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Biology

南瓜种间杂交的胚胎救援方案

Published: September 12, 2022 doi: 10.3791/64071
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1UF/IFAS Tropical Research and Education Center

Summary

本文描述了一种胚胎救援方案，用于再生源自 葫芦 和葫芦 葫芦的种间杂交的未成熟胚胎。该协议可以很容易地复制，并将成为南瓜育种计划的重要资源。

Abstract

葫芦作物（南瓜）的种间杂交对于扩大遗传变异和有用等位基因的渗入是理想的。由这些宽杂交产生的未成熟胚胎必须使用适当的胚胎修复技术再生。虽然这种技术在许多作物中已经很成熟，但缺乏对允许其常规应用的适当南瓜方法的详细描述。在这里，我们描述了一种胚胎救援方案，可用于C. pepo和C. moschata的种间杂交。为了确定胚胎救援的可行组合，进行了24个种间杂交。坐果从22个杂交中获得，表明成功率为92%。然而，获得的大多数果实都是单性生殖的，种子没有胚胎（空种子）。只有一个交叉组合包含可以使用基础植物生长培养基再生的未成熟胚胎。从种间F1果实中共抢救出10个胚胎，胚胎抢救成功率为80%。这里开发的胚胎救援方案将有助于南瓜育种项目中的种间杂交。

Introduction

葫芦（2n = 40）是葫芦科中一个高度多样化的属，包含27个不同的物种，其中5个被驯化1。其中，葫芦葫芦，C. pepo和C. maxima是全球最具经济重要性的。在美国，C. moschata和C. pepo是农业生产中最重要的两个物种。C. pepo 由四个亚种（卵形、卵形、花苔和古马拉）组成，包含弯颈、直颈、橡子、扇贝、椰子、蔬菜骨髓、西葫芦和南瓜2，3，4，5 的夏冬瓜品种组。C. moschata主要由冬瓜市场类型组成，包括胡桃，迪金森和奶酪组1。这两个物种在形态和表型上是多种多样的，C. pepo被认为是它的产量，早熟度，灌木生长习性以及多样化的果实性状，包括果实形状，果实大小，果肉颜色和外皮图案。另一方面，C. moschata因其对热量和湿度的适应以及抗病虫害而备受推崇6，7。C. moschata和C. pepo之间的种间杂交不仅是两个物种之间理想特征渗入的重要策略，而且还允许在育种计划中扩大遗传基础7，8。

C. moschata和C. pepo之间的早期杂交是为了确定它们的相容性和/或分类障碍9，10，11，而后来的研究主要集中在转移理想的性状12，13，14。两个物种之间的种间杂交旨在转移新性状，例如灌木或半灌木生长习性，提高C. pepo的产量以及抗病性，对非生物胁迫的适应性和增加C. moschata14，15，16的活力。例如，C. pepo（P5）和C. moschata（MO3）之间的特定杂交导致更高的果实产量13，而C. moschata种质（尼日利亚本地和Menina）已被广泛用作栽培C. pepo品种中对potyvirus抗性的主要来源17，18。

先前的研究表明，C. moschata和C. pepo之间的杂交是可能的，但很困难8，15。种间杂交可能导致没有坐果（流产），没有活种子的孤雌果实（空种子），未成熟胚胎无法发育的无籽果实（狭叶植物果实），或具有少量未成熟胚胎的果实可以通过胚胎救援拯救成成熟植物15，16。例如，通过杂交C. pepo（餐桌女王，母系）与C. moschata（大奶酪，父系）没有获得可行的种子，但是，互惠杂交从134次授粉中产生了57个可行的种子9。Hayase仅在上午04：00使用在10°C下储存过夜19的花粉进行杂交时，才从C. moschata和C. pepo杂交中获得活种子。Baggett将八个不同的C. moschata品种与C. pepo（熟食）杂交，并报告说，在103次总授粉中，获得了83种看起来正常的果实，但没有一个含有活种子8。在C. pepo（S179）和C. moschata（NK）的杂交中，Zhang等人获得了15个果实和2，994个种子，但其中只有12个种子是可行的，其余的只显示出基本的发育。这些研究表明，尽管C. moschata和C. pepo之间的种间杂交是非常有益的，但从杂交中获得具有可行种子的果实需要16。

胚胎抢救被认为是克服早期流产或发育不良引起的问题的适当方法，并且是最早和最成功的体外培养技术之一，用于再生未成熟胚胎16，20。胚胎挽救涉及对发育不足/未成熟的胚胎进行体外培养，然后转移到无菌营养培养基中，以促进幼苗和最终成熟植物的恢复21。虽然胚胎抢救通常用于南瓜育种，但缺乏对允许其常规应用的适当方法的详细描述。利用胚胎抢救技术克服葫芦种种间杂交障碍早在1954年就有报道22。然而，早期研究中胚胎抢救的成功率要么没有报道，要么非常低。Metwally等人报告说，从C. pepo和C. martinezii23杂交中分离出的100个种间杂交胚胎的成功率为10%（再生为成熟植物）。Sisko等人报道了从不同交叉组合获得的胚胎中胚胎再生的成功率不同：通过杂交C. maxima（Bos. Max）和C. pepo（淘金热）获得的杂交种的再生率为15.5%，C. pepo（西葫芦）和C. moschata（北海道）的再生率为20%，而C. pepo（淘金热）和C. moschata（Dolga）为37.5%24。 除基因型外，培养基和体外培养条件是该技术成功的重要因素25，26。在目前的研究中，测试了C. moschata和C. pepo之间的各种杂交组合，并开发了一种在南瓜中利用胚胎救援技术的简单方法。开发一种简单且易于复制的胚胎拯救技术将促进南瓜育种项目中的种间杂交和种质增强。

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Protocol

1. 种植和授粉

注意：重要的是要确定相容的基因型，其杂交将导致坐果和产生可行的胚胎。

  1. 种植条件和维护
    1. 获得南瓜基因型（栽培品种/种质）的种子进行杂交（表1）。
    2. 用含有 1.38 g/kg N、1.38 g/kg P 和 1.38 g/kg K 的完整 NPK 肥料改良的盆栽培养基填充 50 个细胞起始平面（25 厘米宽 x 50 厘米长）。
    3. 播种到与其长度相等的深度，并用盆栽介质覆盖。在不产生积水的情况下给公寓浇水。之后，每天用手浇水一次，保持介质湿润。
    4. 在第二个真叶阶段，将幼苗移植到直径25厘米至30厘米的盆中，用完整的NPK肥料以3汤匙/盆修改。每周用 500 mL/盆含有 NPK 20：20：20 的液体肥料给植物施肥一次，浓度为每加仑水 1 克。
    5. 在自然光照条件下，将植物保持在温室中的温度在22-28°C之间。对于葡萄基因型，在温室中提供支撑棚架（图1）。
  2. 进行授粉
    1. 通常，根据品种的不同，南瓜开花从播种后 6 至 8 周开始（图 2A，B）。一旦植物开始开花，就开始进行受控杂交（杂交）。在温室条件下，授粉可以全年进行。
    2. 确定C. pepo 和 C. moschata 品种的雄花和雌花，这些花将在第二天准备授粉。要识别此类花朵，请检查花瓣呈黄色但未开放的花朵。使用遮蔽胶带轻轻地将花朵在顶部闭合，以防止意外昆虫授粉（图2C，D）。
    3. 第二天早上，花朵准备授粉。上午10：00前进行授粉，提高杂交成功率27.
    4. 通过轻轻去除花瓣的胶带顶部打开雌花和雄花。从雄花上取下花瓣，并通过轻轻摩擦花药在雌花的柱头上转移花粉（图3A）。
    5. 授粉后，立即用遮蔽胶带关闭授粉的雌花。使用标签记录授粉日期，并指示杂交中使用的父本和母系父母（图3B）。
    6. 成功的杂交由扩张的子房表示，该子房在1周内迅速形成一个小果实（图4A）。然后，植物在授粉后45-55天准备收获28 （图4B）。

2. 胚胎抢救技术

  1. 培养基制备
    1. 准备抗生素储备液：对于头孢噻肟（钠盐），将抗生素溶解在 4 mL 去离子或蒸馏水中，通过无菌 0.22 μm 注射器过滤器过滤，制成 0.5 mL 等分试样。储存在-20°C。 所得储备溶液的浓度为 250 mg/mL。
    2. 对于氨苄青霉素（钠盐），将粉末溶解在 10 mL 水中，通过无菌 0.22 μm 注射器过滤器过滤，并等分于最终浓度为 100 mg/mL 的 1 mL 储备液中。储存在-20°C。
    3. 通过将 2.45 g 培养基（4.91 g/L 浓度）溶解在 1 L 瓶中的 500 mL 蒸馏水中，制备 Murashige 和 Skoog （MS） 培养基。加入1.5g结冷胶，并在121°C高压灭菌20分钟。结冷胶在高压灭菌过程中完全溶解。
    4. 高压灭菌后，通过将瓶子放入50°C的水浴中来冷却培养基。 从冰箱中取出抗生素储备，并在层流柜中解冻。
    5. 将中等大小的瓶子转移到层流罩中。向培养基瓶中加入 0.6 mL 头孢噻肟储备溶液 （250 mg/mL） 和 0.25 mL 氨苄西林储备液 （100 mg/mL），充分混合。将约7 mL培养基倒入无菌培养皿（60 mm x 15 mm）中。
    6. 让培养基在培养皿中凝固约15-20分钟。用密封膜关闭培养皿，然后将它们放入储物盒中。在室温下储存。
  2. 胚胎抢救
    1. 在开始之前，用70%乙醇清洁和消毒层流柜。
    2. 通过将南瓜果实从主藤上折断/切断来收获，并通过在实验室水槽中用液体洗涤剂（例如，0.3%氯二甲酚）清洗来对水果表面进行消毒，直到去除所有松散的污垢（图5A）。
    3. 用充足的自来水冲洗。用干净的纸巾擦干水果。将水果移动到层流柜（图5B）。
    4. 通过在无菌层流气流柜中的水果上喷洒70%乙醇对水果进行表面消毒。用无菌刀将果实一分为二（图5C）并提取种子。
    5. 使用无菌镊子无菌打开种皮并暴露未成熟的胚胎（图6）。小心地将未成熟的胚胎放入含有补充有头孢噻肟和氨苄西林的MS培养基的培养皿中（图7A）。关闭培养皿并用包装膜密封。
      注意：根据胚胎的大小，可以在培养皿中容纳五个或六个胚胎。
    6. 将密封的培养皿与胚胎放在25°C和70%相对湿度下16小时光周期下的生长室中。如果发生污染，请立即将未受污染的胚胎传代培养到具有相同培养基的新平板中。
    7. 子叶将在 4 天后开始膨胀，并在 10 天内变为绿色（图 7B）。此时，如果需要，将传代培养到含有相同培养基的新板中以允许组织扩增。根将在14天时开始出现（图7C），在21天时，小苗将具有延伸的根和子叶（图7D）。
      注意：协议中使用的培养基适用于分化为芽和根，无需补充生长调节剂。
    8. 在这个阶段，从培养皿中取出小苗，并用自来水轻轻洗掉根部的培养基（图8）。将小苗放入塑料容器（14 cm x 9 cm x 4 cm）中，并用湿纸巾覆盖根部（图9A）。盖上容器，并根据需要重新弄湿纸巾。
    9. 将容器保持在室温（25-28°C）下，并以16小时的光周期。这一步将使小苗适应环境。在容器中适应7-10天后，幼苗将长约3-4英寸。在此期间，根据需要重新弄湿纸巾。
    10. 将幼苗转移到50个细胞起始公寓（25厘米宽x 50厘米长）中，如前所述用肥料修改，并将它们移至温室（图9B）。不要给幼苗浇水过多，以免腐烂;根据需要，每个细胞添加约 10-20 mL。
    11. 在第二至第三真叶阶段，将幼苗移植到直径30厘米的盆中，盆中装满了如前所述用肥料改良的盆栽培养基（图10A）。如前所述，为葡萄植物提供棚架支持，并在植物开始开花时进行受控杂交（图10B）。
    12. 在自然光照条件下，将植物保持在温室中的温度在22-28°C之间。评估植物的果实和种子特性。

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Representative Results

坐果和种子活力
进行了初步测试，以确定各种交叉组合中的坐果和种子活力。共选择15个南瓜基因型，4个C. pepo 和11个 C. moschata（表1）。在尝试的24种种间交叉组合中，有22种坐果（表2），坐果总体成功率为>92%。杂交O和M以及E和J未获得成熟果实，而杂交F和J获得的果实数量最多（n = 6）（表2）。不同杂交组合授粉的花朵数量从1到11朵不等，授粉成功率在0%-100%之间。不同杂交组合授粉的花朵数量根据花群数量和雄花和雌花开花的同步性而变化。尽管除了两个杂交之外，所有杂交的果实都是从果实中获得的，但对切割果实后的评估显示，大多数果实都流产了胚胎，没有可存活的种子。大多数杂交的果实看起来正常，但没有种子或由具有基本胚胎的种子组成。所有交叉组合共产生44个果实，只有C和J杂交发育的果实发育不良，可以通过胚胎抢救技术恢复。

胚胎修复和进一步发展
通过杂交C和J开发的F1种间杂交种总共有44颗种子，但其中只有10颗具有可以拯救以进行代际推进的胚胎。其余的种子没有胚胎。所有10个胚胎都在胚胎救援培养基中培养，并每天检查其生长和发育。10个未成熟胚胎的大小从3.51毫米到8.26毫米不等。胚胎抢救成功率为80%。通过杂交C. moschata和C. pepo（C和J）开发的F 1种间杂交种（桥系）以1：1（各50%）的比例包含两个物种的基因组。这些植物被用作两个物种之间经济重要性状渗入的桥梁线。例如，与C. moschata越过这些桥线将导致分别具有75%C. moschata和25%C. pepo遗传背景的杂交种。从这些桥系获得的果实混合了无法存活的种子和具有未成熟胚胎的种子，随后需要组织培养才能再生。例如，其中一个水果共有54颗种子，其中14颗种子具有未成熟的胚胎，使用此处描述的方案进行拯救。

Figure 1
图 1：温室中垂直种植南瓜植物的支撑棚架。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2：开放和贴带花的插图。 在温室中打开（A）雄性和（B）雌性南瓜花。（C）来自 葫芦属父 系父母的胶带雄花。（D）来自 葫芦 母体的胶带雌花。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：授粉示意图 。 （A）通过将花药轻轻摩擦雌花柱头来转移雄花的花粉。（B）授粉后，用胶带将雌花用胶带，用标签记录授粉日期和十字架中使用的父父母和母父母。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图4：坐果。 （A）授粉后，子房会迅速扩张，在1周内形成小果实。（B）授粉后45天即可收获果实。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图5：水果制备 。 （A）用洗涤剂清洗水果。通过在实验室水槽中用液体洗涤剂清洗水果来收获和消毒水果表面。（B）冲洗并干燥水果。用干净的纸巾擦干水果，然后用充足的自来水冲洗，然后将其移至层流柜中。（C）用无菌刀将水果一分为二。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图6：从种子中提取胚胎。 使用无菌镊子无菌打开种皮并暴露未成熟的胚胎。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 7
图 7：MS 培养基中的胚胎再生。 （A）小心地将未成熟的胚胎放入含有MS培养基的培养皿中。（B）子叶将在10天内膨胀并变绿。（C）根将在14天开始出现。（D）在21天时，幼苗将具有延伸的根和子叶，准备转移到塑料容器中以适应环境。请点击此处查看此图的大图。

Figure 8
图 8：清洗根部。 从培养皿中取出小苗，用自来水轻轻洗掉根部的培养基。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 9
图9：使小苗适应环境 。 （A）将小苗放入塑料容器中，用湿纸巾覆盖根部5天以使其适应环境。（B）将幼苗转移到装有用全NPK肥料改良的商业盆栽混合物的细胞托盘中。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 10
图10：将幼苗移植到盆中 。 （A）在第二至第三真叶阶段，将幼苗移植到直径30厘米的盆中，盆中装满了用肥料改良的盆栽介质。（B）为葡萄植物提供棚架支撑，并在植物开始开花时进行受控杂交。 请点击此处查看此图的大图。

实验室代码 物种 源
一个 C. 莫沙塔 当地农贸市场
B C. 莫沙塔 当地农贸市场
C C. 莫沙塔 当地农贸市场
D C. 莫沙塔 当地农贸市场
E C. 莫沙塔 当地农贸市场
F C. 莫沙塔 当地农贸市场
G C. 莫沙塔 佛罗里达大学育种系
H C. 莫沙塔 佛罗里达大学育种系
我 C. 佩波 NCRPIS（中北部地区植物入侵站）
J C. 佩波 NCRPIS（中北部地区植物入侵站）
M C. 佩波 NCRPIS（中北部地区植物入侵站）
O C. 莫沙塔 佛罗里达大学育种系
Q C. 莫沙塔 佛罗里达大学育种系
W C. 佩波 佛罗里达大学育种系
Y C. 莫沙塔 伯比种子公司

表 1： 共有15种南瓜基因型，4种C. pepo 和11种 C. moschata用于种间杂交研究。

十字架（女 x 男） 花的N. 水果的N. 坐果率（%） 流产种子的N. N. 未成熟胚胎 获救胚胎的N.
A （C. moschata） x I （C. pepo） 5 4 80 0 0 0
H （C. moschata） x I （C. pepo） 2 2 100 0 0 0
B （C. moschata） x J （C. pepo） 2 1 50 0 0 0
C （C. moschata） x J （C. pepo） 3 1 33.3 44 10 8
E （C. moschata） x J （C. pepo） 6 0 0 0 0 0
F （C. moschata） x J （C. pepo） 11 6 54.5 0 0 0
G （C. moschata） x J （C. pepo） 2 2 100 0 0 0
J （C. pepo） x H （C. moschata） 7 2 28.6 0 0 0
J （C. pepo） x O （C.moschata） 6 1 16.7 0 0 0
O （C. moschata） x J （C. pepo） 6 1 16.7 0 0 0
Q （C. moschata） x J （C. pepo） 1 1 100 0 0 0
C （C. moschata） x M （C. pepo） 4 3 75 0 0 0
D （C. moschata） x M （C. pepo） 1 1 100 0 0 0
F （C. moschata） x M （C. pepo） 9 5 55.6 0 0 0
G （C. moschata） x M （C. pepo） 1 1 100 0 0 0
O （C. moschata） x M （C. pepo） 22 0 0 0 0 0
Q （C. moschata） x M （C. pepo） 2 1 50 0 0 0
F （C. moschata） x W （C. pepo） 1 1 100 0 0 0
G （C. moschata） x W （C. pepo） 1 1 100 0 0 0
H （C. moschata） x W （C. pepo） 2 1 50 0 0 0
O （C. moschata） x W （C. pepo） 0 0 0 0 0 0
Y （C. moschata） x W （C. pepo） 3 2 66.7 0 0 0
M （C. pepo） x H （C.moschata） 3 2 66.7 0 0 0
M （C. pepo） x O （C.moschata） 4 4 100 0 0 0
总 44 10 8

表 2： 尝试对南瓜的15种基因型和相应的坐果，流产种子的数量，未成熟的胚胎和成功的胚胎挽救进行交叉组合。

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Discussion

在C. moschata和C. pepo之间成功的种间杂交有两个主要瓶颈：交叉相容性屏障，这是由产生杂交胚胎的基因型反应性决定的，以及受精后屏障，它阻碍杂交胚胎发育为正常种子。正如之前报道的南瓜一样，当前研究中的交叉相容性测试显示，大多数水果是单性生殖的，大多数种子无法存活16。亲本基因型对莫沙塔桔梗与桔梗种间杂交的相容性有较大影响。在当前研究中测试的24种交叉组合中，只有一个（C和J）产生了用于胚胎救援的未成熟胚胎。因此，由于缺乏生物学重复来测试所开发方案的效率，该研究受到限制。然而，从C和J交叉中拯救的10个未成熟胚胎的再生效率为80%。以前的研究报告了C. pepo和C. moschata杂交的胚胎救援的再生成功率较低，从而证明了新协议的有效性14，15。例如，De Oliveira等人报告说，在从C. pepo cv杂交获得的26个胚胎中。阿斯马拉和C.莫沙塔简历。皮拉莫伊塔，没有获得再生剂。然而，作者报告说，当使用不同的基因型组合（C. pepo cv. Asmara和C. moschata cv. Duda）时，再生成功率为16%14。在另一项关于不同葫芦物种之间种间杂交的研究中，Rakha等人报道了通过杂交C. ficifolia x C. pepo和C. martinezii x C. pepo获得的未成熟胚胎的再生效率分别为40%和15%15%。与先前建立的采用复杂培养基进行胚胎抢救的方案相比，目前的研究使用了不含补充生长调节剂的MS培养基15，29，30。此外，添加抗生素头孢噻肟和氨苄西林足以防止微生物污染。因此，该培养基具有更便宜的优点，无需高技能人员即可易于准备，并且可以被资源有限的小型育种计划采用。

在目前的研究中，水果在授粉后45-55天收获（DPP），以最大限度地提高胚胎成熟和再生。为当前研究选择的DPP是基于先前的报告，该报告显示胚胎能量储备（主要是脂质和蛋白质）的最佳积累发生在60 DPP31，32。在甜瓜中，Nunez-Palenius等人报道了胚胎救援的成功与DPP30之间存在正相关关系。

在目前的研究中，通过与C. moschata杂交种间F1杂交开发的第二代水果没有产生正常的种子。这一观察结果表明，很难在一代内克服C. moschata和C. pepo之间的生育障碍，如先前报道的那样16。然而，采用目前的协议将有助于在育种计划中成功开发葫芦种间杂交种。需要进一步的研究来确定更广泛的基因型的交叉相容性，以扩大育种者的种质可及性

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Disclosures

作者声明不存在利益冲突。

Acknowledgments

这项工作得到了美国农业部国家食品和农业研究所NRS项目编号的支持。FLA-TRC-006176和佛罗里达大学食品和农业科学研究所。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
autoclave Steris AMSCO LAB 250
balance
cefotaxime Sigma Alfrich C 7039
centrifuge tubes (1.5 ml) Sigma Alfrich T9661
detergent
ethanol, 95% Decon Labs 2805HC
forceps VWR 82027-408
gellan gum Caisson Laboratories G024
growth chamber or illuminated shelf
laminar hood / biosafety cabinet The Baker Company, Inc Edgegard
masking tape Uline S-11735
media bottle
Murashige & Skoog Medium Research Products International M10200
NPK fertilizer (20-20-20) BWI Companies, Inc  PR200
Osmocote Plus fertilizer BWI Companie,s Inc OS90590
Parafilm M Sigma Alfrich P7793
Petri dish (60 x 15 mm) USA Scientific, Inc 8609-0160
plant pots BWI Companies, Inc NP4000BXL
plastic food containers, reused Oscar Mayer 4470003330
plastic hang tags Amazon B07QTZRY6T
potting mix Jolly Gardener Pro-Line C/B
seedling starter trays BWI Companies Inc GPPF128S4
syringe filter (0.22 um ) ExtraGene B25CA022-S
trellis support The Home Depot  2A060006
water bath

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References

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生物学，第187期，
南瓜种间杂交的胚胎救援方案
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Fu, Y., Shrestha, S., Moon, P., Meru, G. Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash. J. Vis. Exp. (187), e64071, doi:10.3791/64071 (2022).

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