Summary
実験室の土壌温暖化実験では、通常、複数のチャンバーで2つ以上の一定の温度を使用します。洗練された環境チャンバーを提示することにより、その 場 の土壌温度の大きさと振幅を模倣し、土壌インキュベーション研究の実験デザインを改善するための正確な温度制御方法を提供します。
Abstract
土壌への温暖化の影響の研究には、現実的で正確な温度の表現が必要です。実験室でのインキュベーション研究では、広く採用されている方法は、複数のチャンバーで一定の温度にし、低温チャンバーと高温チャンバー間の土壌応答の比較 を介して 、土壌変化に対する温暖化の影響を導き出すことでした。しかし、この一般的に使用される方法は、野外条件で観察される実際の温度の大きさと振幅の両方を模倣することができなかったため、そのような研究の妥当性を損なう可能性があります。高度な環境チャンバーがますます利用可能になるにつれて、土壌インキュベーション研究のための温度制御の代替方法を検討することが不可欠です。このプロトコルは、最先端の環境チャンバーを導入し、土壌インキュベーションの実験デザインを改善するための従来の温度制御方法と新しい方法の両方を実証します。プロトコルは主に、温度の監視とプログラミング、土壌収集、実験室でのインキュベーション、温暖化効果の比較の4つのステップで構成されています。温度制御のさまざまな方法と、その結果生じる対照的な温暖化シナリオを示すために、1つの例が提示されます。すなわち、段階的温暖化(SW)と呼ばれる一定温度設計と、緩やかな温暖化(GW)と呼ばれるその 場 温度設計、ならびに土壌呼吸、微生物バイオマス、および細胞外酵素活性への影響。さらに、特定の気候変動研究ニーズ(極端な暑さなど)を満たすために、温度変化シナリオを多様化する戦略を提示します。温度制御プロトコルと推奨される適切に調整された多様な温度変化シナリオは、研究者が実験室で信頼性が高く現実的な土壌インキュベーション実験を確立するのに役立ちます。
Introduction
地球の表面温度は今世紀中に1.8〜6.4°C上昇すると予想されています1,2。地球温暖化は、土壌から大気へのCO2フラックスを増加させる可能性があり、温暖化3,4,5,6で正のフィードバックをもたらします。微生物群集は温暖化に対する土壌呼吸反応の調節に重要な役割を果たしているため7,8、微生物呼吸の変化と温暖化に伴う根底にある微生物メカニズムが研究の焦点となっています。加熱ケーブル9とオープントップチャンバー10を介して野外条件で展開された土壌温暖化実験は、温度11などの自然の土壌の特徴を捉えるのに有利でしたが、設置とメンテナンスのためのそれらの高いコストはそれらの適用を制限しました。あるいは、異なる温度にさらされる土壌インキュベーション実験が好ましい選択です。実験室での土壌インキュベーションの主な利点は、十分に制御された環境条件(例えば、温度)が、野外実験環境において他の交絡因子から一因子効果を解きほぐすことができることである12,13。成長チャンバーと野外実験(植物の成長など)の違いにもかかわらず、実験室の結果から野外への翻訳はすぐに利用できます14。実験室で土壌サンプルをインキュベートすることは、温暖化に対する土壌反応の機構的理解を向上させるのに役立つ可能性があります15。
私たちの文献レビューでは、過去の土壌インキュベーション研究でいくつかの温度制御方法を特定し、その結果、異なる温度変化モードを特定しました(表1)。第一に、温度を制御するために使用される器具は、主にインキュベーター、成長室、水浴、そしてまれに加熱ケーブルを介して行われます。これらの計測器を考えると、3つの典型的な温度変化パターンが生成されています(図1)。これらには、最も実装されているモード、一定温度(CT)、ゼロ以外の一定の温度変化率を持つ線形変化(LC)、および日周タイプの温度を特徴とする非線形変化(NC)が含まれます。CTパターンの場合、インキュベーション中は一定時間一定の温度が維持されますが、温度は時間とともに大きさが変化する可能性があります(図1B)。LCの場合、温度変化の速度は、異なる研究で2桁以上変化する可能性があります(たとえば、0.1°C/日対3.3°C/h;表 1);NCの場合、ほとんどが使用する機器の固有の容量に依存していたため、さまざまなモードにつながりました。それにもかかわらず、加熱ケーブルまたはインキュベーターを介して一種の日周温度変化が主張された16,17;ただし、これらの実験のチャンバー温度は検証されませんでした。表1の他の主要なレビュー結果には、0〜40°Cのインキュベーション温度の範囲が含まれ、ほとんどが5〜25°Cの間です。実験期間は数時間(<1日)から2年近く(~725日)の範囲であった。また、インキュベーションを受けた土壌は、森林、草原、農地の生態系から収集され、主に米国、中国、ヨーロッパにある優勢な鉱物地平線、有機地平線、さらには汚染土壌がありました(表1)。
3つの主要な温度変化モードを考えると、過去の研究で達成されたいくつかの異なる温暖化シナリオが 表2に要約されました。それらには、段階的温暖化(SW)、大きさの異なる南西(SWv)、直線的に緩やかな温暖化(GWl)、非線形に緩やかな温暖化(GWn)、および日周的に緩やかな温暖化(GWd)が含まれます。
要約すると、過去の土壌インキュベーションは通常、サイトの平均気温または土壌温度をキャプチャしました。多くの場合、表1に示すように、インキュベーターまたはチャンバーは手動で固定温度でプログラムされていましたが、必要に応じて温度を自動的に調整することができず、時間とともに温度変化のモードと速度を制御する機能がなく(式1)、したがって、局所土壌の日周温度を模倣することが困難でした。一方、2つの実験16,17で試みましたが、インキュベーション実験で日中の段階的な温暖化(GWd)を明示的に模倣した研究は確認されませんでした(表1)。文献レビューに基づくと、主な障害は実験計画が不十分であり、特に日中または他の段階的な温暖化シナリオの実装と検証を可能にする洗練された機器が不足していることにあります。
(式1)
ここで、ΔT は温度変化量、 m は温度変化のモード、 r は温度変化率、 t は変化期間です。
土壌インキュベーションにおける実験の厳密さを向上させるために、この研究では正確で洗練された温度制御方法を提示します。新しい設計は、ますます利用可能で経済的に実行可能な最先端の環境チャンバーを採用し、その 場 の土壌温度(日周パターンなど)の正確なシミュレーションを可能にするだけでなく、極端な温度変化の可能性を考慮して、機器のバイアスのアーチファクトを最小限に抑える信頼性の高い方法を提供します。現在の土壌インキュベーション設計は、研究者がインキュベーションと研究のニーズを満たす最適な戦略を特定するのに役立つはずです。この方法の全体的な目標は、土壌生物地球化学者に土壌インキュベーション設計を改革するための高度に運用可能なアプローチを提示することです。
Protocol
1.温度監視とプログラミング
- 調査区画内のサンプリングゾーンを特定します。深さ10 cmの土壌に1つまたはいくつかの自動温度プローブを取り付けます。データ転送ケーブル を介して 気象観測所をコンピューターに接続し、コンピューターでソフトウェアを開きます。
- [起動/プロパティ]ツールバーボタンをクリックして、使用されている外部センサーのロガーを構成します。
- プロパティ画面で、ロガー/ステーション名(土壌インキュベーション経験値)とデータ収集間隔(60分)を設定します。次に、[プロパティ]画面で、使用している外部センサーポートの[有効]をクリックし、各センサーポート(つまり、ポートA;「有効」:温度°C)。最後に、[OK]をクリックして設定を保存します。
- 誤動作を避けるためにプローブの読み取り値を毎週監視し、月に一度データセットをダウンロードします。成長期(つまり、4月から9月)をカバーする数か月間の完全な記録を取得します。
- 温度記録のデータ分析を行います。すべての観測値を平均して、成長期の平均時間気温を取得します。
- 成長期のすべての日にわたって同じ時間の気温を平均することにより、毎日各時間の平均温度を取得します。
- 洗練されたチャンバーで、ソフトウェアを起動し、メインメニュー画面の[ プロファイル ]ボタンをクリックして、新しいファイルを作成します。ファイル名入力行に「SW low」と入力します。 [インスタント変更 ]オプションをクリックして、手順1.5で取得した初期温度として15.9°Cを入力し、[ 分 ]行に2と入力して温度を2分間維持し、[ 完了 ]ボタンをクリックします。次に、[ ランプ 時間]オプションで、目標設定値として15.9°Cを入力し、[ 時間 ]行に850時間を入力して温度を維持します。最後に、[ 完了 ]ボタンをクリックします。
- 各温度ノードに5°Cを追加して2番目のチャンバーで上記の手順を繰り返し、新しいファイル名「SW high」を作成します。
- ステップ1.5.1で得られた23の観測された毎時土壌温度に対応する23の追加ステップを追加して、3番目のチャンバーでステップ1.4を繰り返します。 JUMPと呼ばれる最後のステップで、42の繰り返しループを設定します(ジャンプカウント42)。これは、段階的な温暖化またはGWの低さのシナリオにつながります。
- 各温度ノードに5°C添加した第4のチャンバで上記工程を繰り返す。これにより、より高い温度レベル(つまり、GW高)で42日間、さまざまな温度のシミュレーションが可能になります。
- 24時間の予備運転を行い、4つのチャンバーによって記録された温度を出力します。チャンバーによって記録された温度を、プログラムされた温度に対してプロットします(図2A-D)。
- チャンバー内で達成された温度が、24時間の間に<0.1°Cの温度差によってプログラムされた温度と一致する場合(図2A、B、E、F)、チャンバーは土壌インキュベーション実験に適しています。
- これらのチャンバーのいずれかで基準が満たされなかった場合は、さらに24時間のテストを繰り返すか、新しいチャンバーを探します。
2.土壌の収集と均質化
- 温度プローブエリアの近くで、深さ0〜20 cmの土壌サンプルを5つ収集し、表面のゴミ層を取り除いた後、1つのビニール袋に入れます。
- 個々の土壌サンプルが見えなくなるまで、バッグ内の材料をねじったり、押したり、混ぜたりして、サンプルを完全に混合します。
- サンプルを保冷剤で満たされたクーラーに保管し、サンプルをすぐにラボに輸送します。
- 各コアの根を取り除き、2 mmの土壌ふるいを通してふるいにかけ、次の分析の前にサンプルを完全に混合して均質化します。
3.実験室でのインキュベーション
- インキュベーションの前に、新鮮な土壌10.0 gを秤量し、105°Cで24時間オーブン乾燥し、乾燥した土壌を秤量します。新鮮な土壌サンプルと乾燥した土壌サンプルの差を導き出し、乾燥土壌重量に対する差の比率を計算して、スプレッドシートで土壌水分含有量を決定します。
- 得られた水分含有量を使用して、次の手順で説明するように、土壌微生物バイオマス炭素(MBC)、細胞外酵素活性(EEA)、および土壌従属栄養呼吸を計算します。これらのデータは、土壌呼吸に対する処理効果とその根底にある微生物メカニズムを理解するのに役立ちます。
- インキュベーションに先立ち、圃場湿潤土壌サブサンプル(10g)を秤量し、クロロホルム燻蒸−K2SO4抽出および過硫酸カリウム消化法18によって土壌MBCを定量する。
- インキュベーションの前に、圃場湿潤土壌のサブサンプル(1.0 g)を計量し、土壌の加水分解性および酸化性EEA19を測定します。
- 底部をガラス繊維紙で密封した16個のポリ塩化ビニル(PVC)コア(直径5 cm、高さ7.5 cm)に16個のフィールド湿潤土壌サブサンプル(乾燥重量15.0 g相当)を計量します。
- PVCコアをガラスビーズのベッドで裏打ちされたメイソンジャー(~1 L)に入れて、コアが湿気を吸収しないようにします。
- 手順1.4の説明に従って、4つのチャンバーのそれぞれに4つのジャーを置きます。チャンバーの電源を入れ、4つのチャンバーで同時にプログラムを起動します。
- インキュベーション中、2時間、1、2、7、14、21、28、35、および42日目に、4つのチャンバーのそれぞれにすべてのジャーを取り、ポータブルCO2 ガスアナライザーを使用して、アナライザーのカラーを各ジャーの上部に置くことにより、土壌呼吸数(Rs)を測定します。
- インキュベーションの終わり(すなわち、42日目)にすべてのジャーを破壊し、ステップ3.3で説明されているように土壌MBCを定量します。
- インキュベーションの終わり(すなわち、42日目)にすべてのジャーを破壊し、ステップ3.4に記載されているように土壌酵素活性を定量化します。
4. 温暖化効果の比較
- 2 つの連続するコレクション間で一定の呼吸数 (Rs) を仮定することにより、呼吸数に持続時間を掛けて累積呼吸(Rc) を導き出します。
- 3元配置反復測定分散分析(ANOVA)を実行して、RsとRcに対する時間、温度(温暖化)、および温度モード(温暖化シナリオ)の主な相互作用効果をテストします。さらに、MBCとEEAに対する温暖化と温暖化シナリオの影響をテストするために、双方向分散分析を実施します。
Representative Results
選択された最先端のチャンバーは、目標温度を高精度で再現し(図2A、B、E、F)、インキュベーション実験の技術的要件を満たしました。使いやすさと操作性を考えると、これは、土壌温暖化研究や植物研究などの他のアプリケーションで温度シミュレーションを改善する技術を意味しました。この手順は、テネシー州中部のスイッチグラス農地に基づく最近のケーススタディで採用されています。
研究結果は、対照治療と比較して、温暖化は両方の温暖化シナリオ(SWおよびGW)で有意に大きな呼吸損失(RsおよびRc)をもたらし、GWはSWと比較して温暖化誘発性呼吸損失(Rc)を81%対40%倍にしたことを示しました(図3)。42日目には、MBCとEEAもSWとGWで有意に異なり、MBCはGWよりもSWの方が高かった(69%対38%;図4)グリコシダーゼとペルオキシダーゼ(AG、BX、BX、CBH、NAG、AP、LAPなど)は、SWシナリオよりもGWで有意に高かった(図5)。
図1:表1から概念化された土壌温暖化実験における温度変化モードの図。 (A)ほとんどの研究で採用されている恒温(CT)。(B)大きさを変化させた一定温度(CTv)。(C,D)正と負の割合を持つ線形変化(LC)。(E,F)不規則なパターンと日周パターンを持つ非線形変化(NC)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:24時間の試験期間中のプログラミングによる目標温度とチャンバー温度。 (A、B)段階的温暖化(SW)の制御および温暖化処理の下での目標温度(灰色の線)およびチャンバー温度記録(破線)。(C,D)目標温度(灰色の線)とチャンバー温度の記録(破線)の制御下にあり、段階的な温暖化(GW)の温暖化処理。(E, F)パネル C および D のレコードについて導出された温度差。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:42日間の土壌インキュベーション実験における南西およびGWにおける対照(中空)および温暖化(暗)処理下の平均(±SE)累積土壌呼吸速度(Rc、μg CO2-C·g土壌-1)。挿入図は、累積呼吸を推定するために適用された土壌呼吸数(Rs、μgCO2-C·h-1·g土壌-1)を示し、Rsは次の測定まで一定であったと仮定した。(A)段階的な温暖化(SW)および(B)段階的な温暖化(GW)。各コレクションでN = 4。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:42日間の土壌インキュベーション実験における南西およびGWにおける制御下の平均(±SE)MBCおよび温暖化処理。 MBC =微生物バイオマス炭素;各コレクションでN = 4。Sは温暖化シナリオの有意な効果(SW対GW)を示し、 p <0.05で、3元反復測定ANOVAに基づいています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:42日間のインキュベーション実験におけるSWおよびGWにおける対照および加温処理下の平均(±SE)グリコシダーゼおよびペルオキシダーゼ(μmol活性h-1・gsoil-1)。 BX =β1,4-キシロシダーゼ; AP = 酸性ホスファターゼ; ラップ = ロイシンアミノペプチダーゼ; NAG = β-1,4-N-アセチルグルコサミニダーゼ; オックス = 酸化酵素; PHO = フェノールオキシダーゼ; あたり = ペルオキシダーゼ。各コレクションでN = 4。Sは、3元反復測定ANOVAに基づく p< 0.05での温暖化シナリオ(SW対GW)の有意な効果を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:土壌インキュベーション研究における温度制御方法と温度変化モードの文献レビュー12,13,16,17,20,21,22,23,24,25,2 6,27,28,29、30,31,32、
33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51、
52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62。
合計46件の研究を本レビューに組み入れた。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:文献レビューに基づく主要な温度変化モードと対応する温暖化シナリオ(表1)。 考えられる温度変化と温暖化条件の広い範囲を表すために、5つのモードとシナリオが確立されました。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
恒温制御方式が広く適用されている(表1)。しかし、これらの手順で実施された温度の大きさと時間パターンは、圃場条件で観察された土壌温度をうまくシミュレートしていません。過去に日周パターンを模倣した新たな努力にもかかわらず、そのような研究は乏しく、機器と手順を明確にすることができませんでした。また、精度と信頼性に関する温度シミュレーションも検証しませんでした16,17。コミュニティが土壌温暖化反応の理解を深めようと努力したため、現実的な温度と実行可能な制御で土壌孵化手順を最適化することが不可欠です。それにもかかわらず、そのような新しい方法は開発されておらず、したがって、将来のインキュベーション実験のための標準的な方法はまだ手の届かないところにあります。大きさ、振幅、季節性、持続時間、極値における地球の気温変化の複雑さが増す中、包括的な手順が強く求められています。
ここでは、将来の研究ニーズを満たすために、一定の、線形、および非線形の温度変化とその後のさまざまな温暖化シナリオを確立する能力を提供するために、洗練されたチャンバーに依存して、日周温度変化手順を操作する方法が提示されました。プロトコルには4つの重要なステップがあります。1つ目は、圃場条件で土壌温度を決定することです。土壌タイプと対象深度、および土地利用タイプは研究ごとに異なる可能性があるため、特定の調査サイトに必要な温度プローブの数は、実際の条件にできるだけ適合するように変更する必要があります。一般に、温度プローブの土壌深さは0〜20 cmで最も多くの研究ニーズを満たす必要があり、土壌温度を表すプローブの数は1〜3に制限する必要があります。重要なのは、少なくとも1つの典型的な土壌場所で長期の連続的かつ連続した温度記録を達成することです。
2番目の重要なステップは、チャンバー内の目標温度の大きさとパターンを達成するようにプログラムを設定することです。チャンバーの感度と精度が高いため(図4)、フィールド条件で観察される温度を正確に表現するようにプログラムすることが可能です。現在のプロトコルでは、チャンバー内の目標として観測された時間ごとの温度しか提示されていませんが、この手順により、30分、15分、またはそれよりも短いなど、より頻繁な土壌温度モニタリングを実現できます。それにもかかわらず、目標温度とチャンバー温度のテストは24時間にわたって実施する必要があり、実験の前に、テスト結果はすべての時点で目標温度とチャンバー温度の間で0.1°C未満の基準を満たしている必要があります。シミュレーションのために温度観測が頻繁に選択されるほど、実験の前にチャンバー内でプログラムをセットアップするためにより多くのステップが必要になります。
3番目の重要なステップは、インキュベーション自体を行うことです。土壌の不均一性の影響を減らすには63、土壌サンプルを均質化することが重要であり、処理ごとに少なくとも3回の反復が推奨されます。インキュベーションの前に、プレインキュベーション処理が必要であり、現在の手順では、実験が正式に開始される前の温度と期間をプログラムすることにより、前処理を容易にすることができます。これは、実験の乱れを減らし、インキュベーション全体をシームレスに調整するのに有利です。最後の重要なステップは、土壌温暖化反応について比較できるように、一定温度処理と温度変化処理の両方を含めることです。
このプロトコルは、温度変化の大きさ、振幅、および持続時間を操作できるように簡単に変更できます。たとえば、夏の熱波の極端な気温や気候変動による春先の突然の霜は、さまざまな期間と強度を考慮する能力に加えて、この手順を使用して表すことができます。規則的な温度と不規則な温度を組み合わせてシミュレートすることで、将来予測される長期的な複雑な温度変化の影響をシミュレートすることもできます。 表2に要約されているように、多くの異なる研究で研究されてきたこれらの温暖化シナリオは、1つの研究でまとめて達成することができます。このプロトコルは、土壌インキュベーション研究における温度をシミュレートするための洗練された方法を提供することが期待されています。幅広い応用を期待して、このプロトコルの採用は、実験室でのインキュベーションに基づく将来の土壌温暖化研究のためのより正確な方法を特定または検証するのに役立ちます。
この手順の重要な制限は、現在のプロトコルで使用されているチャンバーの容積が比較的小さいため、各チャンバーに9つのインキュベーションジャーしか収容できないことです。小さな瓶はチャンバーの容量を増やしますが、大量のチャンバーをお勧めします。新しいモデル(TestEquity 1007など)は8倍の容量を提供するため、大規模な実験に推奨されます。土壌インキュベーションにおける温度制御手順の改善にもかかわらず、水分と土壌の均質化に伴う潜在的な合併症は、現在のプロトコルを採用することによって軽減されません。
高度な温度制御手順の大きな利点を示します。正確な温度シミュレーションを取得するための信頼性が高く手頃な温度制御戦略を提供し、土壌温暖化応答をよりよく理解するために必要な土壌インキュベーション実験を改善するための実行可能な方法を提供します。一定の温度制御は広く受け入れられており、操作がロジスティック的に簡単ですが、土壌微生物群集の長期恒温のアーティファクトは、本物の土壌応答を捕捉するための努力をそらす可能性があります。他の報告された実験室の温暖化方法は、制御性および複製性がほとんどありません。現在のプロトコルは、その簡単な操作、温度シミュレーションの高精度と再現性、明示的なプログラミング、および1回の実験でさまざまな温度変化シナリオを組み合わせる能力により優れています。高精度の温度制御の実現可能性により、研究者はさまざまな温度変化シナリオを調査できます。
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
研究を支援するために使用される資金源には、米国国立科学財団(NSF)HBCU−EiR(第1900885号)、米国農務省(USDA)農業研究サービス(ARS)1890年代の教員研究サバティカルプログラム(第58-3098-9-005号)、USDA NIFA助成金(第2021-67020-34933号)、およびUSDAエバンス-アレン助成金(第1017802号)が含まれます。テネシー州ナッシュビルにあるTSUのメインキャンパス農業研究普及センター(AREC)のスタッフから受けた支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL-Syringe | Fisher Scientific | 14-826-13 | for soil respiration measurement |
| Composer Software | TestEquity | Model #107 | for incubation temperature setup |
| Environmental chamber | TestEquity | Model #107 | for soil incubation |
| Environmental gas analyzer | PP Systems | EGM5 | for soil respiration measurement |
| Filter paper | Fisher Scientific | 1005-125 | for soil incubation |
| Mason jar | Ball | 15381-3 | for soil incubation |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0520 | for soil moisture measurement |
| Plastic Zipper Seal Storage Bag | Fisher Scientific | 09-800-16 | for soil collection |
| Plate reader | Molecular devices | FilterMax F5 | for soil extracellular enzyme analysis |
| R Software | The R Foundation | R version 4.1.3 (2022-03-10) | For statistical computing |
| Refrigerator/Freezer | Fisher Scientific | 13-991-898 | for soil storation |
| Screwdriver | Fisher Scientific | 19-313-447 | for soil collection |
| Sharpie | Fisher Scientific | 50-111-3135 | for soil collection |
| Sieve | Fisher Scientific | 04-881G | for sieving soil sample |
| Silicone Septa | Duran Wheaton kimble | 224100-070 | for mason jars used for soil incubation |
| Soil auger | AMS | 350.05 | for soil collection |
| SpecWare Software | Spectrum Technologies | WatchDog E2700 (3340WD2) | for temperature collection interval setup |
| Temperature probe | Spectrum Technologies | WatchDog E2700 (3340WD2) | for soil temperature measurements |
| TOC/TN analyzer | Shimadzu | TOC-L series | for soil microbial biomass analysis |
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