Summary
טכניקת הקילוף-כתם היא שיטת הכנה לרשת cryo-EM המאפשרת הפרדת דגימות ביולוגיות רב-שכבתיות ומרוכזות לשכבות בודדות כדי להפחית את העובי, להגדיל את ריכוז הדגימה ולהקל על עיבוד התמונה.
Abstract
טכניקת הכנת רשת קריו-EM עם כתם קליפה היא שיטת הזרקה אחורית ששונתה באופן משמעותי במטרה להשיג הפחתה בשכבות של דגימות רב שכבתיות. הסרה זו של שכבות לפני הקפאת הדגימה יכולה לסייע בהפחתת עובי הדגימה לרמה המתאימה לאיסוף נתוני cryo-EM, שיפור שטוחות הדגימה והקלה על עיבוד התמונה. טכניקת הקליפה מאפשרת הפרדה של ממברנות מולטי-למלריות לשכבות בודדות, של גבישים דו-ממדיים שכבתיים לגבישים בודדים, ושל מבנים מוערמים דמויי יריעות של חלבונים מסיסים כדי שגם אותם ניתן להפריד לשכבות בודדות. עובי הדגימה הגבוה של דגימות מסוג זה מהווה לעתים קרובות בעיות בלתי עבירות לאיסוף נתונים cryo-EM ועיבוד תמונה cryo-EM, במיוחד כאשר יש להטות את שלב המיקרוסקופ לצורך איסוף נתונים. יתר על כן, רשתות של ריכוזים גבוהים של כל אחת מהדגימות הללו יכולות להיות מוכנות לאיסוף נתונים יעיל מכיוון שניתן להגדיל את ריכוז הדגימות לפני הכנת הרשת ולהתאים את טכניקת הקילוף-כתם כדי לגרום לפיזור צפוף של דגימה חד-שכבתית.
Introduction
טכניקת ה-peel-blot פותחה על מנת להפריד גבישים דו-ממדיים מוערמים של חלבוני ממברנה לשכבות בודדות כדי לקבל דגימות דקות מתאימות לאיסוף נתונים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של cryo-EM ולהקל על עיבוד תמונה1. הפרוטוקול מתאים באופן דומה לסוגים אחרים של דגימות מולטי-לאמלר וכן להשגת ריכוזי דגימה גבוהים של כל אחד מסוגי הדגימה ברשת מבלי להגדיל את העובי ב-Z.
הפחתת שכבות הדגימה לשכבה אחת מושגת על ידי הפעלת שילוב של לחץ נימי וכוחות גזירה בפרוטוקול המרחיב באופן משמעותי את שיטת ההזרקה האחורית2 ומשנה אותה. שלב ראשון של הכתמה גורם לכריכה הדוקה ולהיצמדות לסרט הפחמן ולפס רשת משני צדי הדגימה הרב-שכבתית במהלך הכתם על תת-מיקרון במקום גודל הנקבובית של נייר הסינון 20-25 מיקרומטר בשיטת ההזרקה האחורית. ההפרדה, או הקילוף, של שכבה בודדת מתרחש כאשר מכריחים את הפרדת השכבות הדחוקות ברגע שהרשת נלחצת אנכית על טיפת טרהלוז, מה שמאלץ את סרט הפחמן להתרחק מפס הרשת (איור 1). מיקום מחדש של סרט הפחמן הרחק מנקודת המגע המקורית עם סרגל הרשת מתרחש בשלב הבא, כאשר הרשת מוכתמת שוב על נייר סינון תת-מיקרוני. ניתן למטב את מספר האיטרציות של שלבים אלה עבור דוגמאות ספציפיות. יתר על כן, ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי להגדיל את ריכוזי הדגימה תוך הימנעות מצבירה ב- Z. בשל ההסתמכות על הדבקות במוט הרשת וביריעת הפחמן, כמו גם הפרדה כוחנית, גישה זו עשויה שלא להתאים למולקולות שבריריות מאוד כגון חלבונים עדינים ו/או לא יציבים וקומפלקסים של חלבונים.
טכניקת הקליפה אינה דורשת ציוד מיוחד או אספקה יקרה. עם זאת, תחולת דגימות ספציפיות תדרוש שיקולים זהירים של פרמטרים ביולוגיים. ההחלטה קלה יותר עבור גבישים דו-ממדיים מכיוון שסרט פחמן נדרש כדי להבטיח שטוחות, אך מניפולציה באמצעות טכניקת הקליפה-כתם עשויה להשפיע על השלמות הביולוגית של הדגימה או הסדר הגבישי. התאמת טכניקת הקילוף-כתם לחלקיקים בודדים מוגבלת וניתן לבחון אותה עבור אלה הזקוקים לסרט פחמן ויציבים למניפולציה. דגימות עם אינטראקציות ביולוגיות קריטיות בין שכבות עשויות שלא להתאים לאפיון בעזרת טכניקת הקילוף-כתם בשל השיבוש של אינטראקציות כאלה.
טכניקת הקלף-כתם ("peel-blot") ממוטבת במהירות הרבה ביותר על ידי בדיקה וסינון עם כתם שלילי או דגימות לא מוכתמות על ידי TEM בטמפרטורת החדר. לאחר זיהוי המספר האופטימלי של איטרציות כתמי קליפה, ניתן לקבוע את הזמן לשליטה בעובי לפני הוויטריפיקציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שלבי הכנה לטכניקת כתם הקליפה
הערה: ההכנה דורשת שהפריטים הבאים יוצבו בצמוד זה לזה.
- ערמו שתי חתיכות של נייר מסנן נקבוביות בגודל 20-25 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).
- מניחים סרט פרפין באורך ~8X10 ס"מ בצמוד לנייר הסינון כשהנייר פונה כלפי מעלה.
- הניחו פיסת נייר סינון תת-מיקרוני על גבי שתי פיסות נוספות של נייר סינון #4 (איור 1-1).
- מקמו את המלקחיים נגד נימים כאשר הרגל הכפופה פונה כלפי מעלה והרגל הישרה פונה כלפי מטה. לאחר מכן, בחרו רשת של 600 רשתות עם הצד החלק/מבריק כלפי מעלה. מניחים את המלקחיים על צלחת פטרי או משטח מוגבה אחר כדי למנוע מגע של הרשת הנקייה עם פריטים אחרים.
- מוציאים את הנייר מסרט הפרפין ומושכים את הצדדים (~5 מ"מ) ליצירת שפה קטנה. פיפטה שתי טיפות 150 μL של 4% תמיסת טרהלוז ~ 1-2 ס"מ מצד אחד קצר של סרט הפרפין ו ~ 1 ס"מ זה מזה על סרט הפרפין.
- על ספסל נפרד או על הרצפה, יוצקים חנקן נוזלי במיכל קצף פוליסטירן קטן (ראו טבלת חומרים).
אזהרה: קבל הדרכה לטיפול נכון באמצעות כפפות ומגן פנים על מנת למנוע עקיצת כפור. - הניחו מיכל רשת קריו-EM קטן בחנקן הנוזלי וכסו את מיכל הקצף פוליסטירן במגבונים נטולי מוך.
2. הנחת סרט הפחמן על הרשת
- השתמש במלקחיים של Dumont #5 (ראו טבלת חומרים) כדי לצוף את סרט הפחמן מהנציץ על ידי נגיעה בצד אחד של הנציץ בזווית קלה כלפי מטה (~20°-40°) על אחת מטיפות תמיסת הטרהלוז ולאט לאט תן למתח המים להרים את סרט הפחמן על ידי הזזת הנציץ כלפי מטה. שחררו את הנציץ ברגע שסרט הפחמן צף על פני השטח של הטיפה.
- בדוק חזותית את סרט הפחמן כדי למנוע שימוש בפחמן עם נזק בצורה של שברים.
- הכנס את הרשת המוחזקת על ידי מלקחיים אנטי נימיים בזווית (~ 20°-30°) לתוך טיפת טרהלוז במיקום סמוך, ולאחר מכן ממורכז מתחת לסרט הפחמן. הרימו את סרט הפחמן (איור 1-2).
- שמרו על הרשת באותו כיוון והורידו אותה באיטיות על פני השטח של טיפת הטרהלוז השנייה מבלי לשבור את מתח הפנים של הטיפה כדי להסיר סרט פחמן מיותר שאולי עטף את שפת הרשת לצד המחוספס.
3. הפרדת גבישים דו-ממדיים רב-שכבתיים לשכבות בודדות
- סובבו את המלקחיים האנטי-נימיים (ראו טבלת חומרים) והניחו אותם על צלחת פטרי כשצד הפחמן של הרשת פונה כלפי מטה (איור 1-3).
- פיפטה 1.3 μL של הדגימה לתוך מניסקוס טרהלוז קל על גבי הרשת. Pipette את הפתרון ~ 8-10 פעמים כדי לערבב ולהפיץ את trehalose ודגימה משני צידי הרשת.
- תוך כדי דגירה של התמיסה במשך דקה אחת, פיפטה טיפה אחת או יותר של 1.7 μL של תמיסת טרהלוז על סרט הפרפין.
- סובב את הרשת בחזרה למקומה המקורי כאשר סרט הפחמן פונה כלפי מעלה.
- השתמשו במלקחיים נגד נימים כדי ללחוץ את הרשת על נייר הסינון התת-מיקרוני (איור 1-4). לאחר שהתמיסה נספגה על-ידי נייר הסינון וסרט הפחמן שוכב שטוח, המתן 3 שניות לפני שתרים את הרשת ותעביר אותה אנכית אל טיפת 1.7 μL של תמיסת טרהלוז (איור 1-5).
הערה: חזור על שלב זה מספר פעמים עבור דגימות בערימה גבוהה, או שהרשת מוכנה לוויטריפיקציה בשלבים הבאים. - הכתימו את הרשת על שתי פיסות נייר הסינון ולאחר מכן הרימו את הרשת מנייר הסינון (איור 1-6). לאחר כ-13 שניות, בהתאם ללחות ולמאגר הדגימה, צללו את הרשת לתוך החנקן הנוזלי במיכל הקלקר הקטן והניחו את הרשת במיכל הרשת cryo-EM או העבירו אותו ישירות לסינון cryo-EM או לאיסוף נתונים.
הערה: על מנת לייעל במהירות את הפרוטוקול, הכתימו לרעה את הרשת המוכתמת בקליפה בשלב זה במקום לצלול אותה לחנקן נוזלי. מכתימים את הדגימה באופן שלילי על ידי החלת 3 μL של 1% אורניל אצטט על הרשת, דגירה של הרשת במשך 30 שניות, והכתמתו עם חתיכה קרועה של נייר סינון נקבוביות בגודל 20-25 מיקרומטר. רשתות של גבישים דו-ממדיים המכילים טרהלוז, טאנין או גלוקוז צוללות באופן שגרתי ביד לצורך ויטריפיקציה, שכן טרהלוז, טאנין וגלוקוז מונעות היווצרות של קרח גבישי בקצבים המשמשים לצניחה ידנית2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניסוי מוצלח של כתמי קילוף יביא לשכבות בודדות של דגימות בריכוזים גבוהים לעתים קרובות. יש לצפות כי אזורים מסוימים ברוב ריבועי הרשת עדיין יכילו שכבות מרובות, במיוחד במספר קטן יותר של איטרציות של מדרגות הכתמים. עם זאת, רוב ריבועי הרשת יכילו אזורים נרחבים של שכבות בודדות כפי שנצפה עבור גבישים דו-ממדיים של לויקוטרין C4 סינתאז אנושי (איור 2) וליפוזומים (נוסף בשלב 3.2, איור 3). ייתכן שיהיה צורך לבדוק שלבים נוספים של כתמי קילוף עבור דגימות שאינן מראות את ההפחתה הרצויה בשכבות.
האינדיקציה החשובה ביותר לניסוי מוצלח של כתמי פילינג תהיה איכות הנתונים והשלמות הביולוגית שנצפו לאחר איסוף נתונים ברזולוציה גבוהה של cryo-EM ועיבוד תמונה. פרשנות הנתונים תצטרך לכלול שיקול זהיר של נזק או עיוות פוטנציאליים לאזורי מגע בין שכבות.
אזורים ברשת EM שבהם התרחשה הכתמת קליפה מציגים בדרך כלל ריכוז גבוה יותר של דגימה מאשר אזורים שבהם היא לא התרחשה. אפקט ריכוז לכאורה זה נגרם על ידי היצמדות של דגימת המולטי-למלר הן לסרט הפחמן והן למשטחי פס הרשת, ולאחר מכן הדבקה נוספת בשני המשטחים במהלך הכנת כתם הקליפה כאשר הם נפרדים שוב ושוב, ממקמים מחדש מעט, ושוב יוצרים קשר. התוצאה היא שהשכבות השונות של הדגימה הרב-למלרית המקורית מפוזרות זו מזו על פני שטח רוחבי גדול יותר (איור 3 ואיור 4). אזורים אלה יכולים אפילו להכיל גבישים או ממברנות דו-ממדיים גדולים יותר. ניתן להבחין בשתי התופעות בקלות ולהשוות אותן באזורים שבהם "אזור הקילוף" צמוד לאזור שאינו מושפע ממדרגה של כתם הקליפה (איור 3). התמונות באיורים 2-4 נאספו בתנאים של מינון נמוך במתח מואץ של 120 קילו-וולט באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (ראו טבלת חומרים).
איור 1: ייצוג סכמטי של טכניקת כתם הקילוף. שני השלבים הראשונים (1-2 ו-1-3) והשלב האחרון (1-6) של טכניקת הקילוף-כתם מבוססים על שיטת ההזרקה האחורית 2 ושלבי הביניים עוקבים אחר פרוטוקול הקילוף-כתם (שונה מ-Johnson et al.1). בשלב 1, (A) נערמות שתי חתיכות של נייר מסנן נקבוביות בגודל 20-25 מיקרומטר, (B) צמודות לפיסת סרט פרפין עם שתי טיפות של תמיסת טרהלוז ו-(C) פיסת נייר סינון תת-מיקרוני על שתי פיסות נוספות של נייר סינון. בשלב 2, (A) סרט הפחמן צף על טיפת הטרהלוז הראשונה ו-(B) נאסף עם מלקחיים אנטי-נימיים, ולאחר מכן הוא נגע בפני השטח של הטיפה השנייה (לא מוצג) מבלי לשבור את מתח הפנים כדי להסיר את שכבת הפחמן העודפת מהפריפריה. בשלב 3, (A) המלקחיים המחזיקים את הרשת מסובבים ב-180° (צד סרט הפחמן של הרשת פונה כעת כלפי מטה) ו-(B) הדגימה מוזרמת למניסקוס של הטרהלוז. בשלב 4, הרשת סובבה בחזרה לכיוון המקורי כאשר סרט הפחמן פונה כלפי מעלה והדגימה יורדת באיטיות על נייר הסינון התת-מיקרוני. הרשת מורמת ובשלב 5 מורידה אנכית על טיפה של 1.7 μL של תמיסת טרהלוז. שלבים 4 ו-5 מכונים "קילוף-הכתמה" וניתן לחזור עליהם שלוש פעמים או יותר, בהתאם לכמות הערימה. ייתכן שיהיה צורך למטב את מספר האיטרציות עבור דגימות שונות. בשלב 6, (A) הדגימה מוכתמת על שתי שכבות של נייר מסנן נקבוביות בגודל 20-25 מיקרומטר, לפני (B) הוא צולל ביד לתוך חנקן נוזלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דגימת גביש דו-ממדית הכפופה לשיטת כתמי הקליפה. האזור שמשמאל לחץ הצטמצם במידה רבה לגבישים דו-ממדיים חד-שכבתיים באזור מגע בין סרט הפחמן לפס הרשת שהוכתם בקליפה ולאחר מכן הוסט, בעוד שהאזור שמימין לחץ לא היה באזור שהושפע מכתם הקליפה. ניתן לבחור בקלות את האזורים המוכתמים בקליפה, והם נצפים ברוב הרשת. הגבישים הדו-ממדיים המוצגים הם גבישים דו-ממדיים מוערמים וחד-שכבתיים של לויקוטרין C4 סינתאז אנושי. סרגל קנה המידה מתאים ל-10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ליפוזומים הנתונים לכתם הקליפה. ניתן ליישם בהצלחה את כתם הקליפה כדי להפריע לקצוות של ליפוזומים ושלפוחיות שקרסו כדי לגרום לאזורים עם דו-שכבתיות גדולות, בעיקר חד-שכבתיות של פוספוליפידים, כפי שנצפה במחצית התחתונה של התמונה. החצי העליון לא היה באזור מגע בין מוט הרשת לבין סרט הפחמן ולכן מכיל ליפוזומים שלמים עם שני דו-שכבתיים פוספוליפידים. סרגל קנה המידה מתאים ל- 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: טביעת הרגל של כתם הקליפה. ריבוע הרשת של רשת של 400 רשתות שינוי מציג את טביעת הרגל (המסומנת "B") של סרגל הרשת והאזורים המוכתמים בקילוף שהתקבלו כתוצאה מכך, כמו גם את האזורים (המסומנים "C") שלא היו במגע עם סרגל רשת, או שהיו נתונים לפחות איטרציות של כתמי קליפה. סרגל קנה המידה מתאים ל-10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הכתמת רשת EM שהוכנה בהזרקה אחורית על נייר סינון תת-מיקרוני, באמצעות סרט פחמן דק מדי. תמונות הן פריימים בודדים מסרטון וידאו (ראה סרטון 1) שצולם במגע ראשוני (A) עם הממברנה, (B) 1000 אלפיות השנייה לאחר מגע, ו- (C) 2000 אלפיות השנייה לאחר מגע. החץ מציין ריבועי רשת שבהם לחץ נימי קרע את סרט הפחמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
וידאו 1: הרשת ממוקמת על נייר הסינון התת-מיקרוני לשלב הכתמים. שכבת הפחמן נשאבת באיטיות ובחוזקה על הרשת בכיוון שמשמאל למטה לימין למעלה, אשר כורכת בחוזקה דגימה בין פס הרשת לסרט הפחמן. שכבת הפחמן ולכן שכבות דגימה בודדות נעקרות בכל שלב קליפה-כתם עוקב, מה שמאפשר אופטימיזציה עם איטרציות נוספות עבור דגימות שכבות גבוהות יותר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתם הקליפה הוא שיטה רבת עוצמה להתגבר על ערימה ועובי של גבישים דו-ממדיים רב-שכבתיים ודגימות דומות לאיסוף נתונים cryo-EM ועיבוד תמונה. החלטה על השימוש בכתם הקליפה תתבסס על פרמטרים ביולוגיים של הדגימה ותדרוש גם הערכה ברגע שיהיה מודל קריו-EM תלת-ממדי זמין. החשיבות הביולוגית של מגעים וגמישות פוטנציאלית של אזורי מגע יהיו חשובים במיוחד בהערכה זו.
מספר כתמי הקליפה ייקבע בתחילה באמצעות תצפית לאחר הכנת רשת כתמים שלילית סטנדרטית, כאשר שכבות או עובי מוגזמים ידרשו אסטרטגיות חלופיות להכנת רשת קריו-EM סטנדרטית. גבישים רב-שכבתיים דקים המוערמים באוגר עשויים לשמש ישירות עבור microED3 או טחינת FIB במקרה של גבישים עביםיותר 4. כתם הקליפה בדרך כלל לא יהיה נחוץ עבור גבישים דו-ממדיים דו-שכבתיים, שכן ניתן לעבד שכבות בנפרד או יחד, כאשר השכבות נמצאות ברישום5. זה עשוי להיות מועיל לחשיפת שני הצדדים של גבישי חלבון הממברנה הדו-ממדיים לליגנדים או מעכבים, פעם אחת בתמיסה לפני הכתמת הקליפה, ופעם אחת לאחר השלב האחרון של הכתמת הקילוף. בנוסף, הפחתת גבישים דו-ממדיים דו-שכבתיים גדולים ומסודרים היטב עשויה לאפשר עקיפת אלקטרונים 6,7. רב-שכבות, מושרות או ביולוגיות, של גבישים דו-ממדיים של ממברנה וחלבונים מסיסים יהיו המטרות הסבירות ביותר לקילוף-כתם, אף על פי שניתן ליישם את הפרוטוקול על מגוון דגימות ולשמש לריכוז דגימות שונות עבור cryo-EM (איור 4).
בדיקה ראשונית עם כתם שלילי תפחית באופן דרמטי את הזמן והעלות כדי לייעל את הדגימות כמו הקפאה, הכנת מחזיקי דגימות cryo-EM, העברה לקריו-EM, ושימוש cryo-EM אינם נדרשים. רק זמן הייבוש לפני שלב ההקפאה יצטרך להיות מותאם בנפרד. זמן הייבוש יהיה זהה או דומה מאוד לזמן המשמש לייבוש רשת הזרקה אחורית סטנדרטית של אותה דגימה1.
בעוד שרשתות של 600 רשתות יוצרות בדרך כלל שימור טוב של סרט הפחמן, מספר גדול יותר של איטרציות של כתמי קליפה ושכבות סרט פחמן דקות יותר עשויות להוביל לשבירת סרט פחמן מוגברת (איור 5). ניתן להפריד בהצלחה גבישים דו-ממדיים, ליפוזומים ודגימות שכבות של מערכים גדולים של חלבונים מסיסים (איורים 2-4).
הדגימה מוערכת בקפידה על ידי cryo-EM כדי להבטיח שנמנעות השפעות שליליות על איכות הדגימה. ניתן להשיג זאת על ידי עיבוד תמונה כדי להשוות תמונות של גבישים מוערמים ולא מוערמים. הן למטרות הערכה והן כדי להשיג את המטרה של מודל תלת-ממדי, עיבוד התמונה מתבצע באמצעות תוכניות 2dx הזמינות ב-Focus8,9, אשר מיישמות גם גישות של חלקיקים בודדים לטיפול בפגמים בסריג ובהטרוגניות של חלבונים עם אפשרות להגדיל באופן דרמטי את האיכות האינהרנטית של הגבישים הדו-ממדיים המקוריים10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים כספיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.
Acknowledgments
חלק מעבודה זו נתמך על ידי מענק NIH HL090630 (ISK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
