastos y otros ovocitos. La desviación estándar considerable también hace que la comparación del ooplasto con el ovocito sea menos absoluta, ya que el número de copias del ooplasto no se puede comparar con su ovocito de origen.
La digestión de la zonae pellucidae del ovocito hace que el ovocito ZF resultante y los ooplastos sean mucho más frágiles de lo que eran antes de la eliminación de sus zonae pellucidae. Esta fragilidad conduce a mayores tasas de lisis de los ooplastos y los propios ovocitos ZF, particularmente con el uso de una microcuchilla: se debe usar una gran cantidad de cuidado y precisión. Si los ooplastos se utilizan para la fusión, requieren reposo después de la bisección antes de que se pueda intentar la fusión. De lo contrario, muchos de los ooplastos probablemente se lisarán. Los ooplastos agotados por las mitocondrias tienden a ser más delicados que sus contrapartes densas en mitocondrias. Los microtúbulos del ovocito tienden a migrar con las mitocondrias al mismo polo del ovocito durante la centrifugación, lo que deja a los ooplastos agotados por las mitocondrias con menos componentes estructurales29. Se requiere investigación adicional y tinción para determinar si otros orgánulos de ovocitos se ven afectados negativamente por la combinación de centrifugación y bisección utilizada para producir ooplastos en este protocolo.
La reducción de las mitocondrias de ovocitos reduciría las mitocondrias de la especie de ovocitos en un embrión iSCNT resultante, disminuyendo así la incidencia de heteroplasmia mitocondrial en ese embrión reconstruido. Las posibilidades de desarrollo del embrión aumentarían comparativamente, pero probablemente requerirían la suplementación de mitocondrias de las especies de células donantes para satisfacer los requisitos de energía durante el desarrollo. Hasta ahora, los intentos de iSCNT que han utilizado cruces intergenéricos no han producido descendencia viva. La disminución de la heteroplasmia en embriones iSCNT puede aumentar la probabilidad de embarazos exitosos. iSCNT es un método que podría ayudar a rescatar algunas de las 40.000 especies clasificadas como30 en peligro de extinción. Dado que las células somáticas de estas especies son típicamente más accesibles que sus células germinales, iSCNT puede utilizar estas células somáticas, junto con ovocitos de especies domésticas. Los intentos intragenéricos han tenido éxito en la producción de animales vivos 31,32,33, aunque las crías son típicamente quiméricas para el ADNmt, y encontrar una fuente de ovocitos intragenéricos no siempre es posible. La bisección de ovocitos con el objetivo de reducir el número de copias de ADNmt, seguida de la fusión de estos ooplastos con una célula somática interespecífica, reduciría el quimerismo y la heteroplasmia en los embriones de iSCNT. Debido a estas reducciones, el uso del método descrito permite un mayor potencial de nacidos vivos intergenéricos y la continuación de especies en peligro de extinción.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a sus colegas de la Universidad Estatal de Utah, a los investigadores de Ciencias Reproductivas del Zoológico de San Diego y a la Dra. Rebecca Krisher de Genus PLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
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