Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Embryo Rescue Protocol för interspecifik hybridisering i squash

Published: September 12, 2022 doi: 10.3791/64071
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1UF/IFAS Tropical Research and Education Center

Summary

Artikeln beskriver ett embryoräddningsprotokoll för regenerering av omogna embryon härrörande från den interspecifika hybridiseringen av Cucurbita pepo och Cucurbita moschata. Protokollet kan enkelt replikeras och kommer att vara en viktig resurs för squashavelsprogram.

Abstract

Interspecifik hybridisering i Cucurbita-grödor (squash) är önskvärt för att bredda genetisk variation och för introgression av användbara alleler. Omogna embryon som genereras från dessa breda korsningar skall regenereras med hjälp av lämpliga metoder för embryoräddning. Även om denna teknik är väl etablerad för många grödor, saknas en detaljerad beskrivning av lämplig metod för squash som skulle möjliggöra dess rutinmässiga tillämpning. Här beskriver vi ett embryoräddningsprotokoll som är användbart för interspecifik hybridisering av C. pepo och C . moschata. För att identifiera livskraftiga kombinationer för embryoräddning utfördes 24 interspecifika kors. Fruktuppsättningen erhölls från tjugotvå kors, vilket indikerar en framgångsgrad på 92%. De flesta av de erhållna frukterna var emellertid parthenokarpiska, med frön som saknade embryon (tomma frön). Endast en korskombination innehöll omogna embryon som kunde regenereras med hjälp av basala växttillväxtmedier. Totalt 10 embryon räddades från den interspecifika F1-frukten , och framgångsgraden för embryoräddning var 80%. Embryoräddningsprotokollet som utvecklats här kommer att vara användbart för interspecifik hybridisering i squashuppfödningsprogram.

Introduction

Cucurbita (2n = 40) är ett mycket varierat släkte i familjen Cucurbitaceae som innehåller 27 olika arter, varav fem är domesticerade1. Bland dessa är Cucurbita moschata, C. pepo och C. maxima de ekonomiskt viktigaste i världen. I USA är C. moschata och C. pepo de två viktigaste arterna i jordbruksproduktionen. C. pepo består av fyra underarter (ovifera, pepo, fraternal och gumala) som innehåller både sommar- och vintersquashsortgrupper av crookneck, straightneck, ekollon, kammussla, cocozelle, grönsaksmärg, zucchini och pumpa 2,3,4,5. C. moschata består främst av vintersquashmarknadstyper inklusive butternut, Dickinson och ostgrupp1. De två arterna är morfologiskt och fenotypiskt olika, med C. pepo betraktad för sitt utbyte, earliness, busktillväxtvanor och olika fruktegenskaper inklusive fruktform, fruktstorlek, köttfärg och skalmönster. Å andra sidan är C. moschata uppskattad för sin anpassning till värme och fuktighet, liksom sjukdoms- och skadedjursresistens 6,7. Interspecifik hybridisering mellan C. moschata och C. pepo är inte bara en viktig strategi för introgression av önskvärda egenskaper mellan de två arterna, utan möjliggör också breddning av den genetiska basen i avelsprogram 7,8.

Tidiga korsningar mellan C. moschata och C. pepo gjordes för att bestämma deras kompatibilitet och / eller taxonomiska hinder 9,10,11, medan senare studier mestadels fokuserade på att överföra önskvärda egenskaper12,13,14. Interspecifik hybridisering mellan de två arterna har riktat överföringen av nya egenskaper som en busk- eller halvbusketillväxtvana och förbättrat utbyte från C. pepo tillsammans med sjukdomsresistens, anpassningsförmåga till abiotisk stress och ökad kraft från C. moschata14,15,16. Till exempel har specifika korsningar mellan C. pepo (P5) och C. moschata (MO3) resulterat i högre fruktavkastning 13, medan C. moschata -anslutningar (nigerianska lokala och Menina) har använts i stor utsträckning som den primära källan till resistens mot potyvirus i odlade C. pepo -sorter17,18.

Tidigare studier visade att hybridisering mellan C. moschata och C. pepo är möjlig men svår 8,15. De interspecifika korsen kan resultera i ingen fruktuppsättning (abort), parthenokarpiska frukter utan livskraftiga frön (tomma frön), fröfria frukter där de omogna embryona inte utvecklas (stenospermocarpy) eller frukter med få omogna embryon som kan räddas till mogna växter genom embryoräddning15,16. Till exempel erhölls inga livskraftiga frön genom att korsa C. pepo (bordsdrottning, moder) med C. moschata (stor ost, fader), men det ömsesidiga korset gav 57 livskraftiga frön från 134 pollineringar9. Hayase erhöll livskraftiga frön från C. moschata och C. pepo korsar endast när korsningar gjordes klockan 04:00 med pollen lagrad vid 10 ° C över natten19. Baggett korsade åtta olika C. moschata -sorter med C. pepo (delicata) och rapporterade att av 103 totala pollineringar erhölls 83 frukter som verkade normala, men ingen av dem innehöll livskraftiga frön8. I en korsning mellan C. pepo (S179) och C. moschata (NK) erhöll Zhang et al. 15 frukter med 2 994 frön, men endast 12 av dessa frön var livskraftiga medan de återstående endast visade rudimentär utveckling. Dessa studier tyder på att även om interspecifik korsning mellan C. moschata och C. pepo är mycket fördelaktig, är det krävande att få frukt med livskraftiga frön från korsen16.

Embryoräddning har föreslagits som en lämplig metod för att övervinna problem som uppstår till följd av tidiga aborter eller dåligt utvecklade embryon och är en av de tidigaste och mest framgångsrika in vitro-odlingsteknikerna för regenerering av omogna embryon16,20. Embryoräddning involverar in vitro-odling av underutvecklade/omogna embryon följt av överföring till ett sterilt näringsmedium för att underlätta återhämtning av plantor och i slutändan mogna växter21. Även om embryoräddning vanligtvis används vid squashuppfödning, saknas en detaljerad beskrivning av lämplig metod som skulle möjliggöra dess rutinmässiga tillämpning. Att använda embryoräddningsteknik för att övervinna interspecifika hybridiseringsbarriärer hos Cucurbita-arter rapporterades redan 195422. Framgången med embryoräddning i de tidiga studierna var dock antingen orapporterad eller mycket låg. rapporterade en framgångsgrad på 10% (regenerering till mogna växter) bland 100 interspecifika hybridembryon som räddades från en korsning mellan C. pepo och C. martinezii23. rapporterade en varierande framgångsgrad för embryoregenerering bland embryon erhållna från olika korskombinationer: regenereringshastigheten för hybrider erhållna genom att korsa C. maxima (Bos. Max) och C. pepo (Gold Rush) var 15,5%, för C. pepo (Zucchini) och C. moschata (Hokaido) var 20%, medan det för C. pepo (Gold Rush) och C. moschata (Dolga) var 37,5%24. Förutom genotyp är media- och in vitro-odlingsförhållanden viktiga faktorer för framgången med tekniken25,26. I den aktuella studien testades olika korskombinationer mellan C. moschata och C. pepo, och en enkel metod för att använda embryoräddningstekniken i squash utvecklades. Utvecklingen av en enkel och lätt reproducerbar embryoräddningsteknik kommer att underlätta interspecifik hybridisering och bakterieplasmaförbättring i squashavelsprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plantering och pollinering

OBS: Det är viktigt att identifiera kompatibla genotyper vars hybridisering skulle resultera i fruktuppsättning och produktion av livskraftiga embryon.

  1. Planteringsförhållanden och underhåll
    1. Skaffa frön av squashgenotyper (sorter / accessioner) för hybridisering (tabell 1).
    2. Fyll 50 cell startplattor (25 cm bredd x 50 cm längd) med krukväxtmedium ändrat med komplett NPK-gödselmedel som innehåller 1,38 g / kg N, 1,38 g / kg P och 1,38 g / kg K.
    3. Så frön till ett djup som är lika med deras längd och täck med krukväxtmedium. Vattna lägenheterna utan att skapa stående vatten. Håll sedan mediet fuktigt genom att vattna det för hand en gång per dag.
    4. Vid det andra sanna bladstadiet, transplantera plantorna i krukor med en diameter på 25 cm till 30 cm som ändrats med ett komplett NPK-gödningsmedel vid 3 matskedar / kruka. Gödsla växterna en gång i veckan med 500 ml/kruka med flytande gödsel som innehåller NPK 20:20:20 tillsatt till en koncentration av 1 g per gallon vatten.
    5. Håll växter i växthuset vid temperaturer mellan 22-28 ° C under naturligt ljusregim. För vining genotyper, ge en stödjande spaljé i växthuset (Figur 1).
  2. Utföra pollineringar
    1. Vanligtvis börjar blomningen i squash vid 6 till 8 veckor från sådd beroende på sort (figur 2A, B). Börja göra kontrollerad hybridisering (kors) så snart växterna börjar blomma. Under växthusförhållanden kan pollinering göras året runt.
    2. Identifiera manliga och kvinnliga blommor av C. pepo och C. moschata sorter som kommer att vara redo för pollinering dagen efter. För att identifiera sådana blommor, kolla efter blommor vars kronblad har en gul nyans men inte är öppna. Tejpa försiktigt blommorna stängda upptill med maskeringstejp för att förhindra oavsiktlig insektsbestämning (figur 2C,D).
    3. Morgonen följande dag är blommorna redo att pollinera. Utför pollinering före 10:00 för att förbättra hybridiseringsframgången27.
    4. Öppna hon- och hanblommorna genom att försiktigt ta bort den tejpade övre delen av kronbladet. Ta bort kronbladen från hanblomman och överför pollen genom att försiktigt gnugga antheren på stigmatiseringen av honblomman (Figur 3A).
    5. Efter pollinering, stäng omedelbart den pollinerade kvinnliga blomman med maskeringstejp. Använd en tagg för att registrera pollineringsdatum och för att ange faderliga och moderföräldrar som används i korset (figur 3B).
    6. Ett framgångsrikt kors indikeras av en expanderad äggstock som snabbt bildar en liten frukt inom 1 vecka (figur 4A). Växten är sedan klar för skörd 45-55 dagar efter pollinering28 (Figur 4B).

2. Embryoräddningsteknik

  1. Förberedelse av media
    1. Förbered antibiotikalager: För cefotaxim (natriumsalt), lös upp antibiotikumet i 4 ml avjoniserat eller destillerat vatten, filtrera genom ett sterilt 0,22 μm sprutfilter och gör 0,5 ml alikvoter. Förvaras vid -20 °C. Den resulterande stamlösningen kommer att ha en koncentration på 250 mg/ml.
    2. För ampicillin (natriumsalt), lös upp pulvret i 10 ml vatten, filtrera genom ett sterilt 0,22 μm sprutfilter och alikvot i 1 ml stam med en slutlig koncentration på 100 mg/ml. Förvaras vid -20 °C.
    3. Gör Murashige och Skoog (MS) medium genom att lösa 2,45 g medium (4,91 g / L koncentration) i 500 ml destillerat vatten i en 1 L flaska. Tillsätt 1,5 g gellangummi och autoklav vid 121 °C i 20 minuter. Gellangummit löser sig helt under autoklavering.
    4. Efter autoklavering, kyla mediet genom att placera flaskan i ett vattenbad vid 50 °C. Ta bort antibiotikalagren från frysen och tina dem i det laminära flödesskåpet.
    5. Överför mellanflaskan till den laminära flödeshuven. Tillsätt 0,6 ml cefotaximstamlösning (250 mg/ml) och 0,25 ml ampicillinbuljong (100 mg/ml) till mellanflaskan och blanda väl. Häll ca 7 ml av mediet i en steril petriskål (60 mm x 15 mm).
    6. Låt mediet stelna i petriskålarna i ca 15-20 min. Stäng petriskålarna med tätningsfolie och lägg dem i en förvaringslåda. Förvaras i rumstemperatur.
  2. Embryo räddning
    1. Innan du börjar, rengör och sterilisera det laminära luftflödesskåpet med 70% etylalkohol.
    2. Skörda squashfrukten genom att bryta/skära av huvudvinstocken och desinficera fruktytan genom att tvätta med flytande tvättmedel (t.ex. 0,3% kloroxylenol) i labbfatet tills all lös smuts har tagits bort (figur 5A).
    3. Skölj med rikligt med kranvatten. Torka frukten med rena pappershanddukar. Flytta frukten till laminärluftsskåpet (figur 5B).
    4. Ytsterilisera frukten genom att spruta 70% etanol på frukten i det sterila laminära luftflödesskåpet. Skär frukten med en steril kniv (figur 5C) och extrahera fröna.
    5. Använd sterila tångar för att aseptiskt öppna fröskiktet och exponera de omogna embryona (figur 6). Placera försiktigt de omogna embryona i en petriskål som innehåller MS-medium kompletterat med cefotaxim och ampicillin (figur 7A). Stäng petriskålen och försegla med omslagsfilm.
      OBS: Beroende på embryots storlek är det möjligt att passa fem eller sex embryon i en petriskål.
    6. Placera de förseglade petriskålarna med embryon i en tillväxtkammare under 16 timmars fotoperiod vid 25 °C och 70 % relativ fuktighet. Om kontaminering inträffar, subkulturera omedelbart de oförorenade embryona till en ny platta med samma medium.
    7. Cotyledonerna börjar expandera efter 4 dagar och blir gröna om 10 dagar (figur 7B). Vid denna tidpunkt, om det behövs, utför subkulturering i nya plattor som innehåller samma medium för att möjliggöra vävnadsutvidgning. Rötterna börjar dyka upp vid 14 dagar (figur 7C), och vid 21 dagar kommer plantletsna att ha förlängda rötter och kotyledoner (figur 7D).
      OBS: Odlingsmediet som används i protokollet är lämpligt för differentiering till skott och rötter utan kompletterande tillväxtregulatorer.
    8. Ta i detta skede bort plantorna från petriskålarna och tvätta försiktigt av mediet från rötterna med kranvatten (figur 8). Placera plantleterna i en plastbehållare (14 cm x 9 cm x 4 cm) och täck rötterna med våta pappershanddukar (figur 9A). Täck behållaren och fukta pappershanddukarna vid behov.
    9. Förvara behållarna i rumstemperatur (25–28 °C) och med en fotoperiod på 16 timmar. Detta steg kommer att acklimatisera plantletsna. Efter acklimatisering i 7-10 dagar i behållaren kommer plantorna att vara cirka 3-4 långa. Under denna period, återfukta pappershanddukarna efter behov.
    10. Överför plantorna till 50 cellstartplattor (25 cm bredd x 50 cm längd) ändrade med gödselmedel som tidigare beskrivits och flytta dem till växthuset (figur 9B). Övervattna inte plantor för att undvika ruttning; lägg till cirka 10-20 ml per cell efter behov.
    11. Vid det andra till tredje sanna bladstadiet, transplantera plantorna i krukor med en diameter på 30 cm fyllda med krukväxtmedium ändrat med gödselmedel som tidigare beskrivits (figur 10A). Ge spaljéstöd för viningväxter och utför kontrollerad hybridisering när växterna börjar blomma, som tidigare beskrivits (figur 10B).
    12. Håll växterna i växthuset vid temperaturer mellan 22-28 ° C under naturligt ljusregim. Utvärdera växterna för frukt- och fröegenskaper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fruktuppsättning och fröets livskraft
Ett första test utfördes för att bestämma fruktuppsättning och fröets livskraft i en mängd olika korskombinationer. Totalt valdes 15 squashgenotyper, fyra C. pepo och 11 C. moschata, (tabell 1). Av de 24 interspecifika korskombinationer som försöktes erhölls en fruktuppsättning för 22 (tabell 2), vilket motsvarar en total framgång på >92% i fruktuppsättningen. Inga mogna frukter erhölls genom att korsa O och M och E och J, medan det högsta antalet frukter (n = 6) erhölls genom att korsa F och J (tabell 2). Antalet blommor som pollinerades för olika korskombinationer varierade från en till 11, och framgångsgraden för pollinering varierade från 0% till 100%. Antalet blommor som pollineras i olika korskombinationer varierade beroende på antalet blomset och synkronisering av blomningen bland manliga och kvinnliga blommor. Även om frukter erhölls från alla kors utom två, avslöjade utvärdering av frukter efter att ha klippt dem att de flesta frukterna hade aborterat embryon utan livskraftiga frön. Frukter från de flesta korsen såg normala ut men saknade frön eller bestod av frön med rudimentära embryon. Totalt producerades 44 frukter från alla korskombinationer, och endast en frukt, utvecklad genom att korsa C och J, hade dåligt utvecklade embryon som kunde återvinnas genom embryoräddningstekniken.

Embryoräddning och ytterligare framsteg
F1 interspecifik hybrid som utvecklades genom att korsa C och J hade totalt 44 frön, men endast 10 av dem hade embryon som kunde räddas för generationsutveckling. De återstående fröna hade inga embryon. Alla 10 embryon odlades i embryoräddningsmediet och kontrollerades dagligen för deras tillväxt och utveckling. Storleken på de 10 omogna embryona varierade från 3,51 mm till 8,26 mm. Framgångsgraden för embryoräddning var 80%. De F 1 interspecifika hybriderna (brolinjer) som utvecklades genom att korsa C. moschata och C. pepo (C och J) innehöll genomerna för båda arterna i förhållandet 1:1 (50% vardera). Dessa växter användes som brolinjer för introgression av ekonomiskt viktiga egenskaper över de två arterna. Till exempel skulle korsning av dessa brolinjer med C. moschata resultera i hybrider med 75% C. moschata respektive 25% C. pepo genetisk bakgrund. Frukterna som erhölls från dessa brolinjer hade en blandning av oföränderliga frön och frön med omogna embryon som därefter krävde vävnadsodling för regenerering. Till exempel hade en av frukterna totalt 54 frön, bland vilka 14 frön hade omogna embryon som räddades med hjälp av protokollet som beskrivs här.

Figure 1
Figur 1: Stödjande spaljé för vertikalt växande squashväxter i växthuset. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Illustration av öppna och tejpade blommor. Öppna (A) hane och (B) kvinnlig squashblomma i växthuset. (C) En tejpad hanblomma från Cucurbita moschata faderförälder. (D) En tejpad honblomma från Cucurbita pepo moderförälder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Illustration av pollinering . (A) Överför pollen från hanblomman genom att försiktigt gnugga antheren på stigmatiseringen av honblomman. (B) Efter pollinering, tejpa honblomman och använd en etikett för att registrera pollineringsdatum och faders- och moderföräldrar som används i korset. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Fruktuppsättning . (A) Efter pollinering kommer äggstocken att expandera snabbt och bilda en liten frukt inom 1 vecka. B) Frukten är klar för skörd 45 dagar efter pollinering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Fruktberedning . (A) Tvätta frukten med tvättmedel. Skörda och desinficera fruktens yta genom att tvätta den med flytande tvättmedel i labbfatet. (B) Skölj och torka frukten. Torka frukten med rena pappershanddukar, efter sköljning med gott om kranvatten och flytta den till laminärluftflödesskåpet. (C) Skär upp frukten med en steril kniv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Extrahera embryo från fröna. Använd sterila pincett för att aseptiskt öppna fröskiktet och exponera det omogna embryot. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Embryoregenerering i MS-medierna . (A) Placera omogna embryon försiktigt i en petriskål som innehåller MS-medium. (B) Cotyledonerna kommer att expandera och bli gröna inom 10 dagar. (C) Rötterna börjar dyka upp vid 14 dagar. (D) Vid 21 dagar kommer plantorna att ha förlängda rötter och kotyledoner som är redo att överföras till en plastbehållare för acklimatisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Tvätta rötterna. Ta bort plantorna från petriskålarna och tvätta försiktigt av media från rötterna med kranvatten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Acklimatisera plantlets . (A) Placera plantletsna i en plastbehållare och täck rötterna med en våt pappershandduk i 5 dagar för att acklimatisera dem. (B) Överför plantorna till cellbrickor som innehåller kommersiell krukväxtblandning ändrad med fullständigt NPK-gödselmedel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: Transplantera plantorna i krukor. (A) Vid det andra till tredje sanna bladstadiet, transplantera plantorna i krukor med en diameter på 30 cm fyllda med krukväxtmedium ändrat med gödselmedel. (B) Ge spaljéstöd för viningväxter och gör kontrollerad hybridisering när växterna börjar blomma. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Lab-kod Art Källa
A C. moschata Lokala bondemarknaden
B C. moschata Lokala bondemarknaden
C C. moschata Lokala bondemarknaden
D C. moschata Lokala bondemarknaden
E C. moschata Lokala bondemarknaden
F C. moschata Lokala bondemarknaden
G C. moschata University of Florida avelslinje
H C. moschata University of Florida avelslinje
Jag C. pepo NCRPIS (norra centrala regionala anläggningens intruduktionsstation)
J C. pepo NCRPIS (norra centrala regionala anläggningens intruduktionsstation)
M C. pepo NCRPIS (norra centrala regionala anläggningens intruduktionsstation)
O C. moschata University of Florida avelslinje
Q C. moschata University of Florida avelslinje
W C. pepo University of Florida avelslinje
Y C. moschata Burpee frön co

Tabell 1: Totalt 15 genotyper av squash, fyra C. pepo och 11 C. moschata, användes i studien för interspecifika kors.

Kors (hona x hane) N. av pollinerade blommor N. av frukter Fruktuppsättning (%) N. av aborterade frön N. av omogna embryon N. av räddade embryon
A (C. moschata) x I (C. pepo) 5 4 80 0 0 0
H (C. moschata) x I (C. pepo) 2 2 100 0 0 0
B (C. moschata) x J (C. pepo) 2 1 50 0 0 0
C (C. moschata) x J (C. pepo) 3 1 33.3 44 10 8
E (C. moschata) x J (C. pepo) 6 0 0 0 0 0
F (C. moschata) x J (C. pepo) 11 6 54.5 0 0 0
G (C. moschata) x J (C. pepo) 2 2 100 0 0 0
J (C. pepo) x H (C. moschata) 7 2 28.6 0 0 0
J (C. pepo) x O (C.moschata) 6 1 16.7 0 0 0
O (C. moschata) x J (C. pepo) 6 1 16.7 0 0 0
Q (C. moschata) x J (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
C (C. moschata) x M (C. pepo) 4 3 75 0 0 0
D (C. moschata) x M (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
F (C. moschata) x M (C. pepo) 9 5 55.6 0 0 0
G (C. moschata) x M (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
O (C. moschata) x M (C. pepo) 22 0 0 0 0 0
Q (C. moschata) x M (C. pepo) 2 1 50 0 0 0
F (C. moschata) x W (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
G (C. moschata) x W (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
H (C. moschata) x W (C. pepo) 2 1 50 0 0 0
O (C. moschata) x W (C. pepo) 0 0 0 0 0 0
Y (C. moschata) x W (C. pepo) 3 2 66.7 0 0 0
M (C. pepo) x H (C.moschata) 3 2 66.7 0 0 0
M (C. pepo) x O (C.moschata) 4 4 100 0 0 0
Total 44 10 8

Tabell 2: Korskombinationer försökte med de 15 genotyperna av squash och motsvarande fruktuppsättning, antal aborterade frön, omogna embryon och framgångsrika embryoräddningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns två huvudsakliga flaskhalsar för framgångsrik interspecifik hybridisering mellan C. moschata och C. pepo: korskompatibilitetsbarriär, som bestäms av genotyprespons för att producera hybridembryon, och efterbefruktningsbarriärer, som hindrar utvecklingen av hybridembryon till normala frön. Som tidigare rapporterats för squash avslöjade korskompatibilitetstestet i den aktuella studien att det mesta av frukten utvecklades parthenokarptiskt, med de flesta frön oföränderliga16. Föräldragenotyp har ett betydande inflytande på kompatibiliteten hos interspecifik hybridisering mellan C. moschata och C. pepo. Bland de 24 korskombinationer som testades i den aktuella studien gav endast en (C och J) omogna embryon för embryoräddning. Som sådan begränsades studien av bristen på biologiska replikat för att testa effektiviteten i det utvecklade protokollet. Emellertid erhölls en regenereringseffektivitet på 80% för de 10 omogna embryon som räddades från C- och J-korset. Tidigare studier har rapporterat lägre regenereringsframgång från embryoräddningar för C. pepo och C. moschata-korsningar, vilket visar effektiviteten hos det nya protokollet14,15. Rapporterade till exempel att av 26 embryon som erhållits från en korsning mellan C. pepo cv. Asmara och C. moschata cv. Piramoita, inga regeneranter erhölls. Författarna rapporterade dock en 16% regenereringsframgång när en annan kombination av genotyper (C. pepo cv. Asmara och C. moschata cv. Duda) användes14. I en annan studie av interspecifik hybridisering mellan olika Cucurbita-arter rapporterade Rakha et al. en regenereringseffektivitet på 40% och 15% från de omogna embryon som erhållits genom att korsa C. ficifolia x C. pepo respektive C. martinezii x C. pepo 15. Den aktuella studien använde ett MS-medium utan kompletterande tillväxtregulatorer jämfört med tidigare etablerade protokoll som använde komplexa medier för embryoräddning 15,29,30. Dessutom var tillsatsen av antibiotika cefotadim och ampicillin tillräcklig för att förhindra mikrobiell kontaminering. Således erbjuder mediet fördelar som billigare, är lätt att förbereda utan behov av högkvalificerad personal, och det kan antas av mindre avelsprogram med begränsade resurser.

I den aktuella studien skördades frukter 45-55 dagar efter pollinering (DPP) för att maximera embryomognad och regenerering. DPP som valdes ut för den aktuella studien baserades på en tidigare rapport som visade optimal ackumulering av energireserver (mestadels lipider och proteiner) för embryon inträffade vid 60 DPP31,32. rapporterade Nunez-Palenius et al. en positiv korrelation mellan framgången med embryoräddning och DPP30.

I den aktuella studien gav den andra generationen frukter som utvecklats genom att korsa interspecifika F1-hybrider med C. moschata inte normala frön. Denna observation indikerar att det är svårt att övervinna fertilitetsbarriären mellan C. moschata och C. pepo i en enda generation som tidigare rapporterats16. Antagandet av det nuvarande protokollet kommer dock att bidra till en framgångsrik utveckling av Cucurbita interspecifika hybrider i avelsprogram. Ytterligare studier behövs för att bestämma korskompatibilitet för ett bredare spektrum av genotyper för att bredda tillgången till bakterieplasma för uppfödare

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Project No. FLA-TRC-006176 och University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
autoclave Steris AMSCO LAB 250
balance
cefotaxime Sigma Alfrich C 7039
centrifuge tubes (1.5 ml) Sigma Alfrich T9661
detergent
ethanol, 95% Decon Labs 2805HC
forceps VWR 82027-408
gellan gum Caisson Laboratories G024
growth chamber or illuminated shelf
laminar hood / biosafety cabinet The Baker Company, Inc Edgegard
masking tape Uline S-11735
media bottle
Murashige & Skoog Medium Research Products International M10200
NPK fertilizer (20-20-20) BWI Companies, Inc  PR200
Osmocote Plus fertilizer BWI Companie,s Inc OS90590
Parafilm M Sigma Alfrich P7793
Petri dish (60 x 15 mm) USA Scientific, Inc 8609-0160
plant pots BWI Companies, Inc NP4000BXL
plastic food containers, reused Oscar Mayer 4470003330
plastic hang tags Amazon B07QTZRY6T
potting mix Jolly Gardener Pro-Line C/B
seedling starter trays BWI Companies Inc GPPF128S4
syringe filter (0.22 um ) ExtraGene B25CA022-S
trellis support The Home Depot  2A060006
water bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paris, H. S. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. 20, (2016).
  2. Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
  3. Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
  4. Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. Cucurbits. , CAB International. Wallingford, Oxon, UK. (1997).
  5. Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
  6. Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
  7. Paris, H. S. History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo. Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71 (2001).
  8. Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. 'Butternut and C. pepo L. 'Delicata'. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
  9. Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
  10. Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
  11. Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
  12. Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
  13. Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
  14. De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
  15. Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
  16. Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
  17. Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
  18. Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
  19. Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
  20. Reed, S. Embryo rescue. Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).
  21. Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. Embryo rescue in plants-a review. Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).
  22. Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
  23. Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
  24. Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
  25. Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
  26. Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
  27. Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
  28. Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
  29. Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
  30. Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , Humana Press. 107-115 (2011).
  31. Vining, K. J., Loy, J. B. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. McCreight, J. M. , ASHS Press. Alexandria, VA. 64-69 (1998).
  32. Vining, K. J. Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , University of New Hampshire. L.), Durham, NH. M.S. Thesis (1999).

Tags

Biologi utgåva 187
Embryo Rescue Protocol för interspecifik hybridisering i squash
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fu, Y., Shrestha, S., Moon, P.,… More

Fu, Y., Shrestha, S., Moon, P., Meru, G. Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash. J. Vis. Exp. (187), e64071, doi:10.3791/64071 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter