Summary
Her leveres en optimeret trin-for-trin protokol til fiksering, immunostaining og sektionering af embryoner for at detektere specialiseret signalfilopodia kaldet cytonomer i udvikling af musevæv.
Abstract
Udviklingsvævsmønster og postdevelopmental vævshomeostase afhænger af kontrolleret levering af cellulære signaler kaldet morfogener. Morfogener virker på en koncentrations- og tidsafhængig måde for at specificere forskellige transkriptionsprogrammer, der instruerer og forstærker celle skæbne. En mekanisme, hvormed passende morfogensignaleringstærskler sikres, er gennem levering af signalproteinerne af specialiserede filopodier kaldet cytonomer. Cytonomer er meget tynde (≤200 nm i diameter) og kan vokse til længder på flere hundrede mikron, hvilket gør deres bevarelse til fast billedanalyse udfordrende. Dette papir beskriver en raffineret metode til delikat håndtering af museembryoner til fiksering, immunostaining og tyk sektionering for at muliggøre visualisering af cytonomer ved hjælp af standard konfokal mikroskopi. Denne protokol er med succes blevet brugt til at visualisere cytonomer, der forbinder forskellige cellulære signalrum under musens neuralrørsudvikling. Teknikken kan også tilpasses til at detektere cytonomer på tværs af vævstyper for at lette forhør af udviklingssignalering ved hidtil uset opløsning.
Introduction
Embryonal udvikling er orkestreret gennem koordineret aktivering af morfogensignaleringsveje. Morfogener er små, udskillede proteiner, der er kategoriseret i Sonic Hedgehog (SHH), transformerende vækstfaktor β (TGF-β) / knoglemorfogen protein (BMP), Wingless-relateret integrationssted (WNT) og fibroblast og epidermal vækstfaktor (FGF / EGF) familier. Morfogener produceres og frigives fra cellulære organiseringscentre under vævsudvikling og etablerer signalgradienter på tværs af organiserende cellefelter for at informere vævsmorfogenese 1,2,3,4,5. En repræsentation af morfogengradienter findes i det udviklende nervesystem, hvor det formodede centralnervesystem er mønstret gennem aktivering af morfogenvejen. Dette væv, kaldet neuralrøret, består af modsatte gradienter af SHH udskilt af den ventrale notokord og gulvplade og WNT'er / BMP'er udskilt fra dorsal tagpladen for at mønstre forskellige neurale stamfaderområder6. Neuralrøret er almindeligt anvendt til at forhøre morfogen gradient integritet i udviklingsforskning.
Morphogen gradientdannelse er afhængig af stram regulering af signaldispersion7. En cellulær mekanisme, hvormed dette sker, er gennem dannelsen af lang signalfilopodia kaldet cytonomer, der letter direkte levering af morfogener fra signalproducerende celler til specifikke målcellepopulationer. Cytonomer er blevet observeret at strække hundredvis af mikrometer til deponering af morfogener på signalmodtagende cellemembraner 8,9. Forstyrrelse af cytonemmedieret morfogentransport fører til udviklingsmæssige anomalier hos både fluer og hvirveldyr, hvilket fremhæver deres betydning under vævsmønster 10,11,12,13,14.
Til dato er cytonomer blevet dokumenteret i Drosophila-, kylling- og zebrafiskmodeller, men billeddannelse af strukturerne i udviklingen af pattedyrembryoner er fortsat udfordrende 8,9,15. En hindring for effektiv billeddannelse af cytonomer i komplekse pattedyrvæv in situ er deres tynde og skrøbelige natur, hvilket gør dem modtagelige for skader ved konventionelle fikseringsmetoder8. Vi havde tidligere udviklet og optimeret protokoller til et modificeret elektronmikroskopifikseringsmiddel (MEM-fix) for at bevare cytonomer i dyrkede celler og muliggøre deres undersøgelse ved hjælp af konfokal mikroskopi16,17.
Anvendelse af MEM-fix-teknikken har gjort det muligt at identificere nogle af de molekyler, der er involveret i SHH-induceret cytonemdannelse og funktion 11,16,17. Bekræftelse af disse fund i den fysiologisk relevante sammenhæng med neuralrørsmønster nødvendiggjorde imidlertid udviklingen af nye teknikker til at fiksere og afbilde museembryonvæv. En protokol til fastsættelse af museembryoner på en måde, der opretholder cytonemintegritet og tillader immunostaining og efterfølgende sektionering af embryonalt væv til konfokal analyse, er skitseret her. Denne protokol blev udviklet ved hjælp af et membranbundet grønt fluorescerende protein (GFP) til at mærke membranforlængelser fra de SHH-producerende celler i det udviklende neuralrør. Implementering af denne protokol vil behandle ubesvarede spørgsmål vedrørende forekomsten og betydningen af cytonemer i udviklingen af pattedyrsystemer.
Protocol
Denne protokol følger de godkendte retningslinjer for dyrepleje fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og St. Jude Children's Research Hospital. Alle stammer blev krydset fem generationer tilbage til C57BL/6J-stammen.
1. Embryoisolering og farvning af hele monteringen
- Opdræt 6 uger gamle kvinder og overvåge for tilstedeværelsen af vaginalprop.
- Afliv den gravide dæmning ved CO2 -indånding i et CO2 - kammer efterfulgt af cervikal dislokation i henhold til AVMA -retningslinjerne18. Lav et Y-snit til bughulen ved hjælp af dissekeringssaks og tang. Skær livmoderen, der indeholder E9.5-embryonerne i henhold til godkendte institutionelle retningslinjer.
- Disseker embryonerne i komplet vækstmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, suppleret med uvæsentlige aminosyrer, Na-pyruvat, L-glutamin og 10% føtalt bovint serum). Brug pincet til at fjerne æggeblomme, placenta og omgivende membraner.
BEMÆRK: Når det er nødvendigt, gem hver æggeblomme til embryogenotypning. - Skyl de isolerede embryoner i Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) for at fjerne eventuelt resterende fostervand og blod.
- Forbered fikseringsmidlet. Tilføj paraformaldehyd (PFA) til HBSS for en endelig arbejdskoncentration på 4% PFA.
FORSIGTIG: PFA er et giftigt kemikalie, så indånding eller direkte hudeksponering skal undgås. Forberedelse af den fikserende opløsning udføres under en røghætte med det rette personlige beskyttelsesudstyr af handsker og en laboratoriefrakke. - Tilsæt 1 ml fikseringsmiddel til hver brønd i en 24-brøndplade og læg hvert embryo i en individuel brønd. Inkuber embryonerne i fikseringsmiddel i 45 minutter med blid omrøring på en vippe.
BEMÆRK: Kritisk: Alle vaske og inkubationer skal udføres med skånsom omrøring (maks. 20 o / min) på en vippe eller cirkulær ryster, da pludselig håndtering eller bevægelse af embryonerne vil ødelægge de faste cytonomer. Brug en pipette til forsigtigt at fjerne alle opløsninger. - Fikseringsmidlet fjernes, og embryonerne vaskes 3 x 30 min i fosfatbufferet saltvand (PBS) med Ca2+ og Mg2+ tilsat 0,1 % triton.
- Efter vask inkuberes embryonerne i blokerende opløsning (PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1% Triton og 5% gedeserum) med blid omrøring. Blok 2 x 1 time. Efter den anden blokerende inkubation udføres en hurtig skylning af embryonerne ved hjælp af frisk blokeringsopløsning.
- Under det andet blokeringstrin skal du forberede den primære antistofopløsning11. Antistofferne fortyndes til den optimerede koncentration i PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1 % Tween-20 og 5 % gedeserum.
BEMÆRK: For forbedret visualisering af membran GFP kan kylling anti-GFP (1:250) anvendes. - Fjern blokeringsopløsningen, og tilsæt 1 ml primær antistofopløsning til hver brønd. Inkuberes ved 4 °C med skånsom rotation i 3 dage.
- Efter den primære antistofinkubation vaskes embryonerne 5 x 1 time ved 20 o / min på en vippe i PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1% Tween-20 og 5% gedeserum.
- Den sekundære antistofopløsning fremstilles ved hjælp af F(ab')2 fragment secondaries ved en fortynding på 1:1.000 i PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1 % Tween-20 og 5 % gedeserum.
BEMÆRK: Brug af F(ab')2-fragmenter forbedrer i høj grad antistofindtrængning i prøven. - Tilsæt 1 ml sekundær antistofopløsning til hver brønd. Inkuberes med blid vuggen ved 4 °C i mørke i 3 dage.
BEMÆRK: Vigtigt: Fra dette tidspunkt skal du minimere embryoeksponering for direkte lys. Valgfrit: For at forhindre bakterievækst tilsættes 0,2% natriumazid til den sekundære antistofopløsning. - Den sekundære antistofopløsning fjernes, og embryonerne vaskes 3 x 30 minutter i PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1 % Tween-20 og 5 % gedeserum. Hvis der ikke udføres actinfarvning med phalloidin eller andre actinfarvestoffer, tilsættes efter første vask 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1% Tween-20 og 5% gedeserum og inkuberes i 1 time efterfulgt af 3 x 30 minutters vaske som beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan embryonerne opbevares natten over ved 4 °C i PBS eller HBSS i mørke indtil indlejringstrinnet den følgende dag. Det anbefales dog, at embryoner indlejres og sektioneres straks.
2. Embryoindlejring, sektionering og montering
- Der fremstilles en 4% w/v lav smeltepunkts (LMP) agaroseopløsning opløst i HBSS eller PBS med Ca2+ og Mg2+ til et endeligt volumen på ~3 ml pr. embryo. Der tilsættes en passende vægt af LMP-agarose til HBSS eller PBS med Ca2+ og Mg2+ og mikrobølgeovn, indtil LMP-agarosen er opløst.
BEMÆRK: Når LMP-agarosen er opløst, opbevares opløsningen i et perlebad, inkubator eller vandbad indstillet til 55 °C for at forhindre, at LMP-agaroseopløsningen størkner. - Brug en 12-brønds plade som indlejringsform til embryoner. Anbring pladen med 12 brønde i 55 °C perlebadet. Tilsæt 2,5-3 ml 4% LMP-agarose til hver brønd, der holder et embryo.
BEMÆRK: Selvom andre forme kan bruges, er 12-brønds pladevolumener optimale til forberedelse af agaroseblokken på senere stadier til sektionering. - Ved hjælp af en perforeret ske overføres embryonerne til individuelle brønde indeholdende 4% LMP agaroseopløsning (figur 1A).
- Overfør pladen med 12 brønde fra perlebadet til en bordplade. Brug pipettespidser til forsigtigt at indlejre og orientere embryoet, så det er centreret i opløsningen. Når embryonerne er orienteret, placeres pladen ved -20 ° C i 10 minutter for at muliggøre hurtig størkning af blokken.
KRITISK: Sørg for, at embryoet er placeret i midten af blokken. Embryoner, der synker til bunden eller er for tæt på kanten af formen, vil sandsynligvis blive løsnet fra agaroseblokken under sektionering.
- Overfør pladen med 12 brønde fra perlebadet til en bordplade. Brug pipettespidser til forsigtigt at indlejre og orientere embryoet, så det er centreret i opløsningen. Når embryonerne er orienteret, placeres pladen ved -20 ° C i 10 minutter for at muliggøre hurtig størkning af blokken.
- Fjern hele agaroseblokken fra brønden ved hjælp af en skalpel og skær en rektangulær blok rundt om embryoet og efterlad ~ 0,3 cm blok på hver side. Tillad ekstra længde langs den kaudale ende af embryoet. Når det er monteret på vibratomet, orienteres embryoet i opretstående stilling i den øverste del af blokken (figur 1B).
- Påfør en strimmel tape på prøveholderen af vibratomet og superlim agaroseblokken til båndet, orienteret, så bladet genererer aksiale sektioner af embryoet i en forreste (kranial) til bageste sekvens.
- Fyld vibratomkammeret med kold HBSS for at sikre, at prøven er helt nedsænket, og omgiv derefter kammeret med is.
- Vibratomhastigheden indstilles til 0,2 mm/s og frekvensen mellem 5 og 7 (50-70 Hz) med snittykkelsen indstillet til 100 μm. Udfør seriel aksial sektionering af embryoet.
BEMÆRK: Brug en langsom hastighed til sektionering. Hvis skærehastigheden øges til over 0,25 mm/s, kan sektionering rive embryoet eller fjerne embryoet fra blokken.- Under sektioneringsserien skal du bruge tang til forsigtigt at overføre individuelle sektioner til en separat 60 mm skål fyldt med HBSS. Brug pincet til at gribe fat i blokken, ikke vævet, for at undgå vævsskade og ødelæggelse af cytonomer.
BEMÆRK: Vævssektioner skal forblive inden for agaroseblokken. Hvis vævet falder ud af blokken ind i vibratomkammeret, skal du forsigtigt overføre ved at løfte sektionen ud. Tag ikke fat i eller klem vævet. KRITISK: Enhver foldning af vævssektioner eller pludselig håndtering vil ødelægge faste cytonomer i vævssektionerne.
- Under sektioneringsserien skal du bruge tang til forsigtigt at overføre individuelle sektioner til en separat 60 mm skål fyldt med HBSS. Brug pincet til at gribe fat i blokken, ikke vævet, for at undgå vævsskade og ødelæggelse af cytonomer.
- Hvis du ikke udfører F-actinfarvning, skal du fortsætte til trin 2.10.
- For at udføre F-actinfarvning skal du fjerne HBSS og inkubere sektioner i 40 minutter med Actin-Red og DAPI-opløsning fortyndet i PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1% Tween-20 og 5% gedeserum ved stuetemperatur.
- Vask sektioner 3 x 20 min i PBS med Ca2+ og Mg2+ og 0,1% Tween-20.
- Brug en hydrofob markørpen til at tegne en hydrofob barriere rundt om kanterne af et ladet mikroskopglas og tilsæt et lille volumen HBSS for at fylde området.
- Brug pincet eller en perforeret ske til at overføre sektioner til diaset.
BEMÆRK: Eventuelle vævssektioner, der ikke er indkapslet i agarose, kan overføres via en overførselspipette. - Fjern overskydende agaroseblok ved hjælp af tang.
- Når alle sektioner er overført til diaset, skal du fjerne overskydende væske via pipettering og hjørnet af en absorberende håndklæde og derefter tilføje flere dråber monteringsmedium til diaset. Brug nok monteringsmedium til at dække hele dækslipområdet, når det er hærdet. Monter dækslippen ved forsigtigt at placere den på diaset.
BEMÆRK: Undgå at påføre tryk eller forstyrre dækslip, indtil monteringsmediet er hærdet.
3. Billedbehandling
- Udfør billeddannelse af vævssektioner på ethvert konfokalt eller højere opløsningsmikroskop11. Analyser mindst tre embryoner pr. Genotype.
BEMÆRK: Billeder af vævssektioner blev erhvervet ved hjælp af et TCS SP8 STED 3x konfokalt mikroskop efterfulgt af LIGHTNING-dekonvolution.
Representative Results
Anvendelse af en større form af en 12-brøndplade med 2,5-3 ml agaroseopløsning pr. Brønd var ideel til indlejring og suspension af flere embryoner over en kort periode (figur 1A). Det overskydende areal giver mulighed for korrekt orientering, når agaroseblokken skæres til sektionering. Når du skærer agaroseblokken, er det vigtigt at opretholde overskydende agarose langs bunden af blokken, hvor den limes til båndet på objektholderen. Embryoet skal være i den øverste halvdel af blokken (figur 1B). Den nederste sektion bør dog ikke være for stor, da overskydende blok øger chancerne for at ændre skærevinklen, da bladet skubber ind i blokken under sektionering. Eksempler på korrekt orienterede sektioner er vist (figur 1C, D).
Under udviklingen af denne protokol blev vibratomsektionering sammenlignet med kryostatsektionering. Kryostatsektionering af vævet sjældent bevarede cellulære forlængelser (figur 2 kryostat og figur 3A, B vibratom). Kryostatsektioner tillod påvisning af nogle GFP-positive membranfragmenter mellem celler i notokord og neuralrør (figur 2A pilespids) og mellem tilstødende neuralrørsceller (figur 2B, B ' pilespidser). F-actinfarvning af cellulære forlængelser i de stærkt trådformede mesenkymale celler, der omgiver neuralrøret, blev imidlertid forringet i kryostatsektioner (figur 2C, C ' pil, vs figur 3C, D). Disse kryostatresultater indikerer, at kun nogle spor af ødelagte cellulære udvidelser forbliver efter denne metode. Således foretrækkes vibratomsektionering for effektivt at bevare disse sarte udvidelser til efterfølgende analyse.
Minimal forstyrrelse af hele embryo- og individuelle vævsafsnit er afgørende for billeddannelse af høj kvalitet af cellulære forlængelser. Vævssektioner, der har gennemgået en foldning eller buckling, vil være tydelige ved fraværet af notokordet eller en stor adskillelse (>30 μm) mellem notokordet og neuralrørets ventrale gulvplade (figur 3B). Dette ledsages normalt af tab af mesenkymale celler, der normalt omgiver neuralrøret (figur 3A, pil). Beskadigede sektioner vil også resultere i tab af synlige cellulære membranforlængelser, der migrerer mellem epitelceller (figur 3B sammenlignet med figur 3A, pilespidser). Selv mindre forvrængninger af sektionerne kan forårsage fragmentering af actinbaserede udvidelser og store huller mellem celler (figur 3D, pilespidser sammenlignet med velbevaret figur 3C), hvilket understreger behovet for delikat håndtering i alle trin.
Figur 1: Eksempel på E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG farvet, indlejret og snittet embryo. (A) Et enkelt embryon i en 12-brønds plade, indlejret i 4% LMP agarose. (B) Eksempel på et korrekt orienteret embryo i agaroseblokken skåret ned til størrelse til vibratommontering. Overskydende agaroseblok er til stede langs bunden. (C) Lyst feltbillede af 100 μm tyk embryosektion indlejret i LMP-agarose. (D) Immunofluorescensbilleddannelse af et afsnit efter fjernelse af agarose. Anti-GFP-farvet mGFP (grøn) repræsenterer Shh-ekspressive celler i vævet, med andre cellelinjer, der udtrykker membran Tomat (rød), DAPI i blå. Neuralrør (parentes) og mGFP-positiv notokord (pil) er tydeligt synlige. Skalastænger = 1 cm (A), 5 mm (B) og 100 μm (C, D). Forkortelser: LMP = lavt smeltepunkt; mGFP = membran grønt fluorescerende protein; Shh = Sonic Hedgehog; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempel på kryostat-sektioneret neuralrør gulvplade og notokord med fragmenterede membranforlængelser. (A) 20 μm tyk E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG 19,20,21 sektion farvet til GFP (grøn), F-actin (rød) og DAPI (blå). mGFP puncta er synlige mellem notokord og gulvplade (pilespids) og (B, B ') migrerer mellem tilstødende celler i neuralrøret. (C,C') F-actinfarvning registrerer ikke klare cytonomer på mesenkymale celler, der omgiver neuralrøret (pil). Skalastænger = 20 μm. Forkortelser: mGFP = membran grønt fluorescerende protein; Shh = Sonic Hedgehog; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempler på optimale og suboptimale vibratomvævssektioner og farvning af neuralrørets gulvplade, notokord og omgivende celler. Eksempler på delikat håndterede sektioner (A, C) sammenlignet med (B) en foldet vævssektion og (D) en dårligt håndteret sektion fra en Shh-Cre; Rosa26 mTmG og et ShhGFP/+ embryo 19,20,21. Optimalt håndterede sektioner muliggør påvisning af cytonomer mellem tilstødende lokaliserede neurale epitelceller fra gulvpladen (A, pilespidser). Neuralrør tilstødende notochord (A, mGFP-ekspressive) og mesenkymale celler (A, pil) skal være synlige. (C,D) F-actin- og DAPI-farvede sektioner skal have konsekvent afstand mellem mesenkymale celler og F-actinbaserede cytonomer (pile), der omgiver neuralrøret og notokord (C). Enhver mindre foldning eller forstyrrelse af sektionerne kan forårsage huller og ødelagte F-actinfragmenter (D, pilespidser). Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: mGFP = membran grønt fluorescerende protein; Shh = Sonic Hedgehog; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne protokol blev udviklet til bevarelse af sarte cytonomer i embryonale vævssektioner til fluorescensmikroskopi med høj opløsning. Til dato har visualisering af cytonomer i væv på tværs af forskellige modelorganismer i vid udstrækning været afhængig af ektopisk ekspression af fluorescerende mærkede proteiner ved hjælp af levende vævsbilleddannelse. Desværre er brugen af fluorescerende mærket levende billeddannelse sjældent befordrende for analysen af endogent udtrykte proteiner, kan indføre tidsbegrænsninger og kræver specialiserede billeddannelsesstadier og mikroskoper. Farvnings- og sektioneringsmetoden, der er beskrevet her, bevarer cytonomer og andre cellulære udvidelser for at muliggøre immunohistokemi til eventuel påvisning af endogent udtrykte proteiner. Denne teknologi vil lette ny indsigt i, hvordan morfogener transporteres på tværs af forskellige væv in vivo og udvider omfanget af modelsystemer, hvor cytonomer kan studeres.
Denne protokol bruger helmonteret farvning og vibratom tyksektion, hvilket undgår brugen af ligevægtsopløsning såsom glycerol eller kryobeskyttende opløsninger såsom saccharose. Det sigter mod at minimere sektionsopdelt vævshåndtering for at muliggøre maksimal bevarelse af cellulære udvidelser. Reduceret håndtering af vævet efter sektionering gav konsekvent bedre resultater i den samlede bevarelse af cytonomer. Sektionering af embryoet er således et af de sidste trin inden billeddannelse.
MEM-fix, en fikseringsteknik udviklet til konservering af cytonomer af dyrkede celler, består af en kombination af glutaraldehyd og PFA, der muliggør forbedret 3D-bevarelse af den medfødte cellearkitektur, der kan sammenlignes med deres levende dimensioner16,17. Desværre var MEM-fix ikke nyttigt til embryofiksering, fordi glutaraldehyd kan autofluoresere og alvorligt begrænser antistofindtrængning og epitopbinding i celler på grund af høj protein tværbindingsaktivitet22,23. Således blev sektioneringsprotokoller efter PFA-fikseringsbetingelser optimeret for at muliggøre bevarelse af cellulære forlængelser i embryonalt væv. Selvom PFA kan bevare cytonemlignende forlængelser i embryonalt væv, bør billedanalyse udføres med forsigtighed. PFA kan forårsage delvis dehydrering af individuelle celler og væv, hvilket fører til mindre volumenreduktion og dannelse af små ekstracellulære rum i det faste væv.
Denne protokol undgår de ekstra trin i saccharosegenmætning til kryobeskyttelse og vævsclearvning, fordi saccharose- eller glycerolopløsninger kan forårsage en mindre genmætning af vævet24. Den resulterende mindre hævelse kan ødelægge faste cellulære forlængelser og cytonomer, der migrerer mellem celler og på tværs af væv. Dette var tydeligt, når man sammenlignede tyksnittet vibratom med kryostatsektioner. Selvom stigende vævstykkelse forbedrede bevarelsen af intakte cytonomer, havde de saccharose-resaturerede kryostatsektioner konsekvent en lavere forekomst af påviselige cytonomer.
Optimering af denne protokol afslørede, at 100 μm tykke sektioner var de bedste til at sikre bevarelse af intakte cytonemer. Tyndere sektioner bruges typisk til billeddannelse, fordi de fleste konfokale mikroskoper kun er i stand til billeddannelse med tilstrækkelig opløsning til at visualisere cellulære udvidelser til en dybde på ~ 20-40 μm uden at rydde25. Imidlertid ødelægger de mekaniske kræfter og forvrængning, der påføres embryonale celler fra bladet, mens de skæres tynde sektioner, cytonomer. Tykkere sektioner giver mulighed for et større dybdeområde inden for sektionen, samtidig med at intakte forlængelser i vævet bevares. Derudover giver brugen af tykkere sektioner mulighed for nem håndtering for at forhindre overdreven foldning eller buckling af vævssektionerne.
Denne protokol blev optimeret til maksimal bevarelse af cytonomer i væv af E8-10,5 museembryoner. Minimal manipulation af vævet efter sektionering gav konsekvent forbedret samlet bevarelse af cytonemer. Det er sandsynligt, at yderligere optimering vil være nødvendig for at tilpasse teknikken til senere udviklingsstadier og voksenvævssektioner på grund af øget størrelse og vævskompleksitet. Dette vil kræve sektionering efterfulgt af immunfluorescensfarvning. Sådant væv kan kræve yderligere rydningstrin og tilpasning af vævshåndtering under sektionering for at bevare cytonemlignende forlængelser. Disse yderligere trin skal overvejes og behandles i forbindelse med fremtidige anvendelser af denne protokol.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at erklære.
Acknowledgments
Billeder blev erhvervet ved hjælp af mikroskoper vedligeholdt af Cell and Molecular Biology Imaging Core på St. Jude Children's Research Hospital. Musestammer blev opnået fra JAX. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health grant R35GM122546 (SKO) og af ALSAC fra St. Jude Children's Research Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
| 24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
| Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
| Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
| Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
| chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
| CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
| Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
| Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
| Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
| Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
| Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
| Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
| Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
| Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
| PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
| Super Glue | Gorilla | ||
| SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
| Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
| Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |
References
- Crick, F.
- Zeng, X., et al. A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling. Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).
- Yu, S. R., et al. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).
- Zhou, S., et al. Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc. Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).
- Ribes, V., Briscoe, J. Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).
- Le Dréau, G., Martí, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).
- Kornberg, T. B., Guha, A. Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (4), 264-271 (2007).
- Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
- Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
- Bischoff, M., et al. Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia. Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).
- Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. eLife. 10, 61432 (2021).
- Huang, H., Kornberg, T. B. Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes. eLife. 5, 18979 (2016).
- Brunt, L., et al. Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/β-catenin signaling. Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Mattes, B., et al. Wnt/PCP controls spreading of Wnt/β-catenin signals by cytonemes in vertebrates. eLife. 7, 36953 (2018).
- Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport. Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).
- Hall, E. T., Ogden, S. K. Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation. Bio-protocol. 8 (13), (2018).
- American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals. American Veterinary Medical Association. , (2020).
- Harfe, B. D., et al. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-528 (2004).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 368-380 (2006).
- Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method. Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).
