Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

توليد نموذج قابل للتكرار للتنشيط المناعي للأم في منتصف الحمل باستخدام Poly (I: C) لدراسة الحساسية والمرونة في النسل

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64095
Automatic Translation
1, 1
1Center for Neuroscience, UC Davis

Summary

عدوى الأم هي عامل خطر لاضطرابات النمو العصبي. قد توضح نماذج الفئران للتنشيط المناعي للأم (MIA) تأثير العدوى على نمو الدماغ ووظيفته. هنا ، يتم توفير إرشادات عامة وإجراءات لإنتاج ذرية مرنة وحساسة بشكل موثوق بها معرضة ل MIA.

Abstract

يرتبط التنشيط المناعي للأم (MIA) أثناء الحمل باستمرار بزيادة خطر الإصابة باضطرابات النمو العصبي والاضطرابات العصبية والنفسية لدى النسل. تستخدم النماذج الحيوانية ل MIA لاختبار السببية ، والتحقيق في الآليات ، وتطوير التشخيص والعلاج لهذه الاضطرابات. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع ، فإن العديد من نماذج MIA تعاني من نقص في التكاثر وتتجاهل جميعها تقريبا جانبين مهمين من عامل الخطر هذا: (i) العديد من النسل مرن ل MIA ، و (ii) يمكن أن يظهر النسل الحساس مجموعات مميزة من الأنماط الظاهرية. لزيادة قابلية التكاثر ونمذجة كل من القابلية والمرونة ل MIA ، يتم استخدام النشاط المناعي الأساسي (BIR) لإناث الفئران قبل الحمل للتنبؤ بحالات الحمل التي ستؤدي إما إلى ذرية مرنة أو ذرية ذات تشوهات سلوكية وجزيئية محددة بعد التعرض ل MIA. هنا ، يتم توفير طريقة مفصلة لتحفيز MIA عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p.) للحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsRNA) الفيروسي المتعدد (I: C) في 12.5 يوما من الحمل. تؤدي هذه الطريقة إلى استجابة التهابية حادة في السد ، مما يؤدي إلى اضطرابات في نمو الدماغ في الفئران التي ترسم خريطة لمجالات متأثرة بالمثل في الاضطرابات النفسية والعصبية النمائية البشرية (NDDs).

Introduction

تربط الأدلة الوبائية عدوى الأمهات بزيادة خطر الإصابة بالأمراض النفسية والأمراض غير المشبعة بالأمراض ، بما في ذلك الفصام (SZ) واضطراب طيف التوحد (ASD) 1،2،3،4،5،6،7. تم تطوير نموذج الماوس MIA لاختبار السببية والدور الميكانيكي ل MIA في مسببات هذه الاضطرابات ، وكذلك لتحديد المؤشرات الحيوية الجزيئية وتطوير كل من الأدوات التشخيصية والعلاجية 4,6. على الرغم من فائدة هذا النموذج وشعبيته المتزايدة ، هناك تباين كبير في بروتوكولات تحريض MIA داخل المجال ، مما يجعل من الصعب مقارنة النتائج عبر الدراسات وتكرار النتائج 8,9. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معظم تكرارات النموذج لا تبحث في جانبين متعديين مهمين ل MIA: (i) العديد من النسل مرن ل MIA ، و (ii) يمكن أن يظهر النسل الحساس مجموعات مميزة من الأنماط الظاهرية8.

لتوليد نموذج MIA قابل للتكرار ، يجب على الباحثين الإبلاغ عن مقياس كمي واحد على الأقل لحجم MIA المستحث في السدود. للحث على MIA أثناء الحمل ، يقوم مختبرنا بإجراء حقن داخل الصفاق (i.p.) للحمض النووي الريبي الفيروسي المزدوج الذي تقطعت به السبل الذي يحاكي polyinositic: حمض متعدد الكريات [poly (I: C)]. يحفز Poly (I: C) سلسلة مناعية مشابهة لفيروسات الأنفلونزا حيث يتم التعرف عليها بواسطة المستقبل الشبيه بالرقم 3 (TLR3) 10. نتيجة لذلك ، ينشط poly (I: C) استجابة المرحلة الحادة التي تؤدي إلى ارتفاع سريع للسيتوكينات المسببة للالتهابات8،11،12. أظهرت الدراسات السابقة أن ارتفاع السيتوكينات المسببة للالتهابات ، بما في ذلك إنترلوكين -6 (IL-6) ، ضروري لإنتاج تشوهات سلوكية وأمراض عصبية في النسل نتيجة ل MIA 11،12،13. وبالتالي ، فإن مستوى IL-6 في مصل الأم الذي تم جمعه خلال ذروته عند 2.5 ساعة بعد حقن poly (I: C) هو مقياس كمي مقنع ل MIA يمكن استخدامه لمقارنة النتائج عبر المختبرات داخل الحقل.

من أجل إنشاء نموذج MIA يعالج العناصر الأساسية للترجمة للمرونة والحساسية مع بروتوكول تحريض واحد 8,14 ، يمكن للباحثين الجمع بين مناهج الحث النموذجية مع توصيف النشاط المناعي الأساسي للسد (BIR) قبل الحمل 8. في الآونة الأخيرة ، تم اكتشاف أن الفئران الإناث البكر C57BL / 6 تظهر مجموعة واسعة من استجابات IL-6 للتعرض لجرعة منخفضة من poly (I: C) قبل الحمل8. إنها فقط مجموعة فرعية من هذه الإناث التي تستمر في إنتاج ذرية حساسة ، وفقط بمقادير معينة من التنشيط المناعي كما تمليه تركيبة BIR و poly (I: C)الجرعة 8. MIA يحفز الأنماط الظاهرية في نمط U مقلوب. يظهر النسل أكبر انحرافات سلوكية وجزيئية عندما تكون السدود مناعية معتدلة ، ويصل حجم التهاب الأم ، ولكن لا يتجاوز ، نطاقا حرجا8. هنا ، يتم توفير طريقة مفصلة لكيفية إنشاء نسل مرن وحساس بشكل موثوق مع أنماط ظاهرية سلوكية متباينة نتيجة الحقن في منتصف الحمل من poly (I: C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتم تنفيذ جميع البروتوكولات بموجب موافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كاليفورنيا ديفيس (IACUC).

1. إعداد الحيوان

  1. عند الحصول على الحيوانات ، حافظ على المعلمات التالية متسقة لضمان أقصى قدر من التكاثر.
    1. موقع البائع والبائع: كما ورد سابقا ، تظهر الفئران البرية من النوع C57BL / 6J استجابات مختلفة لنفس الجرعة من poly (I: C) اعتمادا على البائع8. اختر موردا وسلالة الماوس التي تظهر استجابة متسقة. بالنسبة للتجارب هنا ، أظهرت الفئران C57BL / 6 التي تم الحصول عليها من Charles River تغييرات متسقة في السلوك بعد التعرض ل MIA في منتصف الحمل ، بينما تظهر تلك التي تم شراؤها من Taconic استجابة أكبر حجما ، مع بعض الاختلافات عبر مجموعات العلاج مقارنة بفئران نهرتشارلز 8.
    2. السلالة: الفئران C57BL / 6J هي الأكثر استخداما ، لكن الفئران BTBR والسلالات الأخرى تظهر استجابات تفاضلية ل MIA9 في منتصف الحمل. لاحظ هذه الاستجابات التفاضلية؛ لأنها تعزز قابلية استنساخ الطريقة، ويمكن أن تكون متغيرا محتملا في المساهمة في النتائج التفاضلية في النسل.
    3. لضمان الحد الأدنى من التباين ، استخدم الإناث البكر فقط لدراسات MIA8 ولاحظ التفاصيل بوضوح في الأساليب.
    4. العمر عند الشحن وفترة التأقلم: الفئران التي يتم شحنها قبل 7 أسابيع تظهر أنظمة الغدد الصماء غير المنظمة15. اسمح للحيوانات بالتأقلم لمدة لا تقل عن 48 ساعة16,17. اطلب الفئران ليتم شحنها في 7 أسابيع (± 2 أيام) وحقن BIR في 8 أسابيع (± 2 أيام).
    5. العمر عند التزاوج: أجهزة المناعة لدى الحيوانات ديناميكية على مدى حياتها. احرص على تقليل التباين عن طريق الحفاظ على العمر عند التزاوج / الحقن متسقا قدر الإمكان18،19،20. زميلة الفئران الإناث في 9 أسابيع (± 2 أيام). لا تستخدم الذكور الذين تزيد أعمارهم عن 6 أشهر للتزاوج.

2. اختبار وإعداد الكثير بولي (I: C)

  1. تحضير بولي عالي الوزن الجزيئي (I: C) كما هو موضح أدناه.
    1. الأوتوكلاف 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة للتخزين. يمكن تخزين poly (I: C) المعاد تعليقه عند -20 درجة مئوية ، لكن ذوبان الجليد المتكرر يمكن أن يؤثر على الفاعلية. يسخن حمام الماء إلى 70 درجة مئوية.
    2. باستخدام تقنية معقمة، أضف 10 مل من محلول ملحي فسيولوجي معقم (كلوريد الصوديوم 0.9٪) إلى بولي مجفف بالتجميد (I: C) باستخدام حقنة. يسخن في حمام مائي 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بالتلدين الكامل. ترفع عن النار وتترك لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. في غطاء معقم ، أضف 40 مل إضافية من المحلول الملحي الفسيولوجي إلى الزجاجة واقلبها عدة مرات للخلط. قم بإزالة الجزء العلوي من زجاجة poly (I: C) أو استخدم حقنة للقسمة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  2. تحضير بولي الوزن الجزيئي المختلط (I: C) كما هو موضح أدناه.
    1. الأوتوكلاف 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة للتخزين. يمكن تخزين بولي المعاد تعليقه (I: C) عند -20 درجة مئوية ولكن ذوبان الجليد المتكرر يمكن أن يؤثر على الفاعلية. اضبط حمام الماء على 50 درجة مئوية.
    2. باستخدام تقنية معقمة ، أضف 10 مل من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ إلى بولي مجفف بالتجميد (I: C) وثبت الغطاء. يسخن في حمام مائي على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة للسماح بالتلدين الكامل. ترفع عن النار وتترك لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. باستخدام تقنية معقمة ، قم بالقسمة في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. تطبيق poly(I:C) من خلال الحقن داخل الصفاق (i.p.) كما هو موضح أدناه.
    1. وزن الماوس لتحديد الجرعات الدقيقة. باستخدام إبرة الأنسولين 0.5 سم مكعب ، قم برسم بولي المعاد تعليقه (I: C). الماوس واقلبه حتى يتعرض البطن.
    2. باستخدام اليد الأخرى ، أدخل الإبرة على عمق 0.5 سم تقريبا بين الحلمتين الأماميتين بزاوية حوالي 45 درجة.
    3. ارسم لتحديد عدم دخول الدم أو البول إلى المحقنة قبل الحقن. في حالة حدوث أي منهما ، أعد وضع الإبرة وحاول مرة أخرى. حقن ببطء. إذا خرجت فقاعات poly (I: C) ، فمن المحتمل أن يكون الحقن تحت الجلد. لن يؤدي وضع الحقن الناجح إلى عدم سحب أي شيء بمجرد إدخال الإبرة ، وعدم حدوث تسرب بمجرد إزالتها.
  4. اختبر قوة اللوت MMW poly (I: C) كما هو موضح أدناه8.
    1. الحصول على الشكل المطلوب من poly (I: C). ستسمح بعض الشركات المصنعة للباحثين بتعليق الكثير الكامل أو الجزئي بينما يتم اختبار الفاعلية بحيث يمكن الحصول على زجاجات متعددة لاحقا في وقت واحد. عادة ، يمكن تخزينها مجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية لعدة سنوات إذا تم تجنب تجميد الذوبان.
    2. الحصول على أو تربية 30 سدا حاملا للاختبار. في E12.5 ، قم بإجراء حقن i.p. من 20 و 30 و 40 مجم / كجم في 10 فئران على الأقل لكل جرعة.
    3. في 2.5 ساعة بعد الحقن ، جمع الدم عن طريق نزيف الذيل. لاحظ أن الدم المحيطي ودم الجذع يمكن أن يختلفا في مستويات السيتوكينات ، لذا حافظ على اتساق طريقة الجمع في الدراسة.
    4. اترك الدم يتجلط طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد 12-24 ساعة ، قم بتدوير عينات الدم عند 3768 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق. اجمع السيروم واحفظه في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يتم تحليله.
    5. عزل المصل وقياس مستويات IL-6 عبر ELISA أو Luminex. حافظ على اتساق أدوات القياس نظرا لوجود تباين كبير في التركيز الكلي المقاس بطرائق ومصنعين مختلفين. تحديد حجم استجابة IL-6 اللازمة للحث على الأنماط الظاهرية باستخدام مجموعة تجريبية.

3. اختبار النشاط المناعي الأساسي (BIR)

ملاحظة: يوضح الشكل 1 الرسم التخطيطي للخطوات. استخدم بولي وزن جزيئي مختلف (I: C) لاختبار BIR مقارنة بالحمل لتقليل احتمالية الاستجابات المناعية التكيفية للمركب.

  1. اطلب شحن إناث الفئران البكر في عمر 7 أسابيع. عند الوصول ، قم بتجميع وإيواء أربعة إلى خمسة فئران في قفص والحفاظ على المجموعة حتى التزاوج. استخدم شق الأذن أو أي نظام تعريف آخر.
  2. حقن الإناث داخل الصفاق مع 5 ملغ/كغ من بولي (I:C) بعد 1 أسبوع من الوصول. في 2.5 ساعة بعد الحقن ، عندما يكون تعميم IL-6 هو أعلى6 ، اجمع الدم الكامل من الحيوانات المحقونة عن طريق قص الذيل.
  3. اترك الدم يتجلط طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد 12-24 ساعة ، قم بتدوير عينات الدم عند 3768 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق.
  4. اجمع ما لا يقل عن 32 ميكرولتر من المصل من كل عينة. تجمد عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لاختبار السيتوكينات. لقياس مستويات IL-6 بشكل أكثر اتساقا ، استخدم مقايسة متعددة الإرسال مثل Luminex. حافظ على اتساق أدوات القياس نظرا لوجود تباين كبير في التركيز الكلي المقاس بطرائق ومصنعين مختلفين.
    1. للحصول على بروتوكول فحص Luminex ، راجع Bruce et al.21.
  5. باستخدام مستويات IL-6 النسبية ، قسم الحيوانات إلى مجموعات BIR منخفضة (الربع السفلي) ومتوسطة (الربعين الأوسطين) وعالية (الربع الأعلى).

4. طريقة نزيف الذيل لجمع الدم

ملاحظة: لتجنب استخدام المهدئات التي يحتمل أن تكون مناعية ، استخدم طريقة نزيف الذيل لجمع الدم.

  1. للإعداد ، ضع حامل لحام وكوب ضبط النفس على سطح على جانب اليد غير المهيمنة. في طبق بتري 35 مم ، أضف 1-2 مل من زيت الطعام الصالح للأكل. قم بإزالة الغطاء من سدادة الدم السريعة وضعها بالقرب من الإعداد.
  2. ضع بضع طبقات من المنشفة الورقية على حامل اللحام والأنبوب الشعري الأول في مشبك ، وضعه بالقرب من المكان الذي سيتم فيه تثبيت طرف ذيل الماوس وإبقائه موازيا لسطح الطاولة. احصل على شفرة حلاقة في متناول يدك.
  3. لجمع الدم ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. في الوقت المطلوب ، أخرج الماوس من القفص وضعه تحت الكأس مع خروج ذيله من الشق في القاعدة. باستخدام شفرة حلاقة جديدة ، قم بقص نهاية الذيل (1-2 مم) واجمع أول قطرة دم في الأنبوب الشعري المثبت بحامل اللحام.
    2. اغمس أصابع اليد المهيمنة في زيت الطعام واستخدمها للضغط من قاعدة الذيل إلى الطرف ، وتوجيه طرف الذيل إلى الأنبوب الشعري لجمع قطرات الدم الناتجة. استمر حتى ~ 200 ميكرولتر من الدم.
    3. ضع غطاء نهاية صغير على الطرف المدبب للأنبوب الشعري قبل الغطاء العلوي. إذا تم وضع الغطاء العلوي أولا ، طرد العينة من الطرف المدبب للأنبوب. ضع الأنبوب في الغلاف الخارجي الواقي.
    4. السماح للتجلط بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. قم بتبريد جهاز طرد مركزي دقيق إلى 4 درجات مئوية وقم بتدوير الدم كما هو مذكور في الخطوة 3.3.

Figure 1
الشكل 1. الجدول الزمني لاختبار النشاط المناعي الأساسي للإناث البكر والتزاوج. اطلب من الفئران الوصول إلى عمر 7 أسابيع والسماح للتأقلم مع المنشأة لمدة 1 أسبوع. حقن الحيوانات مع 5 ملغ / كغ من بولي (I: C) و 2.5 ساعة في وقت لاحق سحب الدم. اترك الدم يتجلط طوال الليل ، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي عند 3768 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق. جمع المصل وتقييم مستويات IL-6 النسبية عبر ELISA أو Multiplex. في عمر 9 أسابيع ، قم بإعداد أزواج التزاوج. تم الإنشاء باستخدام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. طريقة الوزن على أساس التزاوج وحقن الحمل E12.5

ملاحظة: يوضح الشكل 2 الرسم التخطيطي للخطوات. يمكن استخدام طريقتين لإعداد أزواج التزاوج وتحديد النقطة الزمنية E12.5. الأول ، التزاوج الموقوت ، موصوف في مكان آخر22. يمكن أيضا استخدام الحسابات القائمة على الوزن لتقييم الحمل E12.523. تتمثل فائدة هذا النهج في أنه يسمح بقفل عمر السد عند التزاوج ، مما يقلل من التباين في الاستجابة المناعية. يستخدم هذا الإجراء هنا.

  1. ضع الذكور في أقفاص نظيفة واسمح لهم بالتأقلم لمدة لا تقل عن 2 ساعة. هذا يقلل من احتمال عدوان الإناث لأن الذكور سيشكلون بالفعل رائحة مهيمنة في القفص.
  2. قم بإعداد أزواج تربية من الذكور والإناث العازبة عن طريق إضافة الأنثى إلى قفص الذكر. قبل وضعها في القفص ، قم بوزنها وسجل الوزن. أضف حفنة صغيرة من بذور عباد الشمس إلى كل قفص لزيادة كفاءة التزاوج.
  3. لتحديد نطاق زيادة الوزن ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. الحصول على مجموعة اختبار من الإناث وإعداد أزواج التزاوج ، وتسجيل الوزن في وقت التزاوج.
    2. عندما تبدأ الإناث في الظهور بمظهر الحمل بشكل واضح ، قم بوزنها وتقسيمها إلى مجموعات فرعية من 8.5 جم و 9.5 جم و 10.5 جم و 11.5 جم من الوزن المكتسب. بدأت الأجنة في E12.5 للتو في تطوير أرقام مميزة في أقدامها. استخدم مورفولوجيا الجنين لتحديد متوسط زيادة الوزن للوصول إلى E12.5.
  4. في 12 يوما بعد التزاوج ، تزن الإناث وتحدد زيادة الوزن. في منشأة الاختبار ، تكتسب الإناث باستمرار 9.5-10.5 جم من وقت التزاوج إلى E12.5. حقن عن طريق i.p. جرعة بولي (I: C) الذوبانية المحددة في الخطوة 2.3.2 عندما تقع زيادة وزن الأنثى ضمن النطاق المحدد مسبقا.
  5. راقب الاستجابة لمتحف الفن الإسلامي في السدود باستخدام المعلمات التالية.
    1. السلوك المرضي: اجمع الدرجات الذاتية على مقياس من 1-3 لكيفية نشاط السدود استجابة للتعامل معها ، حيث 1 هي حركة قليلة أو معدومة استجابة للتعامل معها و 3 هي استجابة طبيعية للقبض وضبط النفس. ستظهر الحيوانات ذات الاستجابات المناعية الأكبر مقاومة أقل للتعامل مع8.
    2. استجابة الحمى: باستخدام مقياس حرارة الأشعة تحت الحمراء ، اجمع درجات حرارة ما قبل الحقن و 2.5 ساعة بعد الحقن. غالبا ما تظهر الحيوانات ذات الاستجابات المناعية الأكبر حجما انخفاض حرارة الجسم استجابة لنشاط مناعي أكبر8.
    3. تغيير الوزن: وزن الحيوانات بعد 24 ساعة من الحقن. الحيوانات ذات الاستجابات المناعية الأكبر حجما تفقد عموما المزيد من الوزن8.
    4. قياس مستويات الحمل IL-6 على النحو التالي8.
      1. في 2.5 ساعة بعد الحقن ، وجمع الدم بالطريقة المفضلة. اترك الدم يتجلط طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد 12-24 ساعة ، قم بتدوير عينات الدم عند 3768 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق.
      2. اجمع السيروم واحفظه في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يتم تحليله. عزل المصل وقياس مستويات IL-6 عبر ELISA أو Luminex. حافظ على اتساق أدوات القياس نظرا لوجود تباين كبير في التركيز الكلي المقاس بطرائق ومصنعين مختلفين.
      3. قم بإيواء السد منفردا بعد الحقن مع التخصيب المناسب مثل التعشيش وأجهزة التخصيب. حافظ على اتساق جميع عمليات التخصيب لأن التعديلات في التخصيب يمكن أن يكون لها تأثيرات كبيرة على سلوك القوارض24،25،26،27،28،29.
  6. يتراوح وقت الحمل للفئران C57 من 18.5-20.5 يوما. قم بإجراء فحوصات القمامة لتحديد ما إذا كانت الحيوانات قد ولدت ضمن هذا النطاق لضمان إجراء الحقن في الوقت الصحيح. عند التحقق من وجود فضلات ، قم بإزعاج القفص بأقل قدر ممكن. الإجهاد مباشرة بعد ولادة القمامة يمكن أن يزيد من خطر أكل لحوم البشر.

Figure 2
الشكل 2. تحريض متحف الفن الإسلامي. يتطلب تحريض MIA تقييم الحمل ، وحقن بولي (I: C) ، وفحوصات القمامة لضمان التوقيت الصحيح لالتهاب الأم. بعد تقييم يوم الحمل إما عن طريق التزاوج الموقوت أو طريقة زيادة الوزن ، قم بتوصيل حقنة i.p. من poly (I: C) عند E12.5. جمع عينة دم في 2.5 ساعة بعد الحقن لتأكيد التنشيط المناعي وتحديد مستوى تنشيط IL-6. سيولد الفضلات في حوالي E18.5-E20.5. تم الإنشاء باستخدام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. التحقيق في التغيرات في السلوك في MIA البالغين والسيطرة على النسل (اختياري)

  1. بدءا من P60 وقبل إجراء الاختبارات السلوكية ، تأقلم الحيوانات مع الاتصال البشري بمعالجة لطيفة لمدة 1 دقيقة يوميا لمدة 3 أيام متتالية. تأكد من عدم حدوث أيام تغيير القفص في نفس اليوم الذي يتم فيه إجراء الاختبارات السلوكية.
  2. اسمح دائما للفئران بالتأقلم مع غرفة الاختبار لمدة 30-60 دقيقة قبل بدء الاختبارات السلوكية. استخدم غرف ذات إضاءة خافتة (15-20 لوكس) لتقليل القلق.
  3. للعناية المتكررة ، ضع الفئران بمفردها في أقفاص نظيفة وخالية من الفراش مع أغطية. باستخدام الكاميرا ، سجل الفئران في هذه الأقفاص لمدة 20 دقيقة. أول 10 دقائق تعمل كفترة تأقلم ، والأخيرة 10 دقائق هي فترة الاختبار.
  4. باستخدام مقاطع الفيديو المحفوظة وساعة توقيت ، سجل وقت الاستمالة التراكمي لكل ماوس خلال فترة الاختبار البالغة 10 دقائق. تشمل السلوكيات الأخرى التي يمكن تسجيلها من مقاطع الفيديو هذه التربية (الوقوف على رجليها الخلفيتين) والتجميد والقفز8.
  5. استخدم اختبارات شائعة أخرى لنموذج MIA مثل تثبيط النبضات (PPI) 14،30،31،32 ، المجال المفتوح 12،33،34 ، النهج الاجتماعي المكون من 3 غرف13،35،36 ، التعرف على الأشياء الجديدة 37 ، y-maze 30 ، مرتفع بالإضافة إلى متاهة33 ، وتكييف الخوف من السياق / الإشارة 38.
  6. النشاف المناعي بعد الولادة8 (اختياري)
    1. في P0 ، قم بقطع الرأس بسرعة وتشريح أنسجة المخ الجنينية في HBSS ، وقم بتجميدها في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    2. قم بتعطيل العينات باستخدام صوتنة مسبار بسعة 20٪ لمدة 5 ثوان في 2x Laemmli buffer ، ثم تشوه عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحلل أجهزة الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اجمع المادة الطافية واحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    3. قم بقياس محتوى البروتين الكلي باستخدام مجموعة مقايسة بروتين BCA التجارية ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، واستخدم ألبومين مصل الأبقار كمعيار للمعايرة.
    4. أضف ثنائي ثيوثريتول كعامل اختزال للعينات كتركيز نهائي قدره 100 mM. يسخن إلى 85 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة قبل التحميل على هلام.
    5. قم بتشغيل 5 ميكروغرام / حارة من البروتين في ظل ظروف الاختزال على 7.5٪ من المواد الهلامية TGS وانقلها كهربائيا إلى أغشية PVDF. كتلة الأغشية مع حجب العازلة واحتضان مع الأجسام المضادة المختارة.
    6. اغسل ثلاث مرات باستخدام TBS + 0.05٪ Tween 20 واحتضان الأغشية لمدة 45 دقيقة بأجسام مضادة ثانوية موسومة بالفلورسنت.
    7. اغسل أربع مرات إضافية في TBS / Tween 20 ونتائج الصورة. توحيد النتائج باستخدام β-توبولين ، المكتشفة باستخدام مضاد β توبولين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ليست كل الحيوانات المعرضة ل 30 ملغم / كغم من بولي (I: C) في E12.5 تنتج ذرية مع تشوهات سلوكية متسقة8،31. على الرغم من أن كلا من 30 مجم / كجم و 40 مجم / كجم من poly (I: C) ينتجان بشكل موثوق سلوكيات مرضية في السدود ، بما في ذلك انخفاض مستويات النشاط ، والاستجابات المنخفضة الحرارة ، وفقدان الوزن ، ويسبب أيضا ارتفاعات كبيرة في IL-6 ، فقط مجموعة فرعية من الفضلات المعرضة ل MIA ستستمر في تطوير تشوهات سلوكية في مجالات مماثلة لتلك التي لوحظت في الطب النفسي البشري و NDDs (الشكل 3A-C) 8 . كما أن جرعة أقل من 20 ملغم / كغم من بولي (I: C) تحفز أيضا السلوك المرضي وفقدان الوزن ، ولكن على عكس الجرعات العالية ، فإنها لا تنتج باستمرار استجابات IL-6 عالية بما يكفي من حيث الحجم للحث على الانحرافات السلوكية في النسل على الرغم من أن استجابات IL-6 مرتفعة أعلى بكثير من تلك الموجودة في السدود المحقونة بالمحلول الملحي (الشكل 3D)8.

Figure 3
الشكل 3. جرعات مختلفة من بولي (I: C) تؤدي إلى تأثيرات تفاضلية في السدود. (أ) شهدت السدود المعرضة ل 20 مغ/كغ أو 30 مغ/كغ أو 40 مغ/كغ من البولي (I:C) انخفاضا في النشاط على نطاق ذاتي (ANOVA أحادي الاتجاه؛ P < 0.0001). (باء) أظهرت السدود المعرضة فقط ل 30 مغ/كغ من البولي(I:C) تغيرا كبيرا في درجة الحرارة في شكل استجابة منخفضة الحرارة (ANOVA أحادي الاتجاه؛ F3,35 = 4.289 ، P < 0.05). (ج) تسبب كل من 30 مغ/كغ من بولي (I:C) و40 مغ/كغ من بولي (I:C) في فقدان كبير للوزن (ANOVA أحادي الاتجاه؛ أظهر F7,187 = 26.93 ، P < 0.0001) و (D) مستويات IL-6 مرتفعة فوق العتبة المطلوبة لإحداث تغييرات سلوكية (ANOVA أحادي الاتجاه ؛ F3,35 = 25.54 ، P < 0.0001). (ه) النشاط المناعي الأساسي في إناث الحيوانات C57BL / 6J متساوية المنشأ متغير للغاية ، وتصنيف الإناث BIR إلى مجموعات منخفضة ومتوسطة وعالية يسمح للباحثين بالتنبؤ بالنسل الذي من المرجح أن يكون عرضة لتأثير MIA. تمثل الأشرطة متوسط ± SEM. تم تعديل هذا الرقم من Estes et al.8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بشكل غير متوقع ، تظهر إناث الفئران البكر C57BL / 6 نشاطا مناعيا أساسيا متغيرا تماما (BIR) لجرعة منخفضة من poly (I: C) (5 مجم / كجم من poly (I: C)) قبل الحمل على الرغم من أنها متساوية المنشأ ، ولا يرتبط هذا التباين بالوزن (الشكل 3E ، الشكل التكميلي 1) 8. السدود المحقونة ب 5 ملغم / كغم من بولي (I: C) قبل الحمل الذين تكون استجاباتهم IL-6 في منتصف 50٪ (سدود BIR المتوسطة) تنتج ذرية ذكور بالغة مع تغيرات في مستويات بروتين STAT3 و MEF2 وهيدروكسيلاز التيروزين في الأنسجة المخططة P0 (الشكل 4C-E) 8. كما يظهر النسل الذكور لسدود BIR المتوسطة المعرضة ل 30 ملغم / كغم من poly (I: C) انخفاضا في كثافة المشبك العصبي ، وارتفاع معقد التوافق النسيجي الرئيسي I (MHCI) في الثقافة العصبية المنفصلة (الشكل 4A ، B) 8. السدود المحقونة ب 5 ملغم / كغم من بولي (I: C) قبل الحمل الذين تكون استجاباتهم IL-6 في منتصف 50٪ (سدود BIR المتوسطة) تنتج بشكل موثوق ذرية ذكور بالغة ذات سلوكيات متكررة مرتفعة وسلوك استكشافي منخفض عند تعرضها ل 30 مجم / كجم من poly (I: C) عند E12.5 (الشكل 5A-F) 8.

على العكس من ذلك ، فإن الفئران من مجموعة BIR العالية (مع مستويات IL-6 في أعلى 25٪ عند تعرضها ل 5 مجم / كجم من poly (I: C) قبل الحمل) تنتج ذرية موثوقة مع عدم وجود تغييرات سلوكية متكررة بعد MIA. ومع ذلك ، فإن النسل الذكور لهذه السدود العالية BIR تظهر سلوكا استكشافيا مرتفعا بعد MIA (الشكل 5D) 8. تشير هذه النتائج معا إلى أن MIA يمكن أن يسبب نتائج تفاضلية في النسل ، اعتمادا على BIR8 للسد.

Figure 4
الشكل 4. جرعة وسيطة من poly(I:C) و BIR تؤدي إلى أكبر النتائج في نماذج MIA. (أ) أظهرت الخلايا العصبية القشرية من النسل المعرض للتنشيط المناعي للأم في منتصف الحمل زيادة كبيرة في عرض MHCI فقط عندما أعطيت السدود 30 مغ/كغ من بولي (I:C) (أحادي الاتجاه ANOVA; F3,19 = 5.156 ، P < 0.01). (ب) في المقابل ، أدت جميع الجرعات (20 مجم / كجم ، 30 مجم / كجم ، و 40 مجم / كجم) إلى انخفاض كبير في كثافة المشبك العصبي في مزرعة الخلايا العصبية المنفصلة (ANOVA أحادي الاتجاه ؛ ANOVA; F3,43 = 11.01 ، P < 0.0001). (جيم - ه) تظهر البقع الغربية المخططة P0 ارتفاع STAT3 و MEF2A و TH ، فقط في الحيوانات التي كان لدى أمهاتها BIRs متوسطة وتعرضت ل 30 ملغم / كغم من poly(I:C) (أحادي الاتجاه ANOV; MEF2A: F3,24 = 3.968 ، P < 0.05 ؛ STAT3: F3,24 = 6.401 ، P < 0.01 ؛ TH: F3,24 = 3.668 ، P < 0.05). تمثل الأشرطة متوسط ± SEM. تم تعديل هذا الرقم من Estes et al.8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لا يمكن مقارنة الحيوانات الحساسة في مجموعات BIR 30 ملغم / كغم و BIR 30 ملغم / كغم المرتفعين بالضوابط فحسب ، بل أيضا بالحيوانات المرنة. ينتج عن حقن سدود BIR المتوسطة بجرعة أعلى تبلغ 40 مجم / كجم من poly (I: C) نسل بدون تغييرات كبيرة في السلوك تم تحديده باستخدام المقايسات المستخدمة حتى الآن (الشكل 5A-F) 8. هذا يشير إلى وجود علاقة U مقلوبة بين التنشيط المناعي والقابلية للإصابة ب MIA.

Figure 5
الشكل 5. يظهر النسل الذكور من السدود المعرضة لجرعة وسيطة من poly (I: C) أكبر التغييرات في السلوك. (أ-و) ذرية الذكور من السدود المعرضة ل 30 مغ/كغ من بولي (I:C) (ANOVA; F3,27 = 8.775 ؛ منخفض: P = 0.0427; متوسط: P = 0.0062 ؛ عالية: (P = 0.9568) ولكن ليس 20 ملغم / كغم أو 40 ملغم / كغم من بولي (I: C) تظهر تغيرات في الاستمالة المتكررة وسلوك التربية الاستكشافية. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الحيوانات في مجموعة العلاج 30 ملغم / كغم بولي (I: C) أشكالا متباينة من الحساسية ، ويظهر النسل الذكور لأمهات BIR المتوسطة سلوكا متكررا متزايدا وانخفاضا في الاستكشاف ، بينما لا يظهر النسل الذكور لأمهات BIR العالية أي تغيير في السلوك المتكرر ، ولكن لديهم سلوك استكشافي متزايد (A ، D ; متداخلة في اتجاه واحد ANOVA ؛ F3,15 = 9.407 ، منخفض: P = 0.4910 ؛ متوسطة: P < 0.001; مرتفع: P = 0.0117). لا يبدو أن النسل الذي تعرض ل 20 ملغم / كغم من بولي (I: C) يستوفون عتبة التنشيط المناعي المطلوبة لتغيير تطور الخلايا العصبية لأنهم لم يظهروا أي تغييرات في السلوكيات التي تم اختبارها ، في حين أن النسل الذي تعرض ل 40 ملغم / كغم من بولي (I: C) كانوا أيضا في الغالب مرنين لآثاره (B ، C ، E ، F). تمثل الأشرطة متوسط ± SEM. تم تعديل هذا الرقم من Estes et al.8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1. لا يرتبط النشاط المناعي الأساسي بوزن الحيوان. تظهر إناث الفئران البكر مجموعة كبيرة من استجابات IL-6 ل 5 ملغم / كغم من Poly (I: C) المحقون قبل الحمل بطريقة مستقلة عن الوزن ، R2 = 0.0086 ، P = 0.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تغير عدوى الأم مسار نمو الدماغ لدى البشر وفي كل من القوارض والرئيسيات غير البشرية4،5،7. هنا ، تم تحديد إجراء لحث MIA في الفئران في نقطة زمنية في منتصف الحمل باستخدام poly (I: C). تتضمن هذه الطريقة تقييم BIR قبل الحمل ، مما يزيد من قابلية التكاثر ويوفر فرصة للتحقيق ميكانيكيا في الآليات التي تؤدي إلى مرونة وقابلية النسل ل MIA8. بعد MIA ، تولد السدود من مجموعة BIR المتوسطة (مع مستويات IL-6 في منتصف 50٪) ذرية بالغة بشكل موثوق مع تغيرات في السلوكيات المتكررة ، وتغيرات في مستويات MHCI على الخلايا العصبية من ذرية حديثي الولادة على النحو الذي تحدده الكيمياء المناعية ، ومستويات مرتفعة من هيدروكسيلاز التيروزين المخطط ، MEF2 ، وبروتين STAT3 من ذرية حديثي الولادة على النحو الذي تحدده اللطخة الغربية8.

إن استخدام MIA كنموذج بيئي يمنح أهمية انتقالية متزايدة لأنه يفي بمعايير نموذج المرض: البناء والوجه والصلاحية التنبؤية7. ومع ذلك ، كما هو الحال مع أي نموذج بيئي ، يجب توخي الحذر الشديد لتقليل المتغيرات الخارجية. يمكن للعديد من العوامل مثل البائع ، والكثير (I: C) ، وتوقيت الحقن ، وعمر السدود ، وحتى نظام القفص أن تغير تأثير MIA على النسل8،9،39. كما ذكرنا سابقا ، فإن قوة poly (I: C) غير متسقة بين الشركات المصنعة والحصص وحتى الزجاجات داخل الكثير بسبب التباين العالي في تركيزات dsRNA والأوزان الجزيئية 8,40. نظرا لأن هذا التباين يمكن أن يزيد من عدم التجانس في الاستجابة المناعية للأم ، فمن الأهمية بمكان أن تحدد المختبرات الجرعة الفعالة لكل دفعة للحفاظ على أقصى قدر من التكاثر في الأنماط الظاهرية التي يمكن ملاحظتها. على سبيل المثال ، لوحظ أن فئران نهر تشارلز المعرضة ل MIA تنتج BIR متسقة والأنماط الظاهرية المعتمدة على الجرعة في النسل ، وقد تتأثر الفئران من Taconic أيضا بطريقة مماثلة مع بعض الاختلافات عبر مجموعات العلاج8. بالإضافة إلى ذلك ، من الأهمية بمكان أن يقوم الباحثون بتوحيد ممارسات التربية والاحتفاظ بسجلات مفصلة لزيادة قابلية استنساخ النموذج. حدد المنشور الذي كتبه Kentner et al. العديد من التفاصيل التي يجب تضمينها في التقارير التجريبية ويمكن أن تعمل أيضا كقائمة مرجعية للباحثين أثناء وضع اللمسات الأخيرة على بروتوكولاتهم9.

يتم تقييم BIR باستخدام مستويات مصل الدم النسبية إنترلوكين -6 (IL-6) من إناث الفئران البكر. يكشف تقسيم تلك الفئران إلى ثلاث مجموعات (منخفضة ومتوسطة وعالية) عن نماذج مرنة وحساسة قابلة للتكرار8. نظرا لأن BIR هي مسألة تركيز نسبي ل IL-6 ، فليس من الضروري إجراء اختبار صارم لفعالية poly (I: C) عالية الوزن الجزيئي كما هو ضروري مع poly (I: C) ذات الوزن الجزيئي المختلط المستخدم للحث على تنشيط المناعة للأم أثناء الحمل. BIR هو مقياس جديد نسبيا قد لا يقلل من جميع النتائج المتغيرة.

قد تختلف الاستجابات المناعية للسدود أثناء تعرضها لأول مرة لجرعات الحمل من poly (I: C) عن استجابتها أثناء حالات الحمل والتعرض اللاحقة. تحقيقا لهذه الغاية ، فإن استخدام الإناث البكر يقلل من احتمال التباين الذي يمكن أن تحدثه التغيرات في الاستجابة المناعية الناتجة عن الحمل المتعدد. الطريقة القائمة على الوزن لتقدير النقطة الزمنية للحمل ضرورية لأن الفئران غالبا لا تحمل خلال أول 24 ساعة من التزاوج.

من المهم ملاحظة أن هناك تحديات إحصائية مع هذا النموذج. نظرا لأن MIA مستحث في السدود ، لا يمكن اختيار النسل بشكل عشوائي في ظروف العلاج. وبالتالي ، يجب اعتبار كل فضلة n من 19،41،42 ، ويجب حساب متوسط الأفراد داخل تلك القمامة لإنشاء كل نقطة بيانات. لذلك فإن التصميم الإحصائي الأنسب لهذه البيانات يستخدم التحليلات المتداخلة8. هناك حاجة إلى ما لا يقل عن ستة لترات لكل مجموعة (جرعة BIR x) للكشف بشكل موثوق عن التغيرات في التدابير السلوكية والجزيئية. وقد لوحظت اختلافات كبيرة بين الجنسين على نطاق واسع في أدبيات وزارة الداخلية ، وبالتالي لا ينبغي أبدا تجميع الجنسين في التحليلات8،9،43،44.

BIR هي أداة تنبؤية جديدة نسبيا ، ولم يتم تعريفها بعد من حيث التأثير الميكانيكي. لا يزال من غير المعروف ما إذا كان BIR مرتبطا باستجابات مناعية حملية محددة ، ولكن استجابة IL-6 للفئران قبل الحمل لا تعادل استجابتها أثناء الحمل8. لذلك يمثل BIR مقياسا تنبؤيا مترابطا ، وهناك المزيد من الأبحاث الجارية لتحديد أصوله.

على الرغم من التباين المتأصل في نموذج MIA ، لا يمكن لأي نموذج بيئي آخر للاضطرابات العصبية والنفسية و NDDs حتى الآن أن يوفر نفس المستوى من الأهمية الانتقالية. يعد التحضير والاختبار التجريبي المكثف ضروريين لتحقيق الاتساق في نموذج MIA ، لكن متانة نتائج النمط الظاهري تعوض عن هذا الاستثمار الأولي. في نهاية المطاف، توفر النماذج الحيوانية لمتحف الفن الإسلامي إمكانات لا مثيل لها للتحقيق في عامل خطر واحد يخلق مجموعات متباينة ومتميزة من التغيرات السلوكية والجزيئية في النسل، مماثلة لتلك التي لوحظت في البشر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتورة ميكا إستس على مثابرتها في معالجة التباين في نموذج MIA للفأر وجميع المساهمين في Estes et al.8 على عملهم الذي أدى إلى تطوير بروتوكول الأساليب الموصوف هنا. تم دعم البحث المذكور هنا من قبل NIMH 2P50 MH106438-06 (AKM) و NIMH T32MH112507 (K.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% NaCl physiological endotoxin free saline Sigma-Aldrich 7647-14-5 Control and vehicle for Poly(I:C)
35mm petri dish Thomas Scientific 1219Z45 Used to hold oil during tail bleed
7.5% TGX gels Bio-rad 4561084 Optional
Ancare Nestlets Fisher Scientific NC9365966 Optional
anti-β-tubulin Millipore MAB3408 Optional
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I Bio-rad 171I50001
Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate Bio-rad 171304070M
Bovine Serum Albumin ThermoFisher 23209 Optional
Centrifuge Eppendorf 5810R Optional
Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle Spectrum 552-58457-083
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779-10G Optional
Environmental enrichment Bio-serv K3327 and K3322 Optional
Ethovision Noldus Ethovision Optional
Fluorsecent-tagged seondary ntibodies Li-cor 925-32213 and 925-68072 Optional
Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed) Various vendors Use to lubricate tail during tail bleeds
HBSS ThermoFisher 14060040 Optional
High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Invivogen #tlrl-pic-5 Used to establish females' BIR
Humane Mouse Restrainer AIMS 1000 Used to restrain mouse during tail bleeds
Image Studio Software Licor 5.2 Optional
Laemmli buffer Bio-rad 1610737EDU Optional
Luminex200 ThermoFisher APX10031
Microvette CB300 300μl Serum capillary tube Sarstedt 16.440.100
Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Sigma-Aldrich #P0913 Gestational induction of MIA
monoclonal anti-MEF2A AbCam ab76063 Optional
monoclonal anti-STAT3 Cell signaling 12640S Optional
Observer Noldus Observer Optional
Odyssey blocking buffer (TBS) Li-cor 927-50003 Optional
Odyssey CLx imaging system Li-cor 9140 Optional
Omnipure PBS Millipore 65054L Optional
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23227 Optional
polyclonal anti_TH Pel-Freez P4101-150 Optional
PVDF membrane Bio-rad 162-0177 Optional
Qsonica Sonicator Q500 Fisher Scientific 15-338-282 Optional
Quick blood stopper Petco 17140
Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile USA Scientific 1615-5500
Soldering stand Amazon B08Y12QC73 Used to hold capillary tube during tail bleeds
Sunflower seeds Bio-serv S5137-1 Use to increase breeding efficiency
The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set, Bio-rad 171G5007M
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Optional
Tween 20 Bio-rad 23209 Optional

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adams, W., Kendell, R. E., Hare, E. H., Munk-Jørgensen, P. Epidemiological evidence that maternal influenza contributes to the aetiology of schizophrenia. An analysis of Scottish, English, and Danish data. The British Journal of Psychiatry: The Journal of Mental Science. 163 (4), 522-534 (1993).
  2. Brown, A. S., et al. Serologic evidence of prenatal influenza in the etiology of schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 61 (8), 774-780 (2004).
  3. Brown, A. S., Derkits, E. J. Prenatal infection and schizophrenia: a review of epidemiologic and translational studies. The American Journal of Psychiatry. 167 (3), 261-280 (2010).
  4. Patterson, P. H. Immune involvement in schizophrenia and autism: etiology, pathology and animal models. Behavioural Brain Research. 204 (2), 313-321 (2009).
  5. Patterson, P. H. Maternal infection and immune involvement in autism. Trends in Molecular Medicine. 17 (7), 389-394 (2011).
  6. Estes, M. L., McAllister, A. K. Immune mediators in the brain and peripheral tissues in autism spectrum disorder. Nature Reviews. Neuroscience. 16 (8), 469-486 (2015).
  7. Estes, M. L., McAllister, A. K. Maternal immune activation: Implications for neuropsychiatric disorders. Science. 353 (6301), 772-777 (2016).
  8. Estes, M. L., et al. Baseline immunoreactivity before pregnancy and poly(I:C) dose combine to dictate susceptibility and resilience of offspring to maternal immune activation. Brain, Behavior and Immunity. 88, 619-630 (2020).
  9. Kentner, A. C., et al. Maternal immune activation: reporting guidelines to improve the rigor, reproducibility, and transparency of the model. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 245-258 (2019).
  10. Zhou, Y., et al. TLR3 activation efficiency by high or low molecular mass poly I:C. Innate Immunity. 19 (2), 184-192 (2013).
  11. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain, Behavior and Immunity. 25 (4), 604-615 (2011).
  12. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  13. Choi, G. B., et al. The maternal interleukin-17a pathway in mice promotes autism-like phenotypes in offspring. Science. 351 (6276), 933-939 (2016).
  14. Meyer, U. Neurodevelopmental resilience and susceptibility to maternal immune activation. Trends in Neurosciences. 42 (11), 793-806 (2019).
  15. Laroche, J., Gasbarro, L., Herman, J. P., Blaustein, J. D. Reduced behavioral response to gonadal hormones in mice shipped during the peripubertal/adolescent period. Endocrinology. 150 (5), 2351-2358 (2009).
  16. Aguila, H. N., Pakes, S. P., Lai, W. C., Lu, Y. S. The effect of transportation stress on splenic natural killer cell activity in C57BL/6J mice. Laboratory Animal Science. 38 (2), 148-151 (1988).
  17. Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. American Journal of Veterinary Research. 43 (9), 1654-1657 (1982).
  18. Menees, K. B., et al. Sex- and age-dependent alterations of splenic immune cell profile and NK cell phenotypes and function in C57BL/6J mice. Immunity & Ageing. 18 (1), 3 (2021).
  19. Shaw, A. C., Goldstein, D. R., Montgomery, R. R. Age-dependent dysregulation of innate immunity. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 875-887 (2013).
  20. Starr, M. E., Saito, M., Evers, B. M., Saito, H. Age-associated increase in Cytokine production during systemic inflammation-II: the role of IL-1beta in age-dependent IL-6 upregulation in adipose tissue. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 70 (12), 1508-1515 (2015).
  21. Bruce, M., et al. Acute peripheral immune activation alters cytokine expression and glial activation in the early postnatal rat brain. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 200 (2019).
  22. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  23. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
  24. Hutchinson, E., Avery, A., VandeWoude, S. Environmental enrichment for laboratory rodents. ILAR Journal. 46 (2), 148-161 (2005).
  25. Bayne, K. Environmental enrichment and mouse models: Current perspectives. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (2), 82-90 (2018).
  26. Toth, L. A., Kregel, K., Leon, L., Musch, T. I. Environmental enrichment of laboratory rodents: the answer depends on the question. Comparative Medicine. 61 (4), 314-321 (2011).
  27. Sparling, J. E., Barbeau, K., Boileau, K., Konkle, A. T. M. Environmental enrichment and its influence on rodent offspring and maternal behaviours, a scoping style review of indices of depression and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 197, 172997 (2020).
  28. Xiao, R., Ali, S., Caligiuri, M. A., Cao, L. Enhancing effects of environmental enrichment on the functions of natural killer cells in mice. Frontiers in Immunology. 12, 695859 (2021).
  29. Girbovan, C., Plamondon, H. Environmental enrichment in female rodents: considerations in the effects on behavior and biochemical markers. Behavioural Brain Research. 253, 178-190 (2013).
  30. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  31. Mueller, F. S., et al. neuroanatomical, and molecular correlates of resilience and susceptibility to maternal immune activation. Molecular Psychiatry. 26 (2), 396-410 (2021).
  32. Nyffeler, M., Meyer, U., Yee, B. K., Feldon, J., Knuesel, I. Maternal immune activation during pregnancy increases limbic GABAA receptor immunoreactivity in the adult offspring: implications for schizophrenia. Neuroscience. 143 (1), 51-62 (2006).
  33. Babri, S., Doosti, M. H., Salari, A. A. Strain-dependent effects of prenatal maternal immune activation on anxiety- and depression-like behaviors in offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 164-176 (2014).
  34. Vigli, D., et al. Maternal immune activation in mice only partially recapitulates the autism spectrum disorders symptomatology. Neuroscience. 445, 109-119 (2020).
  35. Malkova, N. V., Yu, C. Z., Hsiao, E. Y., Moore, M. J., Patterson, P. H. Maternal immune activation yields offspring displaying mouse versions of the three core symptoms of autism. Brain, Behavior, and Immunity. 26 (4), 607-616 (2012).
  36. Shin Yim, Y., et al. Reversing behavioural abnormalities in mice exposed to maternal inflammation. Nature. 549 (7673), 482-487 (2017).
  37. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 930-941 (2010).
  38. Zuckerman, L., Weiner, I. Maternal immune activation leads to behavioral and pharmacological changes in the adult offspring. Journal of Psychiatric Research. 39 (3), 311-323 (2005).
  39. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  40. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biological Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  41. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neuroscience. 14, 37 (2013).
  42. Spencer, S. J., Meyer, U. Perinatal programming by inflammation. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 1-7 (2017).
  43. Mouihate, A., Kalakh, S. Maternal Interleukin-6 hampers hippocampal neurogenesis in adult rat offspring in a sex-dependent manner. Developmental Neuroscience. 43 (2), 106-115 (2021).
  44. Zhang, Z., van Praag, H. Maternal immune activation differentially impacts mature and adult-born hippocampal neurons in male mice. Brain, Behavior, and Immunity. 45, 60-70 (2015).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 186 ،
توليد نموذج قابل للتكرار للتنشيط المناعي للأم في منتصف الحمل باستخدام Poly (I: C) لدراسة الحساسية والمرونة في النسل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prendergast, K., McAllister, A. K.… More

Prendergast, K., McAllister, A. K. Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using Poly(I:C) to Study Susceptibility and Resilience in Offspring. J. Vis. Exp. (186), e64095, doi:10.3791/64095 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter