Summary
ここでは、胚の固定、免疫染色、および切片化のために最適化された段階的なプロトコルが提供され、発達中のマウス組織におけるサイトネムと呼ばれる特殊なシグナル伝達糸状体を検出します。
Abstract
発生組織パターニングおよび発生後組織恒常性は、モルフォゲンと呼ばれる細胞シグナルの制御された送達に依存する。モルフォゲンは、濃度および時間依存的に作用し、細胞の運命を指示し強化する別個の転写プログラムを指定する。適切なモルフォゲンシグナル閾値が保証されるメカニズムの1つは、サイトネムと呼ばれる特殊な白状体によるシグナル伝達タンパク質の送達によるものである。シトネムは非常に薄く(直径≤200nm)、数百ミクロンの長さに成長する可能性があるため、固定画像解析のための保存が困難です。この論文では、標準的な共焦点顕微鏡法を用いてサイトネムの可視化を可能にするために、固定、免疫染色、および厚い切片化のためのマウス胚の繊細な取り扱いのための洗練された方法を説明する。このプロトコルは、マウス神経管の発達中に異なる細胞シグナル伝達コンパートメントを接続するサイトネムの可視化に成功裏に使用されています。この技術はまた、組織タイプにわたってサイトネムを検出し、前例のない分解能で発生シグナル伝達の調査を容易にするように適合させることもできる。
Introduction
胚発生は、モルフォゲンシグナル伝達経路の協調的な活性化によって調整される。モルフォゲンは、ソニックヘッジホッグ(SHH)、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)/骨形態形成タンパク質(BMP)、ウィングレス関連集積部位(WNT)、および線維芽細胞および上皮成長因子(FGF/EGF)ファミリーに分類される小さな分泌タンパク質です。モルフォゲンは、組織発達中に細胞組織化中心から産生および放出され、細胞の組織化場にわたってシグナル伝達勾配を確立し、組織形態形成1,2,3,4,5を知らせる。モルフォゲン勾配の1つの表現は、発達中の神経系に見出され、そこでは推定中枢神経系がモルフォゲン経路活性化を介してパターン化される。神経管と呼ばれるこの組織は、腹側最内脊索および床板から分泌されるSHHの対向する勾配と、背側屋根板から分泌されるWNT/BMPsから構成され、別個の神経前駆領域をパターン化する6。神経管は、発生研究においてモルフォゲン勾配の完全性を疑問視するために一般的に使用される。
モルフォゲン勾配形成は、シグナル分散7の厳密な調節に依存している。これが起こる1つの細胞機構は、シグナル産生細胞から特定の標的細胞集団へのモルフォゲンの直接送達を促進するサイトネムと呼ばれる長いシグナル伝達糸状体の形成によるものである。シトネムは、シグナル受容細胞膜上にモルフォゲンを堆積させるために数百マイクロメートルに拡張することが観察されている8,9。サイトネム媒介モルフォゲン輸送の中断は、ハエおよび脊椎動物の両方に発生異常をもたらし、組織パターニング10、11、12、13、14におけるそれらの重要性を強調する。
今日まで、サイトネムはショウジョウバエ、ひよこ、ゼブラフィッシュのモデルで文書化されているが、哺乳類の胚を発達させる際の構造のイメージングは依然として困難である8,9,15。複雑な哺乳類組織中のサイトネムをその場で効果的にイメージングするためのハードルは、その薄くて壊れやすい性質であり、従来の固定方法による損傷を受けやすい8。我々は以前、培養細胞中のサイトネムを保存し、共焦点顕微鏡を用いた研究を可能にするために、改変電子顕微鏡固定剤(MEM-fix)のプロトコルを開発し、最適化していた16,17。
MEM固定技術の使用により、SHH誘導性サイトネム形成および機能に関与する分子のいくつかの同定が可能となった11、16、17。しかし、神経管パターニングの生理学的に関連する文脈におけるこれらの知見の確認は、マウス胚組織を固定および画像化する新規技術の開発を必要とした。ここでは、サイトネムの完全性を維持し、共焦点解析のための免疫染色およびその後の胚組織の切片化を可能にする方法でマウス胚を固定するプロトコルを概説する。このプロトコルは、発達中の神経管内のSHH産生細胞からの膜延長を標識するために、膜連結緑色蛍光タンパク質(GFP)を使用して開発された。このプロトコルの実施は、哺乳類系の開発におけるサイトネムの有病率と重要性に関する未回答の疑問に対処する。
Protocol
このプロトコルは、施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)およびセントジュード小児研究病院の承認された動物ケアガイドラインに準拠しています。全ての菌株は、C57BL/6J株に5世代を遡及した。
1. 胚単離と全マウント染色
- 6週齢の女性を繁殖させ、膣プラグの存在を監視する。
- AVMAガイドライン18に従って、CO2チャンバー内のCO2吸入に続いて子宮頸部脱臼によって妊娠中のダムを安楽死させる。解剖ハサミと鉗子を使用して腹腔にY切開を行います。承認された機関ガイドラインに従って、E9.5胚を含む子宮を切除する。
- 完全な成長培地(非必須アミノ酸、ピルビン酸Na、L-グルタミン、および10%ウシ胎児血清を添加したダルベッコの改変イーグル培地)で胚を解剖する。鉗子を使用して、卵黄嚢、胎盤、および周囲の膜を除去します。
注:必要に応じて、胚のジェノタイピングのために各卵黄嚢を保存してください。 - ハンク平衡塩溶液(HBSS)で分離した胚をすすぎ、残存する羊膜組織および血液を除去します。
- 固定液を準備します。パラホルムアルデヒド(PFA)をHBSSに加え、最終作業濃度を4%PFAにします。
警告: PFA は有毒な化学物質であるため、吸入や皮膚への直接暴露は避けてください。固定液の調製は、手袋および白衣の適切な個人用保護具を備えたヒュームフードの下で行われる。 - 24ウェルプレートの各ウェルに1mLの固定液を加え、各胚を個々のウェルに入れる。胚を固定液中で45分間インキュベートし、ロッカー上で穏やかに攪拌する。
注:重大:すべての洗浄およびインキュベーションは、胚の突然の取り扱いまたは移動が固定サイトネムを破壊するため、ロッカーまたは円形シェーカー上で 穏やかな 攪拌(最大20RPM)で行わなければならない。ピペットを使用して、すべての溶液を静かに除去します。 - 固定液を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で胚をCa2+およびMg2+で3 x 30分間洗浄し、0.1%トリトンを加えた。
- 洗浄後、穏やかな攪拌でブロッキング溶液(Ca2+およびMg2+、0.1%トリトン、および5%ヤギ血清を含むPBS)中で胚をインキュベートする。ブロック 2 x 1 時間。第2のブロッキングインキュベーションの後、新鮮なブロッキング溶液を用いて胚の1回のクイックリンスを行う。
- 第2ブロッキング工程中に、一次抗体溶液11を調製する。PBS中の最適化された濃度に抗体をCa2+およびMg2+、0.1%Tween-20、および5%ヤギ血清で希釈する。
注:膜GFPの可視化を強化するために、ニワトリ抗GFP(1:250)を使用することができます。 - ブロッキング溶液を除去し、1mLの一次抗体溶液を各ウェルに加える。4°Cで緩やかな回転で3日間インキュベートする。
- 一次抗体インキュベーションに続いて、胚を 20 RPM で 20 RPM で 5 x 1 時間洗浄し、PBS 中のロッカー上でCa2+ および Mg 2+、0.1% Tween-20、および 5% ヤギ血清で洗浄します。
- F(ab')2フラグメント二次抗体溶液を、Ca2+およびMg2+、0.1%Tween-20、および5%ヤギ血清を含むPBS中で1:1,000希釈で調製する。
注:F(ab')2 フラグメントを使用すると、サンプルへの抗体の浸透が大幅に向上します。 - 1mLの二次抗体溶液を各ウェルに加える。暗所で4°Cで3日間穏やかに揺らしながらインキュベートする。
注:重要:この時点から、直接光への胚曝露を最小限に抑えてください。オプション:細菌の増殖を防ぐために、0.2%アジ化ナトリウムを二次抗体溶液に加えます。 - 二次抗体溶液を除去し、胚をPBS中で3 x 30分間、Ca2+ およびMg2+、0.1%Tween-20、および5%ヤギ血清で洗浄する。ファロイジンまたは他のアクチン色素によるアクチン染色を行わない場合は、最初の洗浄後、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)をCa2+ およびMg2+、0.1%Tween-20、および5%ヤギ血清でPBSに加え、1時間インキュベートし、続いて上記のように3 x 30分間洗浄する。
注:この時点で、胚は、翌日の包埋ステップまで、暗所でPBSまたはHBSS中で4°Cで一晩保存することができる。しかし、胚はすぐに埋め込まれて切片化されることをお勧めします。
2. 胚の埋め込み、切断、マウント
- Ca2+およびMg2+とともにHBSSまたはPBSに溶解した4%w/v低融点(LMP)アガロース溶液を、胚あたり約3mLの最終容量まで調製する。LMPアガロースが溶解するまで、Ca2+およびMg2+およびマイクロ波を用いて、HBSSまたはPBSにLMPアガロースの適切な重量を加える。
注:LMPアガロースが溶解したら、LMPアガロース溶液が固化しないように、55°Cに設定したビーズバス、インキュベーター、またはウォーターバスに溶液を保管してください。 - 胚の埋め込み型として12ウェルプレートを使用してください。12ウェルプレートを55°Cのビーズ浴中に置く。胚を保持する各ウェルに2.5〜3mLの4%LMPアガロースを加える。
注:他の金型を使用することもできますが、12ウェルプレート容量は、セクショニングのために後の段階でアガロースブロックを準備するのに最適です。 - 穿孔スプーンを用いて、4%LMPアガロース溶液を含む個々のウェルに胚を移す(図1A)。
- 12ウェルプレートをビーズバスからベンチトップに移します。ピペットチップを使用して、胚を穏やかに埋め込み、溶液の中央に収まるように向きを変えます。胚の向きが決まったら、プレートを-20°Cで10分間置き、ブロックを素早く固化させます。
重大:胚がブロックの中央に配置されていることを確認します。底に沈んだり、型の端に近すぎたりする胚は、切断中にアガロースブロックから取り除かれる可能性があります。
- 12ウェルプレートをビーズバスからベンチトップに移します。ピペットチップを使用して、胚を穏やかに埋め込み、溶液の中央に収まるように向きを変えます。胚の向きが決まったら、プレートを-20°Cで10分間置き、ブロックを素早く固化させます。
- メスを使用して井戸からアガロースブロック全体を取り出し、胚の周りに長方形のブロックを切断し、両側に〜0.3cmのブロックを残します。胚の尾端に沿って余分な長さを許可します。ビブラトームに装着するときは、胚をブロックの上部の直立位置に向ける(図1B)。
- ビブラトームの標本ホルダーにテープのストリップを塗布し、アガロースブロックをテープにスーパーグルーピングし、ブレードが前部(頭蓋)から後部配列に胚の軸方向部分を生成するように配向させる。
- ビブラトームチャンバーを冷たいHBSSで満たしてサンプルが完全に浸漬されていることを確認し、チャンバーを氷で囲みます。
- ビブラトーム 速度 を 0.2 mm/s 、 周波数 を5~7(50~70 Hz)に設定し、 切断厚さ を 100 μmに設定します。胚の連続軸切片化を行う。
メモ: セクショニングには低速を使用してください。切断速度が0.25mm/sを超えると、切片化によって胚が引き裂かれたり、胚がブロックから取り除かれたりすることがあります。- セクショニングシリーズ中は、鉗子を使用して個々のセクションをHBSSで満たされた別の60 mmディッシュに静かに移します。鉗子を使用して、組織ではなくブロックをつかみ、組織の損傷やサイトネムの破壊を避けます。
注:組織切片はアガロースブロック内にとどまるべきである。組織がブロックからビブラトームチャンバーに落ちる場合は、切片を持ち上げて静かに移します。ティッシュをつかんだりつまんだりしないでください。重大:組織切片の折り畳みや突然の取り扱いは、組織切片内の固定サイトネムを破壊する。
- セクショニングシリーズ中は、鉗子を使用して個々のセクションをHBSSで満たされた別の60 mmディッシュに静かに移します。鉗子を使用して、組織ではなくブロックをつかみ、組織の損傷やサイトネムの破壊を避けます。
- F-アクチン染色を行わない場合は、ステップ2.10に進みます。
- F-アクチン染色を行うには、HBSSを除去し、室温でCa 2+およびMg 2+、0.1% Tween-20、および5%ヤギ血清でPBSで希釈したアクチンレッドおよびDAPI溶液で切片を40分間インキュベートします。
- PBSで切片を3 x 20分洗浄し、Ca2+ およびMg2+ および0.1%トゥイーン-20で洗浄する。
- 疎水性マーカーペンを使用して、荷電顕微鏡スライドの縁の周りに疎水性バリアを描き、少量のHBSSを追加して領域を埋めます。
- 鉗子または穴あきスプーンを使用して、セクションをスライドに移します。
注:アガロースに包まれていない組織切片は、転写ピペット を介して 移すことができます。 - 鉗子を使用して余分なアガロースブロックを除去します。
- すべてのセクションをスライドに移したら、ピペッティングと吸収性タオルレットの角 で 余分な液体を取り除き、スライドに数滴の取り付け媒体を追加します。硬化させるときは、カバースリップ領域全体を覆うのに十分な取り付け媒体を使用してください。カバースリップをスライドにそっと置いて取り付けます。
メモ: 取り付け媒体が硬化するまで、圧力をかけたり、カバースリップを乱したりしないでください。
3. イメージング
- 任意の共焦点または高分解能顕微鏡11上で組織切片の画像化を行う。遺伝子型ごとに最低3つの胚を分析します。
注:組織切片の画像は、TCS SP8 STED 3x共焦点顕微鏡を使用して取得し、続いてLIGHTNINGデコンボリューションを取得しました。
Representative Results
1ウェルあたり2.5~3mLのアガロース溶液を含む12ウェルプレートのより大きな鋳型の使用は、短期間に複数の胚を包埋および懸濁するのに理想的でした(図1A)。余分な領域は、切断のためにアガロースブロックを切断するときに正しい向きを可能にする。アガロースブロックを切断するときは、オブジェクトホルダーのテープに接着されるブロックの底に沿って余分なアガロースを維持することが重要です。胚はブロックの上半分にあるはずです(図1B)。ただし、余分なブロックは、切断中にブレードがブロックに押し込まれるときに切断角度を変更する可能性が高くなるため、下部セクションは大きすぎないでください。正しい方向のセクションの例を示します(図1C、D)。
このプロトコルの開発中、ビブラトーム切片化はクライオスタット切片化と比較された。組織のクライオスタット切片化は、細胞伸長をめったに保存しなかった(図2クライオスタットおよび図3A、Bビブラトーム)。クライオスタット切片は、脊索と神経管の細胞間(図2Aの矢印)および隣接する神経管細胞間(図2B,B'矢印)のGFP陽性膜断片の検出を可能にした。しかしながら、神経管を取り囲む高糸状間葉系細胞における細胞伸長のF-アクチン染色は、クライオスタット切片において損なわれた(図2C,C ́矢印、対図3C,D)。これらのクライオスタットの結果は、この方法に従って壊れた細胞伸長の痕跡が残っていることを示している。したがって、ビブラトーム切片化は、その後の分析のためにこれらの繊細な拡張を効率的に保存するために好ましい。
胚全体および個々の組織切片の最小限の破壊は、細胞伸長の高品質のイメージングに不可欠です。折り畳みまたは座屈を経た組織切片は、脊索がないか、脊索と神経管の腹側床板との間に大きな分離(>30μm)がないことによって明らかになります(図3B)。これは通常、通常、神経管を囲む間葉系細胞の喪失を伴う(図3A、矢印)。損傷した切片はまた、上皮細胞間を移動する目に見える細胞膜伸長の喪失をもたらすであろう(図3Aと比較して図3B、矢印)。切片にわずかな歪みがあっても、アクチンベースの伸長の断片化や細胞間に大きな隙間が形成され(図3D、矢印、よく保存された図3Cと比較して)、すべてのステップで繊細な取り扱いの必要性を強調しています。
図 1: E9.5 Shh-Cre の例。Rosa26 mTmG 染色、包埋、および切片化胚。 (A)単一胚を12ウェルプレートに、4%LMPアガロースに包埋する。(b)ビブラトーム搭載用のサイズにカットダウンしたアガロースブロック内の正しく配向した胚の例。過剰なアガロースブロックは底部に沿って存在する。(c)LMPアガロースに埋め込んだ100μm厚の胚切片の明視野像。(d)アガロースを除去した後の切片の免疫蛍光イメージング。抗GFP染色されたmGFP(緑)は組織中の Hh発現細胞を表し、他の細胞系譜は膜トマト(赤)、DAPIは青で発現する。神経管(ブラケット)およびmGFP陽性脊索(矢印)がはっきりと見える。スケールバー = 1 cm (A)、5 mm (B)、および 100 μm (C、D)。略語: LMP = 低融点;mGFP = 膜緑色蛍光タンパク質;Shh = ソニックヘッジホッグ;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:クライオスタット切片化神経管床板および断片化された膜延長を有する脊索の例。Rosa26 mTmG19、20、21切片をGFP(緑)、Fアクチン(赤)、およびDAPI(青)について染色した。mGFPパンクタは、脊索と床板(矢じり)と(B,B')の間、神経管の隣接する細胞間を移動するのに見える。(C,C')F-アクチン染色では、神経管を取り囲む間葉系細胞上の明確なサイトネムを検出できません(矢印)。スケールバー = 20 μm。略語:mGFP=膜緑色蛍光タンパク質;Shh = ソニックヘッジホッグ;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:最適および準最適のビブラトーム組織切片の例、および神経管床板、脊索、および周囲の細胞の染色。繊細に扱われた切片(A,C)の例は、(B)折り畳まれた組織切片および(D)Shh-Creからの取り扱いが不十分な切片と比較して、Rosa26 mTmGおよびShhGFP/+胚19、20、21である。最適に処理された切片は、隣接する局在する床板神経上皮細胞(A、矢じり)間のサイトネムの検出を可能にする。神経管隣接脊索(A、mGFP発現)および間葉系細胞(A、矢印)が見えるはずである。(C,D)Fアクチン染色切片およびDAPI染色切片は、神経管および脊索(C)を囲む間葉系細胞およびFアクチンベースのサイトネム(矢印)の一貫した間隔を有するべきである。セクションのわずかな折り畳みや混乱は、ギャップや壊れたF-アクチン断片(D、矢じり)を引き起こす可能性があります。スケールバー = 10 μm。略語:mGFP=膜緑色蛍光タンパク質;Shh = ソニックヘッジホッグ;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、高解像度蛍光顕微鏡検査のために胚組織切片中の繊細なサイトネムの保存のために開発されました。今日まで、さまざまなモデル生物の組織中のサイトネムの可視化は、生きた組織イメージングを用いた蛍光標識タンパク質の異所性発現に大きく依存してきました。残念なことに、蛍光標識されたライブイメージングの使用は、内因性に発現されたタンパク質の分析にはほとんど役に立たず、時間の制約をもたらす可能性があり、特殊なイメージング段階および顕微鏡を必要とする。ここで説明する染色およびセクショニング法は、サイトネムおよび他の細胞伸長を保存して、内因性に発現されたタンパク質の最終的な検出のための免疫組織化学を可能にする。この技術は、形態素が 生体内で 異なる組織間でどのように輸送されるかについての新しい洞察を促進し、サイトネムを研究することができるモデル系の範囲を広げる。
このプロトコルは、全面マウント染色およびビブラトーム厚切片化を使用しており、グリセロールなどの平衡化溶液またはスクロースなどの凍結保護剤溶液の使用を回避します。これは、細胞伸長の最大保存を可能にするために、切片化された組織の取り扱いを最小限に抑えることを目的としています。切片化後の組織の取り扱いの減少は、サイトネムの全体的な保存において一貫してより良い結果をもたらした。したがって、胚の切片化は、イメージング前の最終ステップの1つである。
培養細胞のサイトネムの保存のために開発された固定技術であるMEM-fixは、グルタルアルデヒドとPFAの組み合わせで構成されており、生の細胞構造の改善された3D保存を可能にし、それらの生きた寸法に匹敵する16,17。残念なことに、グルタルアルデヒドは自己蛍光を発し、高いタンパク質架橋活性のために細胞内の抗体浸透およびエピトープ結合を厳しく制限するため、MEM固定は胚固定には役に立たなかった22,23。したがって、PFA固定条件後の切片化プロトコルは、胚組織における細胞伸長の保存を可能にするように最適化された。PFAは胚組織におけるサイトネム様伸展を保存することができるが、画像解析は注意して行うべきである。PFAは、個々の細胞および組織の部分的な脱水を引き起こし、軽度の体積減少および固定組織内の小さな細胞外空間の形成をもたらし得る。
このプロトコールは、スクロースまたはグリセロール溶液が組織24の軽度の再飽和を引き起こし得るので、凍結保護および組織透明化のためのスクロース再飽和の余分なステップを回避する。結果として生じる軽度の腫脹は、固定された細胞伸長および細胞間および組織間を移動するサイトネムを破壊する可能性がある。これは、厚切片ビブラトームをクライオスタット切片と比較すると明らかでした。組織厚の増加は無傷のサイトネムの保存を改善したが、スクロース再飽和クライオスタット切片は一貫して検出可能なサイトネムの発生率が低かった。
このプロトコルの最適化により、厚さ100μmの切片が無傷のサイトネムの保存を確実にするために最適であることが明らかになりました。ほとんどの共焦点顕微鏡は、25をクリアすることなく、〜20〜40μmの深さまでの細胞拡張を視覚化するのに十分な解像度でしかイメージングできないため、より薄い切片がイメージングに一般的に使用されます。しかし、薄い切片を切断する際に刃から胚細胞に加えられる機械的力および歪みは、サイトネムを破壊する。より厚い切片は、組織内の無傷の延長を維持しながら、断面内の深さのより大きな領域を可能にする。さらに、より厚い切片を使用することで、取り扱いが容易になり、組織切片の過度の折り畳みや座屈を防ぐことができます。
このプロトコルは、E8-10.5マウス胚の組織におけるサイトネムの最大の保存のために最適化された。切片化後の組織の最小限の操作は、サイトネムの全体的な保存を一貫して改善した。サイズおよび組織の複雑さの増加のために、後の発達段階および成人組織切片に技術を適応させるために、さらなる最適化が必要になる可能性が高い。これには、切片化とそれに続く免疫蛍光染色が必要です。このような組織は、サイトネム様伸長を保存するために、追加のクリアリングステップおよび切片化中の組織取り扱いの適応を必要とする場合がある。これらの追加手順は、このプロトコルの将来のアプリケーションのために考慮され、対処される必要があります。
Disclosures
著者らには、宣言すべき競合する利害関係はない。
Acknowledgments
画像は、セントジュード小児研究病院の細胞および分子生物学イメージングコアによって維持されている顕微鏡を使用して取得されました。マウス株はJAXから入手した。この研究は、国立衛生研究所の助成金R35GM122546(SKO)とセントジュード小児研究病院のALSACによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
| 24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
| Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
| Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
| Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
| chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
| CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
| Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
| Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
| Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
| Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
| Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
| Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
| Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
| Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
| PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
| Super Glue | Gorilla | ||
| SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
| Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
| Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |
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