Summary
Hier wordt een geoptimaliseerd stap-voor-stap protocol verstrekt voor fixatie, immunostaining en sectie van embryo's om gespecialiseerde signalering filopodia genaamd cytonemen in ontwikkelende muizenweefsels te detecteren.
Abstract
Ontwikkelingsweefselpatronen en postdevelopmentele weefselhomeostase zijn afhankelijk van gecontroleerde afgifte van cellulaire signalen die morfogenen worden genoemd. Morfogenen werken op een concentratie- en tijdsafhankelijke manier om verschillende transcriptionele programma's te specificeren die het lot van cellen instrueren en versterken. Een mechanisme waarmee geschikte morfogeensignaleringsdrempels worden gewaarborgd, is door afgifte van de signaaleiwitten door gespecialiseerde filopodia die cytonemen worden genoemd. Cytonemen zijn erg dun (≤200 nm in diameter) en kunnen uitgroeien tot lengtes van enkele honderden micron, wat hun conservering voor analyse van vaste beelden uitdagend maakt. Dit artikel beschrijft een verfijnde methode voor delicate behandeling van muizenembryo's voor fixatie, immunostaining en dikke secties om visualisatie van cytonemen mogelijk te maken met behulp van standaard confocale microscopie. Dit protocol is met succes gebruikt om cytonemen te visualiseren die verschillende cellulaire signaleringscompartimenten verbinden tijdens de ontwikkeling van de neurale buis van muizen. De techniek kan ook worden aangepast om cytonemen in verschillende weefseltypen te detecteren om het ondervragen van ontwikkelingssignalering met een ongekende resolutie te vergemakkelijken.
Introduction
Embryonale ontwikkeling wordt georkestreerd door gecoördineerde activering van morfogene signaleringsroutes. Morfogenen zijn kleine, uitgescheiden eiwitten die zijn gecategoriseerd in Sonic Hedgehog (SHH), transformerende groeifactor β (TGF-β) / botmorfogene eiwit (BMP), Wingless-gerelateerde integratieplaats (WNT) en fibroblast- en epidermale groeifactor (FGF / EGF) -families. Morfogenen worden geproduceerd en vrijgegeven uit cellulaire organiserende centra tijdens de weefselontwikkeling en stellen signaalgradiënten vast over organiserende velden van cellen om weefselmorfogenese te informeren 1,2,3,4,5. Een representatie van morfogeengradiënten wordt gevonden in het zich ontwikkelende zenuwstelsel, waar het vermoedelijke centrale zenuwstelsel wordt gemodelleerd door morfogene routeactivering. Dit weefsel, aangeduid als de neurale buis, bestaat uit tegengestelde gradiënten van SHH uitgescheiden door de ventraal-meest notochord en vloerplaat, en WNTTs / BMP's uitgescheiden van de dorsale dakplaat, om verschillende neurale voorlopergebieden te patroon6. De neurale buis wordt vaak gebruikt om de integriteit van morfogene gradiënten in ontwikkelingsonderzoek te ondervragen.
Morfogene gradiëntvorming is afhankelijk van een strakke regulatie van signaalverspreiding7. Een cellulair mechanisme waarmee dit gebeurt, is door de vorming van lange signaleringsfilopodia, cytonemen genaamd, die de directe afgifte van morfogenen van signaalproducerende cellen naar specifieke doelcelpopulaties vergemakkelijken. Cytonemen zijn waargenomen om honderden micrometers uit te breiden om morfogenen af te zetten op signaal-ontvangende celmembranen 8,9. Verstoring van cytoneme-gemedieerd morfogeen transport leidt tot ontwikkelingsafwijkingen bij zowel vliegen als gewervelde dieren, wat hun belang benadrukt tijdens weefselpatroon 10,11,12,13,14.
Tot op heden zijn cytonemen gedocumenteerd in Drosophila-, kuiken- en zebravismodellen, maar beeldvorming van de structuren in zich ontwikkelende zoogdierembryo's blijft een uitdaging 8,9,15. Een hindernis voor het effectief in beeld brengen van cytonemen in complexe weefsels van zoogdieren in situ is hun dunne en fragiele aard, waardoor ze vatbaar zijn voor schade door conventionele fixatiemethoden8. We hadden eerder protocollen ontwikkeld en geoptimaliseerd voor een gemodificeerde elektronenmicroscopie fixatief (MEM-fix) om cytonemen in gekweekte cellen te behouden en hun studie mogelijk te maken met behulp van confocale microscopie16,17.
Het gebruik van de MEM-fix-techniek heeft de identificatie mogelijk gemaakt van enkele van de moleculen die betrokken zijn bij SHH-geïnduceerde cytonemevorming en functie 11,16,17. De bevestiging van deze bevindingen in de fysiologisch relevante context van neurale buispatronen vereiste echter de ontwikkeling van nieuwe technieken om embryonaal weefsel van muizen te fixeren en in beeld te brengen. Een protocol om muizenembryo's te fixeren op een manier die de integriteit van cytonemes handhaaft en immunostaining en daaropvolgende sectie van embryonaal weefsel voor confocale analyse mogelijk maakt, wordt hier beschreven. Dit protocol is ontwikkeld met behulp van een membraangebonden groen fluorescerend eiwit (GFP) om membraanuitbreidingen van de SHH-producerende cellen in de zich ontwikkelende neurale buis te labelen. Implementatie van dit protocol zal onbeantwoorde vragen beantwoorden met betrekking tot de prevalentie en betekenis van cytonemen in de ontwikkeling van zoogdiersystemen.
Protocol
Dit protocol volgt de goedgekeurde richtlijnen voor dierverzorging van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en het St. Jude Children's Research Hospital. Alle stammen werden vijf generaties teruggekruist naar de C57BL/6J stam.
1. Embryo-isolatie en hele mount-kleuring
- Fok 6 weken oude vrouwtjes en controleer op de aanwezigheid van vaginale plug.
- Euthanaseer de zwangere moeder door CO 2-inademing in een CO2-kamer gevolgd door cervicale dislocatie volgens de AVMA-richtlijnen18. Maak een Y-incisie in de peritoneale holte met behulp van een ontleedschaar en tang. Snijd de baarmoeder met de E9.5-embryo's weg volgens goedgekeurde institutionele richtlijnen.
- Ontleed de embryo's in volledig groeimedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, aangevuld met niet-essentiële aminozuren, Na-pyruvaat, L-glutamine en 10% foetaal runderserum). Gebruik een tang om de dooierzak, placenta en omliggende membranen te verwijderen.
OPMERKING: Bewaar indien nodig elke dooierzak voor embryogenotypering. - Spoel de geïsoleerde embryo's in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) om eventueel achtergebleven vruchtwater en bloed te verwijderen.
- Bereid het fixatief voor. Voeg paraformaldehyde (PFA) toe aan HBSS voor een uiteindelijke werkconcentratie van 4% PFA.
LET OP: PFA is een giftige chemische stof, dus inademing of directe blootstelling van de huid moet worden vermeden. Bereiding van de fixatieve oplossing wordt uitgevoerd onder een zuurkap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen van handschoenen en een laboratoriumjas. - Voeg 1 ml fixatief toe aan elk putje van een 24-wellsplaat en plaats elk embryo in een individuele put. Incubeer de embryo's in fixatief gedurende 45 minuten met zachte agitatie op een rocker.
OPMERKING: Kritisch: Alle wasbeurten en incubaties moeten worden gedaan met zachte agitatie (maximaal 20 RPM) op een rocker of cirkelvormige shaker, omdat abrupte hantering of beweging van de embryo's de vaste cytonemen zal vernietigen. Gebruik een pipet om alle oplossingen voorzichtig te verwijderen. - Verwijder het fixeermiddel en was de embryo's 3 x 30 min in Fosfaat-Buffered Saline (PBS) met Ca2+ en Mg2+ met toegevoegde 0,1% Triton.
- Incubeer na het wassen de embryo's in blokoplossing (PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Triton en 5% geitenserum) met zachte agitatie. Blok 2 x 1 uur. Voer na de tweede blokkerende incubatie een snelle spoeling van de embryo's uit met behulp van verse blokkeringsoplossing.
- Bereid tijdens de tweede blokkeringsstap de primaire antilichaamoplossing11 voor. Verdun de antilichamen tot de geoptimaliseerde concentratie in PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum.
OPMERKING: Voor een verbeterde visualisatie van membraan-GFP kan kip anti-GFP (1:250) worden gebruikt. - Verwijder de blokkerende oplossing en voeg 1 ml primaire antilichaamoplossing toe aan elke put. Incubeer bij 4 °C met zachte rotatie gedurende 3 dagen.
- Na de primaire antilichaamincubatie wast u de embryo's 5 x 1 uur bij 20 RPM op een rocker in PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum.
- Bereid de secundaire antilichaamoplossing met behulp van F(ab')2 fragment secondaries bij een verdunning van 1:1.000 in PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum.
OPMERKING: Het gebruik van F(ab')2-fragmenten verbetert de penetratie van antilichamen in het monster aanzienlijk. - Voeg 1 ml secundaire antilichaamoplossing toe aan elk putje. Incubeer met zacht schommelen bij 4 °C in het donker gedurende 3 dagen.
OPMERKING: Belangrijk: Minimaliseer vanaf dit punt de blootstelling van embryo's aan direct licht. Optioneel: Om bacteriegroei te voorkomen, voegt u 0,2% natriumazide toe aan de secundaire antilichaamoplossing. - Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en was de embryo's 3 x 30 min in PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum. Als u geen actinekleuring met falloïdine of andere actinekleurstoffen uitvoert, voeg dan na de eerste wasbeurt 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe aan PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum en incubeer gedurende 1 uur, gevolgd door 3 x 30 minuten wasbeurten zoals hierboven beschreven.
OPMERKING: Op dit punt kunnen de embryo's 's nachts bij 4 °C in PBS of HBSS in het donker worden bewaard tot de inbeddingsstap de volgende dag. Het wordt echter aanbevolen dat embryo's onmiddellijk worden ingebed en gesneden.
2. Embryo-inbedding, sectie en montage
- Bereid een 4% w/v Low Melting Point (LMP) agarose oplossing opgelost in HBSS of PBS met Ca2+ en Mg2+ tot een eindvolume van ~3 ml per embryo. Voeg het juiste gewicht van LMP agarose toe aan HBSS of PBS met Ca2+ en Mg2+ en magnetron totdat de LMP agarose is opgelost.
OPMERKING: Zodra de LMP agarose is opgelost, bewaart u de oplossing in een kralenbad, incubator of waterbad dat is ingesteld op 55 °C om te voorkomen dat de LMP agarose-oplossing stolt. - Gebruik een 12-well plaat als de insluitvorm voor embryo's. Plaats de 12-well plaat in het 55 °C kralenbad. Voeg 2,5-3 ml 4% LMP agarose toe aan elke put die een embryo zal bevatten.
OPMERKING: Hoewel andere mallen kunnen worden gebruikt, zijn 12-well plaatvolumes optimaal voor het voorbereiden van het agarose-blok in latere stadia voor secties. - Breng de embryo's met een geperforeerde lepel over in individuele putten met 4% LMP agarose-oplossing (figuur 1A).
- Breng de 12-well plaat van het kralenbad over naar een benchtop. Gebruik pipetpunten om het embryo voorzichtig in te bedden en te oriënteren, zodat het gecentreerd is in de oplossing. Zodra de embryo's zijn georiënteerd, plaatst u de plaat gedurende 10 minuten op -20 °C om een snelle stolling van het blok mogelijk te maken.
KRITISCH: Zorg ervoor dat het embryo in het midden van het blok wordt geplaatst. Embryo's die naar de bodem zinken of te dicht bij de rand van de schimmel staan, zullen waarschijnlijk tijdens het doorsnijden uit het agarose-blok worden losgemaakt.
- Breng de 12-well plaat van het kralenbad over naar een benchtop. Gebruik pipetpunten om het embryo voorzichtig in te bedden en te oriënteren, zodat het gecentreerd is in de oplossing. Zodra de embryo's zijn georiënteerd, plaatst u de plaat gedurende 10 minuten op -20 °C om een snelle stolling van het blok mogelijk te maken.
- Verwijder het hele agaroseblok uit de put met behulp van een scalpel en snijd een rechthoekig blok rond het embryo waardoor ~ 0,3 cm blok aan elke kant achterblijft. Laat extra lengte toe langs het caudale uiteinde van het embryo. Wanneer het op het vibratoom wordt gemonteerd, richt u het embryo rechtop in het bovenste gedeelte van het blok (figuur 1B).
- Breng een strook tape aan op de monsterhouder van het vibratoom en secondelijm het agaroseblok op de tape, zo georiënteerd dat het blad axiale delen van het embryo genereert in een anterieure (craniale) naar posterieure sequentie.
- Vul de vibratomekamer met koude HBSS om ervoor te zorgen dat het monster volledig is ondergedompeld en omring de kamer vervolgens met ijs.
- Stel de vibratomsnelheid in op 0,2 mm/s en de frequentie tussen 5 en 7 (50-70 Hz) met een snijdikte ingesteld op 100 μm. Voer seriële axiale sectie van het embryo uit.
OPMERKING: Gebruik een lage snelheid voor secties. Als de snijsnelheid wordt verhoogd tot boven 0,25 mm/s, kan de doorsnede het embryo scheuren of het embryo uit het blok losmaken.- Gebruik tijdens de sectieserie een tang om afzonderlijke secties voorzichtig over te brengen naar een afzonderlijke schotel van 60 mm gevuld met HBSS. Gebruik een tang om het blok te grijpen, niet het weefsel, om weefselschade en vernietiging van cytonemen te voorkomen.
OPMERKING: Weefselsecties moeten binnen het agaroseblok blijven. Als het weefsel uit het blok in de vibratoomkamer valt, breng dan voorzichtig over door het gedeelte eruit te tillen. Pak of knijp het weefsel niet vast. KRITIEK: Elke vouwing van weefselsecties of abrupte behandeling zal vaste cytonemen in de weefselsecties vernietigen.
- Gebruik tijdens de sectieserie een tang om afzonderlijke secties voorzichtig over te brengen naar een afzonderlijke schotel van 60 mm gevuld met HBSS. Gebruik een tang om het blok te grijpen, niet het weefsel, om weefselschade en vernietiging van cytonemen te voorkomen.
- Als u geen F-actinekleuring uitvoert, gaat u verder met stap 2.10.
- Om F-actinekleuring uit te voeren, verwijdert u HBSS en incubeert u secties gedurende 40 minuten met Actin-Red en DAPI-oplossing verdund in PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum bij kamertemperatuur.
- Was secties 3 x 20 min in PBS met Ca2+ en Mg2+ en 0,1% Tween-20.
- Teken met behulp van een hydrofobe markeerpen een hydrofobe barrière rond de randen van een geladen microscoopglaasje en voeg een klein volume HBSS toe om het gebied te vullen.
- Gebruik een tang of een geperforeerde lepel om secties naar de dia over te brengen.
OPMERKING: Alle weefselsecties die niet in agarose zijn ingepakt, kunnen via een transferpipet worden overgebracht. - Verwijder overtollig agarose blok met behulp van een tang.
- Zodra alle secties naar de dia zijn overgebracht, verwijdert u overtollige vloeistof via pipetteren en de hoek van een absorberende handdoek en voegt u vervolgens enkele druppels montagemedium toe aan de dia. Gebruik voldoende bevestigingsmedium om het hele gebied van de afdekkingslip te bedekken wanneer het is uitgehard. Monteer de coverslip door deze voorzichtig op de glijbaan te plaatsen.
OPMERKING: Vermijd het uitoefenen van druk of storende coverslip totdat het montagemedium is uitgehard.
3. Beeldvorming
- Voer beeldvorming van weefselsecties uit op een confocale of hogere resolutie microscoop11. Analyseer minimaal drie embryo's per genotype.
OPMERKING: Beelden van weefselsecties werden verkregen met behulp van een TCS SP8 STED 3x confocale microscoop, gevolgd door LIGHTNING-deconvolutie.
Representative Results
Het gebruik van een grotere mal van een 12-wells plaat met 2,5-3 ml agarose-oplossing per put was ideaal voor het inbedden en opschorten van meerdere embryo's gedurende een korte periode (figuur 1A). Het overtollige oppervlak zorgt voor een juiste oriëntatie bij het snijden van het agarose-blok voor secties. Bij het snijden van het agaroseblok is het belangrijk om overtollige agarose langs de onderkant van het blok te houden, waar het op de tape op de objecthouder wordt gelijmd. Het embryo moet zich in de bovenste helft van het blok bevinden (figuur 1B). Het onderste gedeelte mag echter niet te groot zijn, omdat overtollig blok de kans vergroot dat de snijhoek verandert als het mes tijdens het snijden in het blok duwt. Voorbeelden van correct georiënteerde secties worden getoond (figuur 1C,D).
Tijdens de ontwikkeling van dit protocol werd vibratome sectioning vergeleken met cryostaat sectioning. Cryostaatsectie van het weefsel zelden bewaard gebleven cellulaire extensies (figuur 2 cryostaat en figuur 3A, B vibratoom). Cryostaatsecties maakten de detectie mogelijk van enkele GFP-positieve membraanfragmenten tussen cellen van het notochord en de neurale buis (figuur 2A pijlpunt) en tussen aangrenzende neurale buiscellen (figuur 2B, B'pijlpunten ). F-actinekleuring van cellulaire extensies in de zeer filamenteuze mesenchymale cellen rond de neurale buis was echter aangetast in cryostaatsecties (figuur 2C, C' -pijl, versus figuur 3C, D). Deze cryostaatresultaten geven aan dat er volgens deze methode slechts enkele sporen van gebroken cellulaire extensies overblijven. Vibratome-secties hebben dus de voorkeur om deze delicate extensies efficiënt te bewaren voor latere analyse.
Minimale verstoring van hele embryo- en individuele weefselsecties is essentieel voor hoogwaardige beeldvorming van cellulaire extensies. Weefselsecties die een vouwing of knik hebben ondergaan, zullen duidelijk zijn door de afwezigheid van het notochord of een grote scheiding (> 30 μm) tussen het notochord en de ventrale vloerplaat van de neurale buis (figuur 3B). Dit gaat meestal gepaard met verlies van mesenchymale cellen die normaal gesproken de neurale buis omringen (figuur 3A, pijl). Beschadigde secties zullen ook resulteren in een verlies van zichtbare cellulaire membraanuitbreidingen die migreren tussen epitheelcellen (figuur 3B vergeleken met figuur 3A, pijlpunten). Zelfs kleine vervormingen van de secties kunnen leiden tot fragmentatie van op actine gebaseerde extensies en grote openingen tussen cellen (figuur 3D, pijlpunten, vergeleken met goed bewaard gebleven figuur 3C), wat de noodzaak van delicate hantering bij alle stappen onderstreept.
Figuur 1: Voorbeeld van E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG gekleurd, ingebed en gesneden embryo. (A) Een enkel embryo in een 12-well plaat, ingebed in 4% LMP agarose. (B) Voorbeeld van een correct georiënteerd embryo in het agaroseblok dat op maat is gesneden voor vibratomemontage. Overtollig agaroseblok is aanwezig langs de bodem. (C) Helder veldbeeld van 100 μm dik embryogedeelte ingebed in LMP-agarose. (D) Immunofluorescentie beeldvorming van een sectie na verwijdering van agarose. Anti-GFP-gekleurde mGFP (groen) vertegenwoordigt Shh-expresserende cellen in het weefsel, met andere cellijningen die membraan tot expressie brengen Tomaat (rood), DAPI in blauw. Neurale buis (bracket) en mGFP-positieve notochord (pijl) zijn duidelijk zichtbaar. Schaalstaven = 1 cm (A), 5 mm (B) en 100 μm (C,D). Afkortingen: LMP = laag smeltpunt; mGFP = membraangroen fluorescerend eiwit; Shh = Sonic Egel; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld van cryostaat-gesneden neurale buisvloerplaat en notochord met gefragmenteerde membraanuitbreidingen. (A) 20 μm dik E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG 19,20,21 sectie gekleurd voor GFP (groen), F-actine (rood) en DAPI (blauw). mGFP puncta zijn zichtbaar tussen het notochord en de vloerplaat (pijlpunt) en (B,B') migreren tussen aangrenzende cellen van de neurale buis. (C,C') F-actinekleuring detecteert geen duidelijke cytonemen op mesenchymale cellen rond de neurale buis (pijl). Schaalstaven = 20 μm. Afkortingen: mGFP = membraangroen fluorescerend eiwit; Shh = Sonic Egel; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeelden van optimale en suboptimale vibratomweefselsecties en kleuring van de neurale buisvloerplaat, notochord en omliggende cellen. Voorbeelden van fijn behandelde secties (A,C), vergeleken met (B) een gevouwen weefselsectie en (D) een slecht behandelde sectie van een Shh-Cre; Rosa26 mTmG en een ShhGFP/+ embryo 19,20,21. Optimaal behandelde secties maken detectie van cytonemen tussen aangrenzend gelokaliseerde neurale epitheelcellen van de vloerplaat (A, pijlpunten) mogelijk. Neurale buis aangrenzend notochord (A, mGFP-expressing) en mesenchymale cellen (A, pijl) moeten zichtbaar zijn. (C,D) F-actine- en DAPI-gekleurde secties moeten een consistente afstand hebben van mesenchymale cellen en op F-actine gebaseerde cytonemen (pijlen) rond de neurale buis en notochord (C). Elke kleine vouwing of verstoring van de secties kan openingen en gebroken F-actinefragmenten (D, pijlpunten) veroorzaken. Schaalstaven = 10 μm. Afkortingen: mGFP = membraangroen fluorescerend eiwit; Shh = Sonic Egel; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit protocol is ontwikkeld voor het behoud van delicate cytonemen in embryonale weefselsecties voor fluorescentiemicroscopie met hoge resolutie. Tot op heden is de visualisatie van cytonemen in weefsel in verschillende modelorganismen grotendeels gebaseerd op ectopische expressie van fluorescerend gelabelde eiwitten met behulp van live-tissue imaging. Helaas is het gebruik van fluorescerend gelabelde live-imaging zelden bevorderlijk voor de analyse van endogene tot expressie gebrachte eiwitten, kan het tijdsdruk introduceren en vereist het gespecialiseerde beeldvormingsfasen en microscopen. De hier beschreven kleurings- en sectiemethode behoudt cytonemen en andere cellulaire uitbreidingen om immunohistochemie mogelijk te maken voor de uiteindelijke detectie van endogene tot expressie gebrachte eiwitten. Deze technologie zal nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe morfogenen in vivo over verschillende weefsels worden getransporteerd en breidt het bereik van modelsystemen uit waar cytonemen kunnen worden bestudeerd.
Dit protocol maakt gebruik van hele-mount kleuring en vibratome dikke-sectie, die het gebruik van equilibratie-oplossing zoals glycerol of cryoprotectante oplossingen zoals sucrose vermijdt. Het doel is om de behandeling van gesneden weefsel te minimaliseren om het maximale behoud van cellulaire extensies mogelijk te maken. Verminderde behandeling van het weefsel na secties leverde consistent betere resultaten op in het algehele behoud van cytonemen. Het doorsnijden van het embryo is dus een van de laatste stappen voorafgaand aan beeldvorming.
MEM-fix, een fixatietechniek ontwikkeld voor het behoud van cytonemen van gekweekte cellen, bestaat uit een combinatie van glutaaraldehyde en PFA die een verbeterd 3D-behoud van de aangeboren celarchitectuur mogelijk maakt, vergelijkbaar met hun levende afmetingen16,17. Helaas was MEM-fix niet nuttig voor embryofixatie omdat glutaaraldehyde automatisch kan fluoresceren en de penetratie van antilichamen en epitoopbinding in cellen ernstig beperkt vanwege een hoge eiwit-crosslinkingsactiviteit 22,23. Zo werden sectieprotocollen na PFA-fixatieomstandigheden geoptimaliseerd om het behoud van cellulaire extensies in embryonaal weefsel mogelijk te maken. Hoewel PFA cytoneme-achtige extensies in embryonaal weefsel kan behouden, moet beeldanalyse met voorzichtigheid worden uitgevoerd. PFA kan gedeeltelijke uitdroging van individuele cellen en weefsels veroorzaken, wat leidt tot een kleine volumereductie en de vorming van kleine extracellulaire ruimtes in het vaste weefsel.
Dit protocol vermijdt de extra stappen van sucrose-verzadiging voor cryoprotectie en weefselzuivering omdat sucrose- of glyceroloplossingen een kleine verzadiging van het weefsel kunnen veroorzaken24. De resulterende kleine zwelling kan vaste cellulaire extensies en cytonemen vernietigen die migreren tussen cellen en over weefsels. Dit bleek duidelijk bij het vergelijken van dikgesneden vibratomen met cryostaatsecties. Hoewel de toenemende weefseldikte het behoud van intacte cytonemen verbeterde, hadden de sucrose-gereatureerde cryostaatsecties consequent een lagere incidentie van detecteerbare cytonemen.
Optimalisatie van dit protocol onthulde dat 100 μm dikke secties het beste waren voor het behoud van intacte cytonemen. Dunnere secties worden meestal gebruikt voor beeldvorming omdat de meeste confocale microscopen alleen in staat zijn om met voldoende resolutie beeld te geven om cellulaire uitbreidingen tot een diepte van ~ 20-40 μm te visualiseren zonder25 te wissen. De mechanische krachten en vervorming die worden toegepast op embryonale cellen van het mes tijdens het snijden van dunne secties vernietigen cytonemen. Dikkere secties zorgen voor een groter gebied van diepte binnen de sectie met behoud van intacte uitbreidingen in het weefsel. Bovendien zorgt het gebruik van dikkere secties voor gebruiksgemak om overmatig vouwen of knikken van de weefselsecties te voorkomen.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor het maximaal behoud van cytonemen in weefsel van E8-10,5 muizenembryo's. Minimale manipulatie van het weefsel na sectie zorgde voor een consistent verbeterd algemeen behoud van cytonemen. Het is waarschijnlijk dat verdere optimalisatie nodig zal zijn om de techniek aan te passen voor latere ontwikkelingsstadia en volwassen weefselsecties vanwege de toegenomen omvang en weefselcomplexiteit. Dit vereist sectie gevolgd door immunofluorescentiekleuring. Dergelijk weefsel kan extra opruimstappen en aanpassing van weefselbehandeling tijdens de sectie vereisen om cytoneme-achtige extensies te behouden. Deze aanvullende stappen moeten worden overwogen en aangepakt voor toekomstige toepassingen van dit protocol.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te verklaren.
Acknowledgments
Beelden werden verkregen met behulp van microscopen die werden onderhouden door de Cell and Molecular Biology Imaging Core in het St. Jude Children's Research Hospital. Muizenstammen werden verkregen uit JAX. Dit werk werd ondersteund door national institutes of health grant R35GM122546 (SKO) en door ALSAC van St. Jude Children's Research Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
| 24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
| Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
| Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
| Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
| chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
| CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
| Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
| Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
| Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
| Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
| Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
| Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
| Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
| Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
| PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
| Super Glue | Gorilla | ||
| SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
| Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
| Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |
References
- Crick, F.
- Zeng, X., et al. A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling. Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).
- Yu, S. R., et al. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).
- Zhou, S., et al. Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc. Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).
- Ribes, V., Briscoe, J. Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).
- Le Dréau, G., Martí, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).
- Kornberg, T. B., Guha, A. Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (4), 264-271 (2007).
- Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
- Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
- Bischoff, M., et al. Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia. Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).
- Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. eLife. 10, 61432 (2021).
- Huang, H., Kornberg, T. B. Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes. eLife. 5, 18979 (2016).
- Brunt, L., et al. Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/β-catenin signaling. Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Mattes, B., et al. Wnt/PCP controls spreading of Wnt/β-catenin signals by cytonemes in vertebrates. eLife. 7, 36953 (2018).
- Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport. Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).
- Hall, E. T., Ogden, S. K. Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation. Bio-protocol. 8 (13), (2018).
- American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals. American Veterinary Medical Association. , (2020).
- Harfe, B. D., et al. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-528 (2004).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 368-380 (2006).
- Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method. Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).
