Summary
כאן, פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב מסופק לקיבוע, חיסון וחתך של עוברים כדי לזהות פילופודיה איתותית מיוחדת הנקראת ציטונמות ברקמות עכבר מתפתחות.
Abstract
דפוס רקמה התפתחותית והומאוסטזיס של רקמות לאחר התפתחות תלויים בהעברה מבוקרת של אותות תאיים הנקראים מורפוגנס. מורפוגנים פועלים באופן תלוי ריכוז וזמן כדי לציין תוכניות שעתוק נפרדות המנחות ומחזקות את גורל התא. מנגנון אחד שבאמצעותו מובטחים ספי איתות מורפוגן מתאימים הוא באמצעות אספקת חלבוני האיתות על ידי פילופודיה מיוחדת הנקראת ציטונמות. ציטונמים הם דקים מאוד (בקוטר ≤200 ננומטר) ויכולים לגדול לאורכים של כמה מאות מיקרונים, מה שהופך את שימורם לניתוח תמונה קבועה למאתגר. מאמר זה מתאר שיטה מעודנת לטיפול עדין בעוברי עכברים לצורך קיבוע, חיסון וחתך עבה כדי לאפשר הדמיה של ציטונומים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי לדמיין ציטונים המחברים תאי איתות תאיים מובחנים במהלך פיתוח תעלה עצבית של עכבר. ניתן גם להתאים את הטכניקה לזיהוי ציטונמים על פני סוגי רקמות כדי להקל על חקירת איתות התפתחותי ברזולוציה חסרת תקדים.
Introduction
ההתפתחות העוברית מתוזמרת באמצעות הפעלה מתואמת של מסלולי איתות מורפוגן. מורפוג'נים הם חלבונים קטנים ומופרשים המסווגים לקיפוד סוניק (SHH), מה שהופך את גורם הגדילה β (TGF-β)/חלבון מורפוגני עצם (BMP), אתר אינטגרציה ללא כנפיים (WNT) ומשפחות פיברובלסטים וגורמי גדילה אפידרמליים (FGF/EGF). מורפוגנים מיוצרים ומשתחררים ממרכזי התארגנות תאית במהלך התפתחות הרקמות ויוצרים שיפועי איתות על פני שדות מארגנים של תאים כדי ליידע את מורפוגנזה של רקמות 1,2,3,4,5. ייצוג אחד של גרדיאנטים של מורפוגן נמצא במערכת העצבים המתפתחת, שם מערכת העצבים המרכזית המשוערת מעוצבת באמצעות הפעלת מסלול מורפוגן. רקמה זו, המכונה הצינור העצבי, מורכבת משיפועים מנוגדים של SHH המופרשים על ידי הנוטוקורד הגחוני ביותר ולוח הרצפה, ו- WNTs / BMPs המופרשים מלוח הגג הגבי, כדי לעצב אזורי אב עצביים מובחנים6. הצינור העצבי משמש בדרך כלל לחקר שלמות השיפוע של מורפוגן במחקר התפתחותי.
היווצרות גרדיאנט מורפוגן מסתמכת על ויסות הדוק של פיזורהאותות 7. מנגנון תאי אחד שבאמצעותו זה מתרחש הוא באמצעות היווצרות של פילופודיה איתותית ארוכה הנקראת ציטונמות המאפשרות העברה ישירה של מורפוגנים מתאים המייצרים אותות לאוכלוסיות ספציפיות של תאי מטרה. ציטונמים נצפו מרחיבים מאות מיקרומטרים כדי להפקיד מורפוגנים על קרומי תאים קולטים אותות 8,9. שיבוש בהעברת מורפוגן בתיווך ציטונמה מוביל לאנומליות התפתחותיות הן בזבובים והן בבעלי חוליות, ומדגיש את חשיבותן במהלך דפוס הרקמות 10,11,12,13,14.
עד כה תועדו ציטונמים במודלים של דרוזופילה, אפרוחים ודגי זברה, אך הדמיה של המבנים בעוברי יונקים מתפתחים נותרה מאתגרת 8,9,15. מכשול להדמיה יעילה של ציטונמים ברקמות יונקים מורכבות באתרם הוא אופיים הדק והשברירי, מה שהופך אותם לרגישים לנזק בשיטות קיבוע קונבנציונליות8. בעבר פיתחנו ועשינו אופטימיזציה של פרוטוקולים למיקרוסקופיית אלקטרונים מתוקנת (MEM-fix) כדי לשמר ציטונים בתאים בתרבית ולאפשר את המחקר שלהם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית16,17.
השימוש בטכניקת MEM-fix אפשר זיהוי של חלק מהמולקולות המעורבות ביצירת ציטונמות המושרות על-ידי SHHותפקודן 11,16,17. עם זאת, אישור הממצאים הללו בהקשר הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית של דפוס הצינורות העצביים הצריך פיתוח של טכניקות חדשניות לתיקון ותמונה של רקמה עוברית של עכבר. כאן מתואר פרוטוקול לתיקון עוברי עכברים באופן שישמור על שלמות הציטונמה ויאפשר חיסון וחיתוך לאחר מכן של רקמה עוברית לצורך ניתוח קונפוקלי. פרוטוקול זה פותח באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק הקשור לממברנה (GFP) כדי לתייג הרחבות ממברנה מהתאים המייצרים SHH בתעלה העצבית המתפתחת. יישום פרוטוקול זה יעסוק בשאלות שלא נענו הנוגעות לשכיחותם ומשמעותם של ציטונמים בפיתוח מערכות יונקים.
Protocol
פרוטוקול זה תואם את ההנחיות המאושרות לטיפול בבעלי חיים של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ובית החולים למחקר לילדים סנט ג'וד. כל הזנים הוחזרו חמישה דורות לזן C57BL/6J.
1. בידוד העוברים וכתמי הרכבה שלמה
- לגדל נקבות בנות 6 שבועות ולפקח על נוכחות של תקע הנרתיק.
- הרדמה את הסכר ההרה על ידי שאיפת CO2 בתא CO2 ואחריה פריקה צוואר הרחם על פי הנחיות AVMA18. בצע חתך Y לחלל הצפק באמצעות מספריים ומלקחיים מנתחים. הבלו על הרחם המכיל את עוברי E9.5 בהתאם להנחיות המוסדיות המאושרות.
- נתחו את העוברים במדיום גדילה מלא (מדיום הנשר המהונדס של Dulbecco, בתוספת חומצות אמינו לא חיוניות, Na-pyruvate, L-גלוטמין ו-10% סרום בקר עוברי). השתמשו במלקחיים כדי להסיר את שק החלמון, השליה והממברנות הסובבות אותה.
הערה: בעת הצורך, שמור כל שק חלמון לגנוטיפ עוברי. - שטפו את העוברים המבודדים בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) כדי להסיר כל רקמת מי שפיר ודם שיורית.
- הכן את הקיבוע. הוסף paraformaldehyde (PFA) ל- HBSS לריכוז עבודה סופי של 4% PFA.
אזהרה: PFA הוא כימיקל רעיל, ולכן יש להימנע משאיפה או מחשיפה ישירה לעור. הכנת הפתרון המקבע מתבצעת תחת מכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים של כפפות ומעיל מעבדה. - הוסיפו 1 מ"ל של קיבוע לכל באר של צלחת בת 24 בארות והניחו כל עובר בבאר בודדת. דגירו את העוברים באופן קבוע במשך 45 דקות עם תסיסה עדינה על נדנדה.
הערה: קריטי: כל השטיפות והדגירות חייבות להיעשות בתסיסה עדינה (מקסימום 20 סל"ד) על נדנדה או שייקר עגול, שכן טיפול פתאומי או תנועה של העוברים יהרסו את הציטונמות הקבועות. השתמש בפיפטה כדי להסיר בעדינות את כל הפתרונות. - הסר את הקיבוע ושטפו את העוברים 3 x 30 דקות במי מלח עם מאגר פוספט (PBS) עם Ca2+ ו- Mg2+ עם תוספת של 0.1% טריטון.
- לאחר הכביסה, דגירו את העוברים בתמיסת חסימה (PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% טריטון ו-5% סרום עיזים) עם תסיסה עדינה. בלוק 2 x 1 שעות. לאחר הדגירה השנייה לחסימה, יש לבצע שטיפה מהירה אחת של העוברים באמצעות תמיסת חסימה טרייה.
- במהלך שלב החסימה השני, להכין את פתרון הנוגדן העיקרי11. דיללו את הנוגדנים לריכוז הממוטב ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים.
הערה: להדמיה משופרת של GFP ממברנה, ניתן להשתמש באנטי-GFP של עוף (1:250). - הסר את תמיסת החסימה והוסף 1 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר. אינקובציה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך 3 ימים.
- לאחר דגירה ראשונית של נוגדנים, שטפו את העוברים 5x1 שעות ב-20 סל"ד על נדנדה ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים.
- הכינו את תמיסת הנוגדנים המשנית באמצעות מקטעים משניים של F(ab')2 בדילול של 1:1,000 ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים.
הערה: שימוש בשברי F(ab')2 משפר מאוד את חדירת הנוגדנים לדגימה. - הוסף 1 מ"ל של תמיסת נוגדנים משנית לכל באר. דגירה עם נדנדה עדינה ב 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך 3 ימים.
הערה: חשוב: מנקודה זו ואילך, צמצם את חשיפת העוברים לאור ישיר. אופציונלי: כדי למנוע צמיחה של חיידקים, יש להוסיף 0.2% נתרן אזיד לתמיסת הנוגדנים המשנית. - הסירו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את העוברים 3 x 30 דקות ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים. אם לא מבצעים צביעת אקטין עם פאלואידין או צבעי אקטין אחרים, לאחר הכביסה הראשונה, יש להוסיף 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) ל-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20, ו-5% סרום עיזים ודגירה למשך שעה אחת, ולאחר מכן שטיפות של 3x30 דקות כמתואר לעיל.
הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את העוברים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב- PBS או HBSS בחושך עד לשלב ההטבעה למחרת. עם זאת, מומלץ להטמיע את העוברים ולחלקם באופן מיידי.
2. הטמעה, חתך והרכבה של עוברים
- הכינו תמיסת אגרוז של 4% עם נקודת התכה נמוכה (LMP) המומסת ב-HBSS או ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+ לנפח סופי של כ-3 מ"ל לעובר. הוסיפו את המשקל המתאים של אגרוז LMP ל-HBSS או ל-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+ ומיקרוגל עד שהאגרוז LMP מומס.
הערה: לאחר התמוססות האגרוז LMP, אחסנו את התמיסה באמבט חרוזים, אינקובטור או אמבט מים המוגדרים ל-55 מעלות צלזיוס כדי למנוע את התמצקות האגרוז של LMP. - השתמשו בצלחת של 12 קידוחים כתבנית ההטבעה לעוברים. הניחו את הצלחת בת 12 הבאר באמבט החרוזים בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. הוסיפו 2.5-3 מ"ל של 4% אגרוז LMP לכל באר שתחזיק עובר.
הערה: למרות שניתן להשתמש בתבניות אחרות, נפחי צלחת של 12 בארות הם אופטימליים להכנת בלוק האגרוז בשלבים מאוחרים יותר לצורך חתך. - באמצעות כפית מחוררת, העבירו את העוברים לבארות בודדות המכילות תמיסת אגרוז LMP של 4% (איור 1A).
- העבירו את הצלחת בת 12 הבאר מאמבט החרוזים לספסל. השתמשו בקצות פיפטה כדי להטמיע ולכוון בעדינות את העובר כך שיהיה ממורכז בתוך התמיסה. לאחר שהעוברים מכוונים, הניחו את הצלחת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר התמצקות מהירה של הבלוק.
קריטי: ודא שהעובר ממוקם במרכז הבלוק. עוברים ששוקעים לתחתית או קרובים מדי לקצה העובש ככל הנראה יסולקו מגוש האגרוס תוך כדי חתך.
- העבירו את הצלחת בת 12 הבאר מאמבט החרוזים לספסל. השתמשו בקצות פיפטה כדי להטמיע ולכוון בעדינות את העובר כך שיהיה ממורכז בתוך התמיסה. לאחר שהעוברים מכוונים, הניחו את הצלחת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר התמצקות מהירה של הבלוק.
- מוציאים את כל גוש האגרוס מהבאר באמצעות אזמל וחותכים גוש מלבני סביב העובר ומשאירים כ-0.3 ס"מ של בלוק בכל צד. אפשרו אורך נוסף לאורך הקצה הקאודאלי של העובר. כאשר הוא מותקן על הוויברטום, כוון את העובר למיקום זקוף בחלק העליון של הבלוק (איור 1B).
- מרחו רצועת סרט על מחזיק הדגימה של הוויברטום והעבירו את גוש האגרוס לקלטת, בכיוון שהלהב ייצור חלקים ציריים של העובר ברצף קדמי (גולגולתי) עד אחורי.
- מלאו את תא הוויברטום ב-HBSS קר כדי לוודא שהדגימה שקועה במלואה, ולאחר מכן הקיפו את התא בקרח.
- הגדר את מהירות הרטט ל - 0.2 מ"מ לשנייה ותדר בין 5 ל - 7 (50-70 הרץ) כאשר עובי החתך מוגדר ל - 100 מיקרומטר. בצע חתך צירי סדרתי של העובר.
הערה: השתמש במהירות איטית לצורך חתך. אם מהירות החיתוך מוגברת מעל 0.25 מ"מ לשנייה, החתך עלול לקרוע את העובר או לעקור את העובר מהגוש.- במהלך סדרת החתכים, השתמש במלקחיים כדי להעביר בעדינות מקטעים בודדים לצלחת נפרדת של 60 מ"מ במילוי HBSS. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הבלוק, לא את הרקמה, כדי למנוע נזק לרקמות והרס של ציטונמים.
הערה: מקטעי רקמות צריכים להישאר בתוך גוש האגרוז. אם הרקמה נופלת מהגוש לתוך תא הוויברטום, מעבירים בעדינות על ידי הרמת הקטע החוצה. אין לתפוס או לצבוט את הרקמה. קריטי: כל קיפול של חלקי רקמות או טיפול פתאומי יהרוס ציטונמים קבועים בחתכי הרקמה.
- במהלך סדרת החתכים, השתמש במלקחיים כדי להעביר בעדינות מקטעים בודדים לצלחת נפרדת של 60 מ"מ במילוי HBSS. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הבלוק, לא את הרקמה, כדי למנוע נזק לרקמות והרס של ציטונמים.
- אם לא מבצעים צביעת F-אקטין, המשיכו לשלב 2.10.
- כדי לבצע צביעת F-אקטין, יש להסיר את מקטעי ה-HBSS והדגירה למשך 40 דקות עם תמיסת אקטין-אדום ו-DAPI המדוללת ב-PBS עם Ca2+ ו-Mg2+, 0.1% Tween-20 ו-5% סרום עיזים בטמפרטורת החדר.
- שטפו מקטעים 3 x 20 דקות ב- PBS עם Ca2+ ו- Mg2+ ו- 0.1% Tween-20.
- באמצעות עט סמן הידרופובי, ציירו מחסום הידרופובי סביב הקצוות של מגלשת מיקרוסקופ טעונה והוסיפו נפח קטן של HBSS כדי למלא את האזור.
- השתמש במלקחיים או בכפית מחוררת כדי להעביר חלקים לשקופית.
הערה: ניתן להעביר את כל חלקי הרקמות שאינם עטופים באגרוז באמצעות פיפטת העברה. - הסר עודף בלוק אגרוז באמצעות מלקחיים.
- לאחר שכל החלקים הועברו למגלשה, הסר עודפי נוזלים באמצעות צנרת ופינת מגבת סופגת, ולאחר מכן הוסיפו מספר טיפות של מדיום הרכבה למגלשה. השתמש במדיום הרכבה מספיק כדי לכסות את כל אזור הכיסוי כאשר הוא נרפא. הרכיבו את הכיסוי על ידי הצבתו בעדינות על המגלשה.
הערה: הימנעו מהפעלת לחץ או כיסויים מטרידים עד שמדיום ההרכבה יירפא.
3. הדמיה
- בצע הדמיה של מקטעי רקמות על כל מיקרוסקופ קונפוקלי או ברזולוציה גבוהה יותר11. לנתח מינימום של שלושה עוברים לכל גנוטיפ.
הערה: תמונות של מקטעי רקמות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי TCS SP8 STED 3x, ואחריו פירוק LIGHTNING.
Representative Results
השימוש בתבנית גדולה יותר של צלחת בעלת 12 בארות עם תמיסת אגרוז בגודל 2.5-3 מ"ל לבאר היה אידיאלי להטבעה ולהשעיה של מספר עוברים בפרק זמן קצר (איור 1A). השטח העודף מאפשר כיוון נכון בעת חיתוך גוש האגרוז לצורך חתך. בעת חיתוך גוש האגרוס, חשוב לשמור על עודף אגרוז לאורך החלק התחתון של הבלוק שבו הוא יודבק לסרט על מחזיק האובייקט. העובר צריך להיות בחצי העליון של הבלוק (איור 1B). עם זאת, החלק התחתון לא צריך להיות גדול מדי מכיוון שעודף בלוק מגדיל את הסיכויים לשנות את זווית החיתוך כאשר הלהב דוחף לתוך הבלוק בזמן החתך. מוצגות דוגמאות למקטעים בעלי אוריינטציה נכונה (איור 1C,D).
בעת פיתוח פרוטוקול זה, חתך הוויברטום הושווה לחתך קריוסטאט. חתך קריוסטאט של הרקמה כמעט ולא השתמר על הרחבות תאיות (איור 2 קריוסטאט ואיור 3A,B ויברטום). מקטעי Cryostat אפשרו זיהוי של כמה מקטעי ממברנה חיוביים ל-GFP בין תאי הנוטוקורד והתעלה העצבית (איור 2A ראש חץ) ובין תאי הצינור העצבי הסמוכים (ראשי חץ איור 2B,B). עם זאת, צביעת F-אקטין של שלוחות תאיות בתאים המזנכימליים בעלי החוטים הגבוהים המקיפים את הצינור העצבי נפגעה בקטעי קריוסטאט (איור 2C,C' arrow, לעומת איור 3C,D). תוצאות קריוסטאט אלה מצביעות על כך שרק כמה עקבות של שלוחות תאיות שבורות נותרו בשיטה זו. לפיכך, חתך ויברטום עדיף לשמר ביעילות את ההרחבות העדינות הללו לניתוח הבא.
הפרעה מינימלית של מקטעי עובר שלמים ורקמות בודדות חיונית להדמיה באיכות גבוהה של שלוחות תאיות. מקטעי רקמה שעברו קיפול או אבזם כלשהם יהיו ניכרים בהיעדר הנוטוקורד או בהפרדה גדולה (>30 מיקרומטר) בין הנוטוקורד ללוח הרצפה הגחונית של הצינור העצבי (איור 3B). זה בדרך כלל מלווה באובדן של תאים מזנכימליים שבדרך כלל מקיפים את הצינור העצבי (איור 3A, חץ). מקטעים פגומים גם יגרמו לאובדן של הרחבות ממברנות תאיות נראות לעין הנודדות בין תאי אפיתל (איור 3B בהשוואה לאיור 3A, ראשי חץ). אפילו עיוותים קלים בחתכים עלולים לגרום לפיצול של הרחבות מבוססות אקטין ולמרווחים גדולים להיווצרות בין התאים (איור 3D, ראשי חץ, בהשוואה לאיור 3C שהשתמר היטב), מה שמדגיש את הצורך בטיפול עדין בכל השלבים.
איור 1: דוגמה של E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG מוכתם, מוטבע ומחותוך עובר. (A) עובר יחיד בצלחת של 12 בארות, משובץ באגרוז 4% LMP. (B) דוגמה לעובר בעל אוריינטציה נכונה בתוך גוש האגרוז שנחתך לגודלו לצורך הרכבה על ויברטום. עודף גוש אגרוז קיים לאורך החלק התחתון. (C) תמונת שדה בהיר של חתך עובר בעובי 100 מיקרומטר המוטבע באגרוז LMP. (D) הדמיה אימונופלואורסצנטית של מקטע לאחר הסרת אגרוז. mGFP מוכתם נגד GFP (ירוק) מייצג תאים המבטאים Shh ברקמה, כאשר שושלות תאים אחרות מבטאות את הממברנה עגבנייה (אדום), DAPI בכחול. הצינור העצבי (סוגריים) ונוטוקורד חיובי mGFP (חץ) נראים בבירור. פסי קנה מידה = 1 ס"מ (A), 5 מ"מ (B) ו- 100 מיקרומטר (C, D). קיצורים: LMP = נקודת התכה נמוכה; mGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק ממברנה; Shh = סוניק קיפוד; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דוגמה לצלחת רצפת הצינור העצבית בחתך קריוסטאט ולנוטוכורד עם הרחבות ממברנה מקוטעות. Rosa26 mTmG 19,20,21 קטע מוכתם עבור GFP (ירוק), F-אקטין (אדום) ו- DAPI (כחול). mGFP puncta נראים בין הנוטוקורד לבין לוח הרצפה (ראש החץ) ו-(B,B') הנודדים בין תאים סמוכים של הצינור העצבי. (ג,ג') צביעת F-actin אינה מצליחה לזהות ציטונומים ברורים על תאים מזנכימליים המקיפים את הצינור העצבי (חץ). סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: mGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק ממברנה; Shh = סוניק קיפוד; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: דוגמאות למקטעי רקמת ויברטום אופטימליים ולא אופטימליים ולכתמים של צלחת רצפת הצינור העצבי, הנוטוקורד והתאים הסובבים אותה. דוגמאות למקטעים שטופלו בעדינות (A,C), בהשוואה ל-(B) מקטע רקמה מקופלת ו-(D) מקטע שטופל בצורה גרועה מ-Shh-Cre; Rosa26 mTmG ועובר ShhGFP/+ 19,20,21. מקטעים המטופלים בצורה אופטימלית מאפשרים זיהוי של ציטונמות בין תאי אפיתל עצביים של לוחות רצפה סמוכים (A, ראשי חץ). יש לראות את הנוטוקורד הסמוך לצינור העצבי (A, מבטא mGFP) ותאים מזנכימליים (A, חץ). (ג,ד) מקטעים מוכתמים ב-F-אקטין וב-DAPI צריכים לכלול ריווח עקבי של תאים מזנכימליים וציטונמים מבוססי F-אקטין (חצים) המקיפים את הצינור העצבי ואת נוטוכורד (C). כל קיפול או הפרעה קלים של החלקים עלולים לגרום למרווחים ולשברי F-אקטין שבורים (D, ראשי חץ). סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: mGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק ממברנה; Shh = סוניק קיפוד; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
פרוטוקול זה פותח לשימור ציטונמים עדינים בחתכי רקמות עובריות לצורך מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה. עד כה, הדמיה של ציטונמים ברקמות על פני אורגניזמים שונים במודלים שונים הסתמכה במידה רבה על ביטוי חוץ רחמי של חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות הדמיה של רקמות חיות. למרבה הצער, השימוש בהדמיה חיה המסומנת באופן פלואורסצנטי תורם רק לעתים רחוקות לניתוח של חלבונים בעלי ביטוי אנדוגני, יכול להכניס אילוצי זמן ודורש שלבי הדמיה מיוחדים ומיקרוסקופים. שיטת ההכתמה והחתך המתוארת כאן משמרת ציטונמים והרחבות תאיות אחרות כדי לאפשר אימונוהיסטוכימיה לגילוי בסופו של דבר של חלבונים בעלי ביטוי אנדוגני. טכנולוגיה זו תאפשר תובנות חדשות על האופן שבו מורפוגנים מועברים על פני רקמות שונות in vivo ותרחיב את היקף מערכות המודל שבהן ניתן לחקור ציטונמות.
פרוטוקול זה משתמש בצביעה בהרכבה מלאה ובחתך עבה של ויברטום, אשר נמנע משימוש בתמיסת שיווי משקל כגון גליצרול או תמיסות מגן על ההקפאה כגון סוכרוז. מטרתו למזער את הטיפול ברקמות החתוכות כדי לאפשר שימור מקסימלי של הרחבות תאיות. טיפול מופחת ברקמה לאחר הניתוק סיפק באופן עקבי תוצאות טובות יותר בשימור הכולל של הציטונמות. לפיכך, חיתוך העובר הוא אחד השלבים האחרונים לפני ההדמיה.
MEM-fix, טכניקת קיבוע שפותחה לשימור ציטונמים של תאים בתרבית, מורכבת משילוב של גלוטארלדהיד ו-PFA המאפשר שימור תלת-ממדי משופר של ארכיטקטורת התא המולדת הדומה לממדים החיים שלהם16,17. למרבה הצער, MEM-fix לא היה שימושי לקיבוע עוברים מכיוון שגלוטרלדהיד יכול לבצע פלואורסציה אוטומטית ומגביל מאוד את חדירת הנוגדנים ואת קשירת האפיטופים בתאים עקב פעילות גבוהה של קישור צולב חלבוני22,23. לפיכך, פרוטוקולי חתך לאחר תנאי קיבוע PFA הותאמו כדי לאפשר שימור של הרחבות תאיות ברקמה עוברית. למרות ש-PFA יכול לשמר הרחבות דמויות ציטונמה ברקמה עוברית, יש לבצע ניתוח תמונה בזהירות. PFA יכול לגרום להתייבשות חלקית של תאים ורקמות בודדים, מה שמוביל להקטנת נפח קלה ולהיווצרות חללים חוץ-תאיים קטנים בתוך הרקמה הקבועה.
פרוטוקול זה מונע את השלבים הנוספים של resaturation סוכרוז עבור הגנה על ההקפאה וניקוי רקמות כי תמיסות סוכרוז או גליצרול יכול לגרום resaturation קל של הרקמה24. הנפיחות הקלה שנוצרת כתוצאה מכך יכולה להרוס שלוחות תאיות קבועות וציטונומים הנודדים בין תאים ובין רקמות. הדבר ניכר כאשר השווים בין ויברטום עבה-חתך לקטעי קריוסטאט. אף על פי שעלייה בעובי הרקמה שיפרה את שימורם של ציטונים שלמים, מקטעי הקריוסטט הרוויים של סוכרוז היו באופן עקבי בשכיחות נמוכה יותר של ציטונמים הניתנים לזיהוי.
אופטימיזציה של פרוטוקול זה גילתה כי מקטעים בעובי 100 מיקרומטר היו הטובים ביותר להבטחת שימור של ציטונומים שלמים. מקטעים דקים יותר משמשים בדרך כלל להדמיה מכיוון שרוב המיקרוסקופים הקונפוקליים מסוגלים רק להדמיה ברזולוציה מספקת כדי לדמיין הרחבות תאיות לעומק של כ-20-40 מיקרומטר מבלי לנקות25. עם זאת, הכוחות המכניים והעיוות המופעלים על תאים עובריים מהלהב תוך חיתוך חלקים דקים הורסים ציטונמים. מקטעים עבים יותר מאפשרים שטח עומק גדול יותר בתוך המקטע תוך שמירה על הרחבות שלמות בתוך הרקמה. בנוסף, השימוש בחתכים עבים יותר מאפשר טיפול קל כדי למנוע קיפול או אבזם מוגזמים של חלקי הרקמה.
פרוטוקול זה הותאם לשימור מרבי של ציטונמים ברקמה של עוברי עכבר E8-10.5. מניפולציה מינימלית של הרקמה לאחר הניתוק סיפקה שיפור עקבי בשימור הכולל של הציטונים. סביר להניח שתידרש אופטימיזציה נוספת כדי להתאים את הטכניקה לשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר ולחתכי רקמות בוגרים בשל גודל מוגבר ומורכבות הרקמה. זה ידרוש חתך ואחריו צביעה חיסונית. רקמה כזו עשויה לדרוש שלבי ניקוי נוספים והתאמה של הטיפול ברקמות במהלך החתך כדי לשמר הרחבות דמויות ציטונמה. יהיה צורך לשקול שלבים נוספים אלה ולטפל בהם עבור יישומים עתידיים של פרוטוקול זה.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר עליהם.
Acknowledgments
התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופים המתוחזקים על ידי ליבת ההדמיה של התא והביולוגיה המולקולרית בבית החולים למחקר לילדים סנט ג'וד. זני עכברים התקבלו מ-JAX. עבודה זו נתמכה על ידי מענק R35GM122546 של המכונים הלאומיים לבריאות (SKO) ועל ידי ALSAC של בית החולים למחקר לילדים סנט ג'וד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
| 24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
| Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
| Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
| Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
| chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
| CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
| Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
| Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
| Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
| Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
| Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
| Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
| Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
| Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
| PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
| Super Glue | Gorilla | ||
| SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
| Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
| Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |
References
- Crick, F.
- Zeng, X., et al. A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling. Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).
- Yu, S. R., et al. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).
- Zhou, S., et al. Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc. Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).
- Ribes, V., Briscoe, J. Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).
- Le Dréau, G., Martí, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).
- Kornberg, T. B., Guha, A. Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (4), 264-271 (2007).
- Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
- Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
- Bischoff, M., et al. Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia. Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).
- Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. eLife. 10, 61432 (2021).
- Huang, H., Kornberg, T. B. Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes. eLife. 5, 18979 (2016).
- Brunt, L., et al. Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/β-catenin signaling. Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Mattes, B., et al. Wnt/PCP controls spreading of Wnt/β-catenin signals by cytonemes in vertebrates. eLife. 7, 36953 (2018).
- Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport. Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).
- Hall, E. T., Ogden, S. K. Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation. Bio-protocol. 8 (13), (2018).
- American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals. American Veterinary Medical Association. , (2020).
- Harfe, B. D., et al. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-528 (2004).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 368-380 (2006).
- Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method. Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).
