Summary
تصف المقالة بروتوكول إنقاذ الأجنة لتجديد الأجنة غير الناضجة المشتقة من التهجين بين الأنواع من Cucurbita pepo و Cucurbita moschata. يمكن تكرار البروتوكول بسهولة وسيكون موردا مهما لبرامج تربية الاسكواش.
Abstract
التهجين بين الأنواع في محاصيل القرعيات (القرع ) أمر مرغوب فيه لتوسيع التباين الوراثي ولإدخال الأليلات المفيدة. يجب تجديد الأجنة غير الناضجة المتولدة من هذه الصلبان الواسعة باستخدام تقنيات إنقاذ الأجنة المناسبة. على الرغم من أن هذه التقنية راسخة للعديد من المحاصيل ، إلا أنه لا يوجد وصف تفصيلي للمنهجية المناسبة للاسكواش التي تسمح بتطبيقها الروتيني. هنا ، نصف بروتوكول إنقاذ الأجنة المفيد للتهجين بين الأنواع من C. pepo و C . moschata. لتحديد مجموعات قابلة للحياة لإنقاذ الأجنة ، تم إجراء 24 تهجينا بين الأنواع. تم الحصول على مجموعة الفاكهة من اثنين وعشرين صليبا ، مما يشير إلى معدل نجاح 92 ٪. ومع ذلك ، فإن معظم الثمار التي تم الحصول عليها كانت بارثينوكاربك ، مع بذور خالية من الأجنة (بذور فارغة). احتوت مجموعة متقاطعة واحدة فقط على أجنة غير ناضجة يمكن تجديدها باستخدام وسائط نمو النبات القاعدية. تم إنقاذ ما مجموعه 10 أجنة من فاكهة F1 متعددة الأنواع ، وكان معدل نجاح إنقاذ الأجنة 80٪. سيكون بروتوكول إنقاذ الأجنة الذي تم تطويره هنا مفيدا للتهجين بين الأنواع في برامج تربية الاسكواش.
Introduction
القرعيات (2n = 40) هو جنس متنوع للغاية في عائلة القرعيات التي تحتوي على 27 نوعا مختلفا ، خمسة منها مستأنسة1. من بين هؤلاء ، Cucurbita moschata و C. pepo و C. maxima هي الأكثر أهمية من الناحية الاقتصادية في جميع أنحاء العالم. في الولايات المتحدة ، C. moschata و C. pepo هما أهم نوعين في الإنتاج الزراعي. تتكون C. pepo من أربعة أنواع فرعية (ovifera و pepo و fraternal و gumala) تحتوي على مجموعات أصناف القرع الصيفية والشتوية من Crookneck ، و Straightneck ، و Acorn ، و Scallop ، و cocozelle ، ونخاع الخضار ، والكوسة ، واليقطين2،3،4،5. تتكون C. moschata بشكل أساسي من أنواع سوق القرع الشتوي بما في ذلك الجوز وديكنسون ومجموعة الجبن1. النوعان متنوعان شكليا وظاهريا ، حيث يعتبر C. pepo لمحصوله ، وتبكره ، وعادات نمو الأدغال ، وسمات الفاكهة المتنوعة بما في ذلك شكل الفاكهة وحجم الفاكهة ولون اللحم ونمط القشرة. من ناحية أخرى ، تحظى C. moschata بتقدير كبير لتكيفها مع الحرارة والرطوبة ، فضلا عن مقاومة الأمراض والآفات 6,7. التهجين بين الأنواع بين C. moschata و C. pepo ليس فقط استراتيجية مهمة لإدخال الخصائص المرغوبة بين النوعين ، ولكنه يسمح أيضا بتوسيع القاعدة الوراثية في برامج التربية 7,8.
تم إجراء عمليات التهجين المبكرة بين C. moschata و C. pepo لتحديد توافقها و / أو الحواجز التصنيفية9،10،11 ، بينما ركزت الدراسات اللاحقة في الغالب على نقل السمات المرغوبة12،13،14. استهدف التهجين بين الأنواع بين النوعين نقل سمات جديدة مثل عادة نمو الأدغال أو شبه الأدغال وتحسين الغلة من C. pepo جنبا إلى جنب مع مقاومة الأمراض ، والقدرة على التكيف مع الإجهاد اللاأحيائي ، وزيادة النشاط من C. moschata14،15،16. على سبيل المثال ، أدت عمليات التهجين المحددة بين C. pepo (P5) و C. moschata (MO3) إلى زيادة غلة الفاكهة 13 ، في حين تم استخدام مدخلات C. moschata (النيجيرية المحلية ومينينا) على نطاق واسع كمصدر رئيسي لمقاومة فيروسات potyvirus في أصناف C. pepo المزروعة17,18.
أظهرت الدراسات السابقة أن التهجين بين C. moschata و C. pepo ممكن ولكنه صعب 8,15. يمكن أن تؤدي التهجينات بين الأنواع إلى عدم وجود مجموعة فواكه (إجهاض) ، أو ثمار بارثينوكاربك خالية من البذور القابلة للحياة (بذور فارغة) ، أو ثمار خالية من البذور حيث تفشل الأجنة غير الناضجة في النمو (stenospermocarpy) ، أو ثمار بها عدد قليل من الأجنة غير الناضجة التي يمكن إنقاذها في النباتات الناضجة من خلال إنقاذ الأجنة15,16. على سبيل المثال ، لم يتم الحصول على بذور قابلة للحياة عن طريق تهجين C. pepo (ملكة المائدة ، الأم) مع C. moschata (جبن كبير ، أبوي) ، ومع ذلك ، فإن التقاطع المتبادل أنتج 57 بذرة قابلة للحياة من 134 تلقيحا9. حصل Hayase على بذور قابلة للحياة من C. moschata و C. pepo فقط عندما تم صنع الصلبان في الساعة 04:00 صباحا باستخدام حبوب اللقاح المخزنة عند 10 درجات مئوية طوال الليل19. عبر Baggett ثمانية أنواع مختلفة من C. moschata مع C. pepo (delicata) وأفاد أنه من بين 103 تلقيح إجمالي ، تم الحصول على 83 فاكهة بدت طبيعية ، لكن لم يحتوي أي منها على بذور قابلة للحياة8. في تقاطع بين C. pepo (S179) و C. moschata (NK) ، حصل Zhang et al. على 15 فاكهة تحتوي على 2994 بذرة ، لكن 12 فقط من هذه البذور كانت قابلة للحياة بينما أظهر الباقي تطورا بدائيا فقط. تشير هذه الدراسات إلى أنه على الرغم من أن العبور بين الأنواع بين C. moschata و C. pepo مفيد للغاية ، فإن الحصول على ثمار ببذور قابلة للحياة من الصلبان يتطلب16.
تم اقتراح إنقاذ الأجنة كطريقة مناسبة للتغلب على المشاكل الناشئة عن الإجهاض المبكر أو الأجنة ضعيفة النمو وهي واحدة من أقدم وأنجح تقنيات الزراعة في المختبر لتجديد الأجنة غير الناضجة16،20. يتضمن إنقاذ الأجنة الزراعة في المختبر للأجنة المتخلفة / غير الناضجة متبوعة بالنقل إلى وسط مغذي معقم لتسهيل استعادة الشتلات والنباتات الناضجة في النهاية21. على الرغم من أن إنقاذ الأجنة يستخدم بشكل شائع في تربية الاسكواش ، إلا أنه لا يوجد وصف تفصيلي للمنهجية المناسبة التي تسمح بتطبيقه الروتيني. تم الإبلاغ عن استخدام تقنية إنقاذ الأجنة للتغلب على حواجز التهجين بين الأنواع في أنواع القرعيات في وقت مبكر من عام 195422. ومع ذلك ، كان نجاح إنقاذ الأجنة في الدراسات المبكرة إما غير مبلغ عنه أو منخفضا جدا. أبلغ متولي وآخرون عن معدل نجاح بنسبة 10٪ (التجدد إلى نباتات ناضجة) بين 100 جنين هجين متعدد الأنواع تم إنقاذه من تقاطع بين C. pepo و C. martinezii23. أبلغ Sisko et al. عن معدل نجاح متغير لتجديد الأجنة بين الأجنة التي تم الحصول عليها من مجموعات متقاطعة مختلفة: كان معدل تجديد الهجينة التي تم الحصول عليها عن طريق عبور C. maxima (Bos. Max) و C. pepo (Gold Rush) 15.5٪ ، ل C. pepo (Zucchini) و C. moschata (Hokaido) كان 20٪ ، بينما بالنسبة ل C. pepo (Gold Rush) و C. moschata (Dolga) كان 37.5٪ 24. بالإضافة إلى النمط الوراثي ، تعد الوسائط وظروف الثقافة في المختبر من العوامل المهمة لنجاح التقنية25,26. في الدراسة الحالية ، تم اختبار مجموعات متقاطعة مختلفة بين C. moschata و C. pepo ، وتم تطوير منهجية بسيطة لاستخدام تقنية إنقاذ الأجنة في الاسكواش. إن تطوير تقنية إنقاذ أجنة بسيطة وقابلة للتكرار بسهولة سيسهل التهجين بين الأنواع وتعزيز الأصول الوراثية في برامج تربية الاسكواش.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الزراعة والتلقيح
ملاحظة: من المهم تحديد الأنماط الجينية المتوافقة التي سيؤدي تهجينها إلى تكوين ثمار وإنتاج أجنة قابلة للحياة.
- ظروف الزراعة والصيانة
- الحصول على بذور الطرز الوراثية للقرع (الأصناف / المدخلات) للتهجين (الجدول 1).
- املأ 50 خلية من شقق البدء (عرض 25 سم × طول 50 سم) بوسط تأصيص معدل بسماد NPK كامل يحتوي على 1.38 جم / كجم N و 1.38 جم / كجم P و 1.38 جم / كجم K.
- زرع البذور على عمق يساوي طولها وتغطيتها مع وسط تأصيص. سقي الشقق دون خلق مياه راكدة. بعد ذلك ، حافظ على رطوبة الوسائط عن طريق سقيها يدويا مرة واحدة يوميا.
- في المرحلة الثانية من الأوراق الحقيقية ، قم بزرع الشتلات في أواني قطرها 25 سم إلى 30 سم معدلة بسماد NPK كامل بمعدل 3 ملاعق كبيرة / وعاء. قم بتسميد النباتات مرة واحدة في الأسبوع باستخدام 500 مل / وعاء من السماد السائل الذي يحتوي على NPK 20:20:20 مضافا إلى تركيز 1 جم لكل جالون من الماء.
- الحفاظ على النباتات في الدفيئة في درجات حرارة تتراوح بين 22-28 درجة مئوية تحت نظام الضوء الطبيعي. بالنسبة للأنماط الجينية للكرمة ، قم بتوفير تعريشة داعمة في الدفيئة (الشكل 1).
- إجراء التلقيح
- عادة ، يبدأ الإزهار في القرع من 6 إلى 8 أسابيع من البذر اعتمادا على الصنف (الشكل 2 أ ، ب). ابدأ في التهجين المتحكم فيه (الصلبان) بمجرد أن تبدأ النباتات في الإزهار. في ظل ظروف الاحتباس الحراري ، يمكن إجراء التلقيح على مدار السنة.
- حدد أزهار الذكور والإناث من أصناف C. pepo و C. moschata التي ستكون جاهزة للتلقيح في اليوم التالي. للتعرف على هذه الزهور ، تحقق من الزهور التي يكون لبتلاتها لون أصفر ولكنها ليست مفتوحة. قم بلصق الزهور برفق من الأعلى باستخدام شريط لاصق لمنع التلقيح العرضي للحشرات (الشكل 2C ، D).
- في صباح اليوم التالي ، تكون الأزهار جاهزة للتلقيح. قم بإجراء التلقيح قبل الساعة 10:00 صباحا لتحسين معدل نجاح التهجين27.
- افتح أزهار الإناث والذكور عن طريق إزالة الجزء العلوي المسجل من البتلات برفق. قم بإزالة البتلات من الزهرة الذكرية وانقل حبوب اللقاح عن طريق فرك العضو الآخر برفق على وصمة الزهرة الأنثوية (الشكل 3 أ).
- بعد التلقيح ، أغلق الزهرة الأنثوية الملقحة على الفور بشريط لاصق. استخدم علامة لتسجيل تاريخ التلقيح وللإشارة إلى الوالدين من الأب والأم المستخدمة في الصليب (الشكل 3 ب).
- يشار إلى الصليب الناجح بواسطة مبيض موسع يشكل بسرعة فاكهة صغيرة في غضون 1 أسبوع (الشكل 4 أ). ثم يصبح النبات جاهزا للحصاد بعد 45-55 يوما من التلقيح28 (الشكل 4 ب).
2. تقنية إنقاذ الأجنة
- التحضير لوسائط الإعلام
- تحضير مخزون المضادات الحيوية: بالنسبة للسيفوتاكسيم (ملح الصوديوم) ، قم بإذابة المضاد الحيوي في 4 مل من الماء منزوع الأيونات أو المقطر ، وقم بالتصفية من خلال مرشح حقنة معقم 0.22 ميكرومتر ، وقم بعمل 0.5 مل من القسمة الغذائية. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. سيكون تركيز محلول المخزون الناتج 250 مجم / مل.
- بالنسبة للأمبيسيلين (ملح الصوديوم) ، قم بإذابة المسحوق في 10 مل من الماء ، وقم بالتصفية من خلال مرشح حقنة معقم 0.22 ميكرومتر ، والقسمة في مخزون 1 مل بتركيز نهائي 100 مجم / مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- اجعل موراشيج وسكوج (MS) وسطا عن طريق إذابة 2.45 جم من الوسط (تركيز 4.91 جم / لتر) في 500 مل من الماء المقطر في زجاجة سعة 1 لتر. أضف 1.5 جم من صمغ الجلان والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. يذوب صمغ جيلان تماما أثناء التعقيم.
- بعد التعقيم ، قم بتبريد الوسط عن طريق وضع الزجاجة في حمام مائي عند 50 درجة مئوية. قم بإزالة مخزون المضادات الحيوية من الفريزر وقم بإذابتها في خزانة التدفق الصفحي.
- انقل الزجاجة المتوسطة إلى غطاء التدفق الصفحي. أضف 0.6 مل من محلول مخزون سيفوتاكسيم (250 مجم / مل) و 0.25 مل من مخزون الأمبيسيلين (100 مجم / مل) إلى الزجاجة المتوسطة واخلطها جيدا. صب حوالي 7 مل من الوسط في طبق بتري معقم (60 مم × 15 مم).
- اترك الوسط يتجمد في أطباق بتري لمدة 15-20 دقيقة تقريبا. أغلق أطباق بتري بغلاف مانع للتسرب وضعها في صندوق تخزين. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
- إنقاذ الأجنة
- قبل البدء ، قم بتنظيف وتعقيم خزانة تدفق الهواء الصفحي بنسبة 70٪ كحول إيثيلي.
- احصد ثمار القرع عن طريق كسرها / قطعها من الكرمة الرئيسية وتطهير سطح الفاكهة عن طريق الغسيل بمنظف سائل (على سبيل المثال ، 0.3٪ كلوروكسيلينول) في حوض المختبر حتى تتم إزالة جميع الأوساخ السائبة (الشكل 5 أ).
- شطف مع الكثير من ماء الصنبور. جفف الفاكهة بمناشف ورقية نظيفة. انقل الفاكهة إلى خزانة تدفق الهواء الصفحي (الشكل 5 ب).
- تعقيم السطح الفاكهة عن طريق رش 70 ٪ من الإيثانول على الفاكهة في خزانة تدفق الهواء الصفحي المعقمة. قم بتقسيم الفاكهة بسكين معقم (الشكل 5 ج) واستخرج البذور.
- استخدم ملقط معقم لفتح طبقة البذور بشكل معقم وكشف الأجنة غير الناضجة (الشكل 6). ضع الأجنة غير الناضجة بعناية في طبق بتري يحتوي على وسط MS مكمل بالسيفوتاكسيم والأمبيسلين (الشكل 7 أ). أغلق طبق بتري وأغلقه بفيلم التفاف.
ملاحظة: اعتمادا على حجم الجنين ، من الممكن وضع خمسة أو ستة أجنة في طبق بتري. - ضع أطباق بتري المختومة مع الأجنة في غرفة نمو أقل من 16 ساعة ضوئية عند 25 درجة مئوية ورطوبة نسبية 70٪. في حالة حدوث تلوث ، قم على الفور بزراعة الأجنة غير الملوثة في صفيحة جديدة بنفس الوسيط.
- ستبدأ الفلقات في التوسع بعد 4 أيام وستتحول إلى اللون الأخضر في غضون 10 أيام (الشكل 7 ب). في هذه المرحلة ، إذا لزم الأمر ، قم بإجراء الاستزراع الفرعي في ألواح جديدة تحتوي على نفس الوسط للسماح بتوسيع الأنسجة. ستبدأ الجذور في الظهور في 14 يوما (الشكل 7 ج) ، وفي 21 يوما سيكون للنباتات جذور ممتدة وفلقات (الشكل 7 د).
ملاحظة: وسط الاستزراع المستخدم في البروتوكول مناسب للتمايز إلى براعم وجذور بدون منظمات نمو تكميلية. - في هذه المرحلة ، قم بإزالة النباتات من أطباق بتري واغسل الوسائط برفق من الجذور بماء الصنبور (الشكل 8). ضع النباتات في وعاء بلاستيكي (14 سم × 9 سم × 4 سم) وقم بتغطية الجذور بمناشف ورقية مبللة (الشكل 9 أ). قم بتغطية الحاوية وإعادة ترطيب المناشف الورقية حسب الضرورة.
- احتفظ بالحاويات في درجة حرارة الغرفة (25-28 درجة مئوية) وبفترة ضوئية 16 ساعة. هذه الخطوة سوف تتأقلم مع النباتات. بعد التأقلم لمدة 7-10 أيام في الحاوية ، سيكون طول الشتلات حوالي 3-4 في الطول. خلال هذه الفترة ، أعد ترطيب المناشف الورقية حسب الحاجة.
- انقل الشتلات إلى 50 خلية بداية مسطحة (عرض 25 سم × طول 50 سم) معدلة بالأسمدة كما هو موضح سابقا وانقلها إلى الدفيئة (الشكل 9 ب). لا تفرط في سقي الشتلات لتجنب التعفن ؛ أضف ما يقرب من 10-20 مل لكل خلية حسب الحاجة.
- في المرحلة الثانية إلى الثالثة من الأوراق الحقيقية ، ازرع الشتلات في أواني قطرها 30 سم مملوءة بوسط تأصيص معدل بالأسمدة كما هو موضح سابقا (الشكل 10 أ). توفير دعم تعريشة لنباتات الكرمة وإجراء تهجين متحكم فيه عندما تبدأ النباتات في الإزهار ، كما هو موضح سابقا (الشكل 10 ب).
- الحفاظ على النباتات في الدفيئة في درجات حرارة تتراوح بين 22-28 درجة مئوية تحت نظام الضوء الطبيعي. تقييم النباتات لخصائص الفاكهة والبذور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مجموعة الفاكهة وصلاحية البذور
تم إجراء اختبار أولي لتحديد مجموعة الفاكهة وصلاحية البذور في مجموعة متنوعة من التركيبات المتقاطعة. تم اختيار ما مجموعه 15 نمطا وراثيا للقرع ، أربعة C . pepo و 11 C. moschata ، (الجدول 1). من بين 24 مجموعة متقاطعة بين الأنواع تمت تجربتها ، تم الحصول على مجموعة فواكه ل 22 (الجدول 2) ، وهو ما يمثل نجاحا إجماليا بنسبة >92٪ في مجموعة الفاكهة. لم يتم الحصول على ثمار ناضجة عن طريق عبور O و M و E و J ، بينما تم الحصول على أكبر عدد من الثمار (n = 6) عن طريق عبور F و J (الجدول 2). تراوح عدد الأزهار الملقحة لمجموعات متقاطعة مختلفة من واحد إلى 11 ، وتراوح معدل نجاح التلقيح من 0٪ إلى 100٪. اختلف عدد الأزهار الملقحة في مجموعات متقاطعة مختلفة اعتمادا على عدد مجموعات الزهور وتزامن الإزهار بين أزهار الذكور والإناث. على الرغم من الحصول على الثمار من جميع الصلبان باستثناء اثنتين ، إلا أن تقييم الثمار بعد قطعها كشف أن معظم الثمار قد أجهضت أجنة بدون بذور قابلة للحياة. بدت ثمار معظم الصلبان طبيعية ولكنها كانت خالية من البذور أو تتكون من بذور ذات أجنة بدائية. تم إنتاج ما مجموعه 44 فاكهة من جميع المجموعات المتقاطعة ، وكانت فاكهة واحدة فقط ، تم تطويرها عن طريق التهجين C و J ، تحتوي على أجنة ضعيفة النمو يمكن استعادتها من خلال تقنية إنقاذ الأجنة.
إنقاذ الأجنة والمزيد من التقدم
كان الهجين بين الأنواعF1 الذي تم تطويره عن طريق العبور C و J يحتوي على 44 بذرة في المجموع ، ولكن 10 منها فقط لديها أجنة يمكن إنقاذها من أجل تقدم الأجيال. البذور المتبقية لم يكن لها أجنة. تم زراعة جميع الأجنة ال 10 في وسائط إنقاذ الأجنة وفحصها يوميا للتأكد من نموها وتطورها. تراوح حجم الأجنة ال 10 غير الناضجة من 3.51 ملم إلى 8.26 ملم. كان معدل نجاح إنقاذ الأجنة 80٪. احتوت الهجينة بين الأنواع F 1 (خطوط الجسر) التي تم تطويرها عن طريق عبور C. moschata و C. pepo (C و J) على جينومات كلا النوعين بنسبة 1:1 (50٪ لكل منهما). تم استخدام هذه النباتات كخطوط جسر لإدخال السمات المهمة اقتصاديا عبر النوعين. على سبيل المثال ، سيؤدي عبور خطوط الجسر هذه مع C. moschata إلى هجين بنسبة 75٪ C. moschata و 25٪ C. pepo الخلفية الوراثية ، على التوالي. كانت الثمار التي تم الحصول عليها من خطوط الجسور هذه تحتوي على مزيج من البذور والبذور غير القابلة للحياة مع الأجنة غير الناضجة التي تطلبت لاحقا زراعة الأنسجة للتجديد. على سبيل المثال ، كانت إحدى الثمار تحتوي على إجمالي 54 بذرة ، من بينها 14 بذرة بها أجنة غير ناضجة تم إنقاذها باستخدام البروتوكول الموصوف هنا.
الشكل 1: تعريشة داعمة لنباتات القرع التي تنمو رأسيا في الدفيئة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: رسم توضيحي للزهور المفتوحة والمسجلة. افتح (أ) ذكر و (ب) أنثى زهرة القرع في الدفيئة. (ج) زهرة ذكر مسجلة من والد الأب Cucurbita moschata . (د) زهرة أنثوية مسجلة من والد الأم Cucurbita pepo . الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: صورة توضيحية للتلقيح. أ: انقل حبوب اللقاح من الزهرة الذكرية عن طريق فرك العضو الآخر برفق على وصمة الزهرة الأنثوية. (ب) بعد التلقيح، ألصق الزهرة الأنثوية واستخدم علامة لتسجيل تاريخ التلقيح والوالدين من الأب والأم المستخدمين في الصليب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: مجموعة الفاكهة . (أ) بعد التلقيح ، سوف يتوسع المبيض بسرعة ، مكونا فاكهة صغيرة في غضون 1 أسبوع. (ب) تكون الثمرة جاهزة للحصاد بعد 45 يوما من التلقيح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تحضير الفاكهة. أ: اغسل الفاكهة بمنظف. حصاد وتطهير سطح الفاكهة عن طريق غسلها بمنظف سائل في حوض المختبر. (ب) شطف الفاكهة وتجفيفها. جفف الفاكهة بمناشف ورقية نظيفة ، بعد شطفها بماء صنبور وافر ، وانقلها إلى خزانة تدفق الهواء الصفائحي. (ج) قم بتقسيم الفاكهة إلى شطرين بسكين معقم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: استخراج الجنين من البذور. استخدم ملقط معقم لفتح طبقة البذور بشكل معقم وكشف الجنين غير الناضج. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: تجديد الأجنة في وسط مرض التصلب العصبي المتعدد. (أ) ضع الأجنة غير الناضجة بعناية في طبق بتري يحتوي على وسط مرض التصلب العصبي المتعدد. (ب) تتمدد الفلقات وتصبح خضراء في غضون ١٠ أيام. (ج) تبدأ الجذور في الظهور بعد ١٤ يوما. (د) في 21 يوما، يكون للنباتات جذور ممتدة وفلقات جاهزة للنقل إلى وعاء بلاستيكي للتأقلم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: اغسل الجذور. قم بإزالة النباتات من أطباق بتري واغسل الوسائط برفق من الجذور بماء الصنبور. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 9: تأقلم النباتات . (أ) ضع النباتات في وعاء بلاستيكي وقم بتغطية الجذور بمنشفة ورقية مبللة لمدة 5 أيام للتأقلم معها. (ب) انقل النباتات إلى صواني خلايا تحتوي على مزيج تأصيص تجاري معدل بأسمدة NPK كاملة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 10: زرع الشتلات في أواني. (أ) في المرحلة الثانية إلى الثالثة من الأوراق الحقيقية ، ازرع الشتلات في أواني قطرها 30 سم مملوءة بوسط تأصيص معدل بالأسمدة. (ب) توفير دعامة تعريشة لنباتات الكرمة وإجراء تهجين متحكم فيه عندما تبدأ النباتات في الإزهار. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| كود المختبر | جنس | مصدر |
| A | جيم - موشاتا | سوق المزارعين المحليين |
| B | جيم - موشاتا | سوق المزارعين المحليين |
| C | جيم - موشاتا | سوق المزارعين المحليين |
| D | جيم - موشاتا | سوق المزارعين المحليين |
| E | جيم - موشاتا | سوق المزارعين المحليين |
| F | جيم - موشاتا | سوق المزارعين المحليين |
| G | جيم - موشاتا | خط تربية جامعة فلوريدا |
| H | جيم - موشاتا | خط تربية جامعة فلوريدا |
| أنا | ك. بيبو | NCRPIS (محطة إدخال النباتات الإقليمية الشمالية الوسطى) |
| J | ك. بيبو | NCRPIS (محطة إدخال النباتات الإقليمية الشمالية الوسطى) |
| M | ك. بيبو | NCRPIS (محطة إدخال النباتات الإقليمية الشمالية الوسطى) |
| O | جيم - موشاتا | خط تربية جامعة فلوريدا |
| Q | جيم - موشاتا | خط تربية جامعة فلوريدا |
| W | ك. بيبو | خط تربية جامعة فلوريدا |
| Y | جيم - موشاتا | شركة بيربي للبذور |
الجدول 1: تم استخدام ما مجموعه 15 نمطا وراثيا من القرع ، أربعة C. pepo و 11 C. moschata ، في الدراسة للتهجينات بين الأنواع.
| الصليب (أنثى × ذكر) | N. من الزهور الملقحة | ن. من الفواكه | مجموعة الفاكهة (٪) | N. من البذور المجهضة | N. من الأجنة غير الناضجة | N. من الأجنة التي تم إنقاذها | ||
| أ (جيم موشاتا) × أنا (ج. بيبو) | 5 | 4 | 80 | 0 | 0 | 0 | ||
| H (C. moschata) x I (C. pepo) | 2 | 2 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| ب (ج. موشاتا) × ي ي (ج. بيبو) | 2 | 1 | 50 | 0 | 0 | 0 | ||
| C (C. moschata) × J (C. pepo) | 3 | 1 | 33.3 | 44 | 10 | 8 | ||
| E (C. moschata) × J (C. pepo) | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| F (C. moschata) × J (C. pepo) | 11 | 6 | 54.5 | 0 | 0 | 0 | ||
| G (C. moschata) × J (C. pepo) | 2 | 2 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| J (C. بيبو) × H (C. moschata) | 7 | 2 | 28.6 | 0 | 0 | 0 | ||
| J (C. بيبو) x O (C.moschata) | 6 | 1 | 16.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| O (C. moschata) × J (C. pepo) | 6 | 1 | 16.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| س (سي موشاتا) × ي ي (سي بيبو) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| C (C. moschata) × M (C. pepo) | 4 | 3 | 75 | 0 | 0 | 0 | ||
| D (C. moschata) × M (C. pepo) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| F (C. moschata) × M (C. pepo) | 9 | 5 | 55.6 | 0 | 0 | 0 | ||
| G (C. moschata) × M (C. pepo) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| O (C. moschata) × M (C. pepo) | 22 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| س (جيم موشاتا) × م (ج. بيبو) | 2 | 1 | 50 | 0 | 0 | 0 | ||
| F (C. moschata) × W (C. pepo) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| G (C. moschata) × W (C. pepo) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| H (C. moschata) × W (C. pepo) | 2 | 1 | 50 | 0 | 0 | 0 | ||
| O (C. moschata) × W (C. pepo) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Y (C. moschata) × W (C. pepo) | 3 | 2 | 66.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| م (سي بيبو) × إتش (سي موشاتا) | 3 | 2 | 66.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| م (سي بيبو) × س س (سي موشاتا) | 4 | 4 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| مجموع | 44 | 10 | 8 | |||||
الجدول 2: حاولت التوليفات المتقاطعة مع 15 نمطا وراثيا من القرع ومجموعة الفاكهة المقابلة ، وعدد البذور المجهضة ، والأجنة غير الناضجة ، وعمليات إنقاذ الأجنة الناجحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك نوعان من الاختناقات الرئيسية للتهجين الناجح بين الأنواع بين C. moschata و C. pepo: حاجز التوافق المتقاطع ، والذي يتم تحديده من خلال استجابة النمط الجيني لإنتاج أجنة هجينة ، وحواجز ما بعد الإخصاب ، والتي تعيق تطور الأجنة الهجينة إلى البذور الطبيعية. كما تم الإبلاغ عنه سابقا للقرع ، كشف اختبار التوافق المتقاطع في الدراسة الحالية أن معظم الفاكهة تطورت بشكل جزئي ، مع معظم البذور غير قابلة للحياة16. النمط الجيني الأبوي له تأثير كبير على توافق التهجين بين الأنواع بين C. moschata و C. pepo. من بين 24 مجموعة متقاطعة تم اختبارها في الدراسة الحالية ، أسفرت واحدة فقط (C و J) عن أجنة غير ناضجة لإنقاذ الأجنة. على هذا النحو ، كانت الدراسة محدودة بسبب عدم وجود مكررات بيولوجية لاختبار كفاءة البروتوكول الذي تم تطويره. ومع ذلك ، تم الحصول على كفاءة تجديد بنسبة 80 ٪ ل 10 أجنة غير ناضجة تم إنقاذها من الصليب C و J. أبلغت الدراسات السابقة عن نجاح أقل في التجديد من عمليات إنقاذ الأجنة لتهجين C. pepo و C. moschata ، مما يدل على فعالية البروتوكول الجديد14,15. على سبيل المثال ، أفاد De Oliveira et al. أنه من بين 26 جنينا تم الحصول عليها من تهجين بين C. pepo cv. أسمرة و C. moschata السيرة الذاتية. بيرامويتا ، لم يتم الحصول على التجديدات. ومع ذلك ، أبلغ المؤلفون عن نجاح تجديد بنسبة 16٪ عند استخدام مجموعة مختلفة من الأنماط الجينية (C. pepo cv. Asmara و C. moschata cv. Duda)14. في دراسة أخرى عن التهجين بين الأنواع المختلفة من القرعيات ، أبلغ رخا وآخرون عن كفاءة تجديد بنسبة 40٪ و 15٪ من الأجنة غير الناضجة التي تم الحصول عليها عن طريق تهجين C. ficifolia x C. pepo و C. martinezii x C. pepo ، على التوالي15. استخدمت الدراسة الحالية وسيلة MS خالية من منظمات النمو التكميلية مقارنة بالبروتوكولات الموضوعة سابقا والتي استخدمت وسائط معقدة لإنقاذ الأجنة15،29،30. علاوة على ذلك ، كانت إضافة المضادات الحيوية سيفوتاكسيم والأمبيسلين كافية لمنع التلوث الميكروبي. وبالتالي ، فإن الوسيلة تقدم مزايا مثل كونها أرخص ، وسهلة التحضير دون الحاجة إلى موظفين ذوي مهارات عالية ، ويمكن اعتمادها من خلال برامج تربية أصغر بموارد محدودة.
في الدراسة الحالية ، تم حصاد الثمار بعد 45-55 يوما من التلقيح (DPP) لزيادة نضج الجنين وتجديده. استند DPP المختار للدراسة الحالية إلى تقرير سابق أظهر أن التراكم الأمثل لاحتياطيات الطاقة (معظمها من الدهون والبروتينات) للأجنة حدث عند 60 DPP31,32. في البطيخ ، أبلغ نونيز بالينيوس وآخرون عن وجود علاقة إيجابية بين نجاح إنقاذ الأجنة و DPP30.
في الدراسة الحالية ، لم ينتج الجيل الثاني من الفواكه التي تم تطويرها عن طريق عبور الهجينة F1 بين الأنواع مع C. moschata بذور طبيعية. تشير هذه الملاحظة إلى أنه من الصعب التغلب على حاجز الخصوبة بين C. moschata و C . pepo في جيل واحد كما ورد سابقا16. ومع ذلك ، فإن اعتماد البروتوكول الحالي سيساعد في التطوير الناجح للهجين القرعيات بين الأنواع في برامج التربية. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد التوافق المتبادل لمجموعة أوسع من الأنماط الجينية لتوسيع إمكانية وصول المربين إلى الأصول الوراثية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية ، مشروع NRS رقم. FLA-TRC-006176 ومعهد جامعة فلوريدا لعلوم الأغذية والزراعة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
- Paris, H. S. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. 20, (2016).
- Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
- Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
- Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. Cucurbits. , CAB International. Wallingford, Oxon, UK. (1997).
- Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
- Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
- Paris, H. S.
- Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. 'Butternut and C. pepo L. 'Delicata'. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
- Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
- Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
- Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
- Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
- Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
- De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
- Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
- Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
- Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
- Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
- Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
- Reed, S.
- Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K.
- Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
- Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
- Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
- Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
- Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
- Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
- Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
- Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
- Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , Humana Press. 107-115 (2011).
- Vining, K. J., Loy, J. B. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. McCreight, J. M. , ASHS Press. Alexandria, VA. 64-69 (1998).
- Vining, K. J. Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , University of New Hampshire. L.), Durham, NH. M.S. Thesis (1999).
