Summary
여기서, 배아의 고정, 면역 염색 및 절편화를 위해 최적화된 단계별 프로토콜이 제공되어 마우스 조직에서 사이토네임(cytonemes)이라고 불리는 특수한 신호전달 필로포디아(filopodia)를 검출한다.
Abstract
발달 조직 패터닝 및 발달 후 조직 항상성은 모르포겐이라고 불리는 세포 신호의 조절된 전달에 의존한다. 모르포겐은 세포 운명을 지시하고 강화하는 별개의 전사 프로그램을 지정하기 위해 농도 및 시간 의존적 방식으로 작용합니다. 적절한 모르포겐 신호전달 역치가 보장되는 한 가지 메카니즘은 사이토네임(cytonemes)이라고 불리는 전문화된 필로포디아(filopodia)에 의한 신호전달 단백질의 전달을 통해서이다. Cytonemes는 매우 얇고 (직경 ≤200nm) 수백 미크론의 길이까지 자랄 수 있으므로 고정 이미지 분석을 위한 보존이 어렵습니다. 이 논문은 표준 공초점 현미경을 사용하여 세포네임의 시각화를 허용하기 위해 고정, 면역 염색 및 두꺼운 단면화를 위해 마우스 배아를 섬세하게 취급하는 세련된 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 마우스 신경관 발달 동안 별개의 세포 신호 구획을 연결하는 사이토네임을 시각화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 기술은 또한 전례없는 해상도에서 발달 신호전달의 심문을 용이하게하기 위해 조직 유형 전반에 걸친 사이토네임을 검출하도록 적용될 수 있습니다.
Introduction
배아 발달은 모르포겐 신호전달 경로의 조정된 활성화를 통해 조율된다. 모르포겐은 소닉 헤지호그(SHH)로 분류되는 작고 분비된 단백질로, 성장인자 β(TGF-β)/골형성 단백질(BMP), 날개 없는 관련 통합 부위(WNT), 섬유아세포 및 표피 성장 인자(FGF/EGF) 패밀리로 변형됩니다. 모르포겐은 조직 발달 동안 세포 조직 센터에서 생산 및 방출되며 조직 형태 형성 1,2,3,4,5를 알리기 위해 세포 조직 분야에 걸쳐 신호 구배를 수립합니다. 모르포겐 구배의 한 가지 표현은 발달하는 신경계에서 발견되며, 여기서 추정 중추 신경계는 모르포겐 경로 활성화를 통해 패턴화된다. 신경관이라고 불리는이 조직은 복부 - 가장 노토코드 및 바닥판에 의해 분비되는 SHH의 반대 구배와 등쪽 지붕판에서 분비되는 WNT / BMP로 구성되어 뚜렷한 신경 전구 영역6을 패턴화합니다. 신경관은 발달 연구에서 형태소 구배 무결성을 조사하는 데 일반적으로 사용됩니다.
모르포겐 구배 형성은 신호 분산의 엄격한 조절에 의존한다7. 이것이 발생하는 한 가지 세포 메커니즘은 신호 생성 세포에서 특정 표적 세포 집단으로의 모르포겐의 직접 전달을 촉진하는 사이토네임(cytonemes)이라고 불리는 긴 신호전달 필로포디아의 형성을 통해서이다. Cytonemes는 신호 수신 세포막 8,9에 모르포겐을 증착하기 위해 수백 마이크로미터를 확장하는 것으로 관찰되었다. 사이토네메 매개 모르포겐 수송의 중단은 파리와 척추동물 모두에서 발달 이상을 초래하며, 조직 패터닝10,11,12,13,14 동안 그 중요성을 강조한다.
현재까지 Drosophila, chick 및 zebrafish 모델에서 cytonemes가 문서화되었지만 포유류 배아 발달의 구조 이미징 은8,9,15에 여전히 도전적입니다. 현장에서 복잡한 포유류 조직에서 시토네임을 효과적으로 이미징하는 장애물은 얇고 깨지기 쉬운 성질이며, 이는 기존의 고정 방법8에 의해 손상되기 쉽습니다. 우리는 이전에 배양 된 세포에서 세포 내막을 보존하고 공초점 현미경16,17을 사용하여 연구를 가능하게하기 위해 변형 된 전자 현미경 고정 (MEM-fix)을위한 프로토콜을 개발하고 최적화했습니다.
MEM-픽스 기술의 사용은 SHH 유도된 시토네임 형성 및 기능 11,16,17에 관여하는 분자들 중 일부의 동정을 허용하였다. 그러나 신경관 패터닝의 생리 학적 관련 맥락에서 이러한 발견의 확인은 마우스 배아 조직을 수정하고 이미지화하는 새로운 기술의 개발이 필요했습니다. 사이토네임 완전성을 유지하고 공초점 분석을 위해 배아 조직의 면역 염색 및 후속 절편을 허용하는 방식으로 마우스 배아를 고정시키는 프로토콜이 여기에 요약되어 있습니다. 이 프로토콜은 발달하는 신경관에서 SHH 생성 세포로부터의 막 확장을 표지하기 위해 막 테더링된 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하여 개발되었다. 이 프로토콜의 구현은 포유동물 시스템 개발에서 사이토네임의 보급 및 중요성에 관한 대답되지 않은 질문을 해결할 것이다.
Protocol
이 프로토콜은 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)와 St. Jude Children 's Research Hospital의 승인 된 동물 관리 지침을 따릅니다. 모든 균주는 C57BL/6J 균주로 5세대를 역교차시켰다.
1. 배아 분리 및 전체 마운트 염색
- 6 주 된 여성을 번식시키고 질 플러그의 존재를 모니터링하십시오.
- 임신한 댐을 CO2챔버에서 CO2 흡입에 의해 안락사시키고, AVMA 가이드라인18에 따라 자궁경부 탈구를 가한다. 해부하는 가위와 포셉을 사용하여 복강에 Y- 절개를하십시오. 승인 된 기관 지침에 따라 E9.5 배아가 포함 된 자궁을 소비하십시오.
- 배아를 완전한 성장 배지 (Dulbecco의 변형 이글 배지, 불필요한 아미노산, Na-pyruvate, L- 글루타민 및 10 % 태아 소 혈청으로 보충)에서 해부하십시오. 포셉을 사용하여 노른자 주머니, 태반 및 주변 막을 제거하십시오.
참고 : 필요한 경우 배아 유전자형을 위해 각 노른자 낭을 저장하십시오. - 분리된 배아를 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로 헹구어 잔류 양수 조직과 혈액을 제거합니다.
- 고정 장치를 준비하십시오. 파라포름알데히드(PFA)를 HBSS에 첨가하여 최종 작업 농도 4% PFA를 만듭니다.
주의: PFA는 독성 화학 물질이므로 흡입이나 직접적인 피부 노출은 피해야 합니다. 고정 용액의 준비는 장갑과 실험실 코트의 적절한 개인 보호 장비가있는 흄 후드 아래에서 수행됩니다. - 24웰 플레이트의 각 웰에 고정제 1mL를 넣고 각 배아를 개별 웰에 넣습니다. 로커에서 부드러운 교반으로 45 분 동안 고정제로 배아를 배양하십시오.
참고 : 중요 : 모든 세척 및 배양은 배아의 갑작스런 취급 또는 움직임이 고정 된 시토네임을 파괴 할 것이므로 로커 또는 원형 쉐이커에서 부드러운 교반 (최대 20 RPM)으로 수행해야합니다. 피펫을 사용하여 모든 용액을 부드럽게 제거하십시오. - 고정제를 제거하고 배아를 인산완충식염수(PBS)로 3 x 30분간세척하고 0.1% 트리톤을 첨가한Mg2+ 로 세척하였다.
- 세척 후, 배아를 온화한 교반으로 블로킹 용액 (Ca2+ 및Mg2+, 0.1% 트리톤 및 5% 염소 혈청을 갖는 PBS)에서 인큐베이션한다. 블록 2 x 1 h. 두 번째 블로킹 인큐베이션 후, 신선한 블로킹 용액을 사용하여 배아를 한 번 빠르게 헹구십시오.
- 두 번째 블로킹 단계 동안, 일차 항체 용액11을 준비한다. 최적화된 농도에 대한 항체를 PBS에서Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% Tween-20, 및 5% 염소 혈청으로 희석한다.
참고: 멤브레인 GFP의 향상된 시각화를 위해 치킨 안티 GFP(1:250)를 사용할 수 있습니다. - 블로킹 용액을 제거하고 각 웰에 1차 항체 용액 1 mL를 첨가한다. 4°C에서 3일 동안 완만한 회전으로 인큐베이션한다.
- 1차 항체 인큐베이션에 이어서, 배아를 Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% Tween-20, 및 5% 염소 혈청으로 PBS 중의 로커 상에서20 RPM에서 5 x 1시간 동안 세척한다.
- PBS에서 Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% Tween-20, 및 5% 염소 혈청으로 1:1,000 희석하여 F(ab')2 단편2차체를 사용하여 2차 항체 용액을 제조하였다.
참고: F(ab')2 단편의 사용은 샘플로의 항체 침투를 크게 향상시킵니다. - 각 웰에 이차 항체 용액 1 mL를 첨가한다. 어둠 속에서 4°C에서 3일 동안 부드럽게 흔들면서 인큐베이션한다.
참고 : 중요 :이 시점부터 배아가 직접 광선에 노출되는 것을 최소화하십시오. 선택 사항: 박테리아 성장을 방지하려면 2차 항체 용액에 0.2% 아지드 나트륨을 첨가하십시오. - 2차 항체 용액을 제거하고 PBS 중 배아를 3 x 30분 동안Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% Tween-20, 및 5% 염소 혈청으로 세척한다. 팔로이딘 또는 다른 액틴 염료로 액틴 염색을 수행하지 않는 경우, 첫 번째 세척 후, Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% 트윈-20, 및 5% 염소 혈청을 갖는 PBS에 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 상기 기재된 바와 같이 3 x 30분 세척하였다.
참고: 이 시점에서, 배아는 다음 날 매립 단계가 이루어질 때까지 어둠 속에서 PBS 또는 HBSS에서 4°C에서 밤새 저장될 수 있다. 그러나 배아가 즉시 묻히고 절개되는 것이 좋습니다.
2. 배아 임베딩, 단면화 및 장착
- HBSS 또는 PBS에 용해된 4% w/v 저융점(LMP) 아가로스 용액을Ca2+ 및Mg2+로 준비하여 배아 당 ~3 mL의 최종 부피로 제조한다. LMP 아가로오스의 적절한 중량을 HBSS 또는 PBS에 Ca2+ 및 Mg2+ 및 LMP 아가로오스가 용해될 때까지 마이크로파로 첨가한다.
참고: LMP 아가로오스가 용해되면 LMP 아가로스 용액이 응고되지 않도록 용액을 55°C로 설정된 비드 욕조, 인큐베이터 또는 수조에 보관하십시오. - 배아의 매립 금형으로 12-웰 플레이트를 사용하십시오. 12-웰 플레이트를 55°C 비드 배쓰에 놓는다. 배아를 보유할 각 웰에 4% LMP 아가로스 2.5-3 mL를 첨가한다.
참고: 다른 금형을 사용할 수도 있지만, 12웰 플레이트 볼륨은 절삭을 위해 나중 단계에서 아가로스 블록을 준비하는 데 최적입니다. - 천공된 숟가락을 사용하여 배아를 4% LMP 아가로스 용액을 함유하는 개별 웰로 옮깁니다(그림 1A).
- 12웰 플레이트를 구슬 욕조에서 벤치탑으로 옮깁니다. 피펫 팁을 사용하여 배아를 부드럽게 삽입하고 방향을 정하여 배아가 용액 내에 집중되도록하십시오. 배아가 배향되면, 플레이트를 -20°C에서 10분 동안 배치하여 블록의 빠른 응고가 가능하도록 한다.
CRITICAL: 배아가 블록의 중앙에 위치하는지 확인하십시오. 바닥에 가라 앉거나 곰팡이의 가장자리에 너무 가까운 배아는 단면화하는 동안 아가로스 블록에서 빠져 나올 가능성이 큽니다.
- 12웰 플레이트를 구슬 욕조에서 벤치탑으로 옮깁니다. 피펫 팁을 사용하여 배아를 부드럽게 삽입하고 방향을 정하여 배아가 용액 내에 집중되도록하십시오. 배아가 배향되면, 플레이트를 -20°C에서 10분 동안 배치하여 블록의 빠른 응고가 가능하도록 한다.
- 메스를 이용하여 우물에서 아가로스 블록 전체를 제거하고 배아 주위의 직사각형 블록을 절단하여 양쪽에 ~ 0.3cm의 블록을 남깁니다. 배아의 꼬리 끝을 따라 여분의 길이를 허용하십시오. 비브라톰에 장착되면 배아를 블록의 위쪽 부분에 있는 직립 위치에 배치합니다(그림 1B).
- 비브라톰의 표본 홀더에 테이프 스트립을 적용하고 아가로스 블록을 테이프에 수퍼 접착제로 붙이면 블레이드가 배아의 축 방향 섹션을 전방 (두개골)에서 후부 시퀀스로 생성하도록 배아의 축 방향 섹션을 생성합니다.
- 비브라톰 챔버를 차가운 HBSS로 채워 샘플이 완전히 침지되었는지 확인한 다음 챔버를 얼음으로 둘러 쌉니다.
- 비브라톰 속도를 0.2mm/s로, 주파수를 5~7(50-70Hz)로 설정하고 절단 두께를 100μm로 설정합니다. 배아의 직렬 축 단면화를 수행하십시오.
참고: 단면화에는 느린 속도를 사용하십시오. 절단 속도가 0.25mm/s 이상으로 증가하면 단면화가 배아를 찢거나 배아를 블록에서 떼어낼 수 있습니다.- 단면화 시리즈 중에는 포셉을 사용하여 개별 섹션을 HBSS로 채워진 별도의 60mm 접시로 부드럽게 옮깁니다. 포셉을 사용하여 조직이 아닌 블록을 잡아 조직 손상과 사이토 네임 파괴를 피하십시오.
참고: 조직 절편은 아가로스 블록 내에 남아 있어야 합니다. 조직이 블록에서 진동 챔버로 떨어지면 섹션을 들어 올려 부드럽게 옮깁니다. 조직을 움켜 쥐거나 꼬집지 마십시오. 중요: 조직 절편의 접힘 또는 갑작스런 취급은 조직 절편의 고정 된 시토네임을 파괴합니다.
- 단면화 시리즈 중에는 포셉을 사용하여 개별 섹션을 HBSS로 채워진 별도의 60mm 접시로 부드럽게 옮깁니다. 포셉을 사용하여 조직이 아닌 블록을 잡아 조직 손상과 사이토 네임 파괴를 피하십시오.
- F-액틴 염색을 수행하지 않은 경우, 단계 2.10으로 진행한다.
- F-액틴 염색을 수행하기 위해, HBSS를 제거하고, 실온에서 Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% Tween-20 및 5% 염소 혈청으로 PBS에 희석된 Actin-Red 및 DAPI 용액으로 40분 동안 절편을 인큐베이션한다.
- 절편을 PBS 중 3 x 20분 동안Ca2+ 및Mg2+ 및 0.1% 트윈-20으로 세척한다.
- 소수성 마커 펜을 사용하여 하전된 현미경 슬라이드의 가장자리 주위에 소수성 장벽을 그리고 작은 부피의 HBSS를 추가하여 영역을 채웁니다.
- 포셉 또는 구멍이 뚫린 스푼을 사용하여 섹션을 슬라이드로 옮깁니다.
참고: 아가로스에 싸여 있지 않은 모든 조직 절편은 이송 피펫을 통해 옮길 수 있습니다. - 포셉을 사용하여 과도한 아가로스 블록을 제거하십시오.
- 모든 섹션이 슬라이드로 옮겨지면 피펫팅과 흡수성 타월렛의 모서리를 통해 과도한 액체를 제거한 다음 슬라이드에 장착 매체 몇 방울을 추가하십시오. 경화 시 커버슬립 영역 전체를 덮을 수 있는 충분한 장착 매체를 사용하십시오. 커버슬립을 슬라이드에 부드럽게 올려 장착합니다.
주: 장착 매체가 경화될 때까지 압력을 가하거나 커버슬립을 방해하지 마십시오.
3. 이미징
- 임의의 공초점 또는 그 이상의 해상도 현미경(11) 상에서 조직 절편의 이미징을 수행한다. 유전자형 당 최소 세 개의 배아를 분석하십시오.
참고: 조직 절편의 이미지는 TCS SP8 STED 3x 공초점 현미경을 사용하여 획득한 후 LIGHTNING 디컨볼루션을 사용하여 획득했습니다.
Representative Results
웰 당 2.5-3 mL의 아가로스 용액과 함께 12-웰 플레이트의 더 큰 주형을 사용하는 것은 단기간에 여러 배아를 매립하고 현탁시키는 데 이상적이었다 (그림 1A). 초과 영역은 단면화를 위해 아가로스 블록을 절단 할 때 올바른 방향을 허용합니다. 아가로스 블록을 절단 할 때, 오브젝트 홀더의 테이프에 접착 될 블록의 바닥을 따라 과도한 아가로스를 유지하는 것이 중요합니다. 배아는 블록의 위쪽 절반에 있어야 합니다(그림 1B). 그러나 하단 단면은 너무 커서는 안되며, 과도한 블록은 단면화하는 동안 블레이드가 블록으로 밀어 넣을 때 절단 각도를 변경할 가능성이 높아집니다. 올바른 방향 단면의 예가 나와 있습니다(그림 1C,D).
이 프로토콜을 개발하는 동안, vibratome 단면화는 cryostat 단면화와 비교되었다. 조직의 Cryostat 절편은 거의 세포 확장을 보존하지 못했습니다 (그림 2 cryostat 및 그림 3A, B vibratome). Cryostat 섹션은 notochord와 신경관의 세포 (그림 2A 화살촉)와 인접한 신경관 세포 (그림 2B, B' 화살촉) 사이의 일부 GFP 양성 막 단편의 검출을 허용했습니다. 그러나, 신경관을 둘러싸고 있는 고도로 필라멘트성 중간엽 세포에서의 세포 확장의 F-액틴 염색은 냉동 절편에서 손상되었다(도 2C,C' 화살표, vs 도 3C,D). 이러한 cryostat 결과는이 방법을 따르는 깨진 세포 확장의 흔적 만 남아 있음을 나타냅니다. 따라서, 비브라톰 단면화는 후속 분석을 위해 이러한 섬세한 확장을 효율적으로 보존하기 위해 바람직하다.
전체 배아 및 개별 조직 절편의 파괴를 최소화하는 것은 세포 확장의 고품질 이미징에 필수적입니다. 임의의 폴딩 또는 좌굴을 겪은 조직 절편은 노토코드의 부재 또는 신경관의 노토코드와 복부 바닥판 사이의 큰 분리(>30 μm)에 의해 명백해질 것이다(도 3B). 이것은 일반적으로 신경관을 정상적으로 둘러싸고있는 중간엽 세포의 손실을 동반합니다 (그림 3A, 화살표). 손상된 절편은 또한 상피 세포들 사이에서 이동하는 가시적인 세포막 확장의 손실을 초래할 것이다 (도 3A와 비교하여, 화살촉 도 3B). 절편에 대한 사소한 왜곡조차도 액틴 기반 확장의 단편화와 세포 사이에 큰 틈새가 형성 될 수 있습니다 (그림 3D, 화살촉, 잘 보존 된 그림 3C와 비교하여), 모든 단계에서 섬세한 취급의 필요성을 강조합니다.
도 1: E9.5 Shh-Cre의 예; Rosa26 mTmG 염색, 내장 및 절편화된 배아. (A) 12-웰 플레이트에 있는 단일 배아로, 4% LMP 아가로스에 포매됨. (b) 비브라톰 장착을 위한 크기로 절단된 아가로스 블록 내의 정확하게 배향된 배아의 예. 과도한 아가로스 블록이 바닥을 따라 존재합니다. (c) LMP 아가로스에 매립된 100 μm 두께의 배아 섹션의 밝은 장 이미지. (d) 아가로오스의 제거 후의 절편의 면역형광 영상화. 항-GFP-염색된 mGFP(녹색)는 조직에서 Shh 발현 세포를 나타내며, 다른 세포 계보와 함께 토마토 막(적색), DAPI를 청색으로 발현한다. 신경관 (브래킷)과 mGFP 양성 노토코드 (화살표)가 명확하게 보입니다. 스케일 막대 = 1cm(A), 5mm(B) 및 100μm(C,D). 약어: LMP = 낮은 융점; mGFP = 막 녹색 형광 단백질; Shh = 소닉 헤지호그; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 단편화된 막 연장을 갖는 크라이오스탯 단면 신경관 바닥판 및 노토코드의 예. (A) 20 μm 두께의 E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG 19,20,21 절편을 GFP (녹색), F-액틴 (적색) 및 DAPI (청색)에 대해 염색하였다. mGFP 누점은 신경관의 인접한 세포들 사이에서 이동하는 노토코드와 바닥판(화살촉)과 (B,B') 사이에서 볼 수 있다. (C,C') F-액틴 염색은 신경관(화살표)을 둘러싸고 있는 중간엽 세포에서 어떠한 명확한 사이토네임도 검출하지 못한다. 스케일 바 = 20 μm. 약어: mGFP = 막 녹색 형광 단백질; Shh = 소닉 헤지호그; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 신경관 바닥판, 노토코드 및 주변 세포의 최적 및 차선책의 비브라톰 조직 절편 및 염색의 예. 섬세하게 취급된 절편의 예는 (A,C), (B) 접힌 조직 절편 및 (D) Shh-Cre로부터의 잘 처리되지 않은 부분과 비교하여; Rosa26 mTmG 및 ShhGFP/+ 배아 19,20,21. 최적으로 처리된 절편은 인접하게 국소화된 바닥판 신경 상피 세포(A, 화살촉) 사이의 사이토네임(cytonemes)의 검출을 허용한다. 인접한 신경관 notochord (A, mGFP 발현) 및 중간엽 세포 (A, 화살표)가 보여야 합니다. (C,D) F-액틴- 및 DAPI-염색된 절편은 신경관 및 노토코드(C)를 둘러싸는 중간엽 세포 및 F-액틴 기반 사이토네임(화살표)의 일관된 간격을 가져야 한다. 단면의 사소한 접힘 또는 중단으로 인해 틈새가 생기고 F-actin 조각 (D, 화살촉)이 파손 될 수 있습니다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: mGFP = 막 녹색 형광 단백질; Shh = 소닉 헤지호그; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 고분해능 형광 현미경을 위한 배아 조직 절편에서 섬세한 사이토네임의 보존을 위해 개발되었습니다. 지금까지, 다양한 모델 유기체에 걸친 조직에서의 사이토네임의 시각화는 주로 살아있는 조직 이미징을 이용한 형광 표지된 단백질의 자궁외 발현에 의존해 왔다. 불행히도, 형광 표지 된 라이브 이미징의 사용은 내인성 발현 단백질의 분석에 거의 도움이되지 않으며 시간 제약을 초래할 수 있으며 전문적인 이미징 단계 및 현미경이 필요합니다. 여기에 기술된 염색 및 절편 방법은 내인성으로 발현된 단백질의 최종 검출을 위한 면역조직화학을 허용하기 위해 사이토네임 및 기타 세포 확장을 보존한다. 이 기술은 모르포겐이 생체 내에서 다른 조직에 어떻게 전달되는지에 대한 새로운 통찰력을 촉진하고 시토네임이 연구 될 수있는 모델 시스템의 범위를 확장합니다.
이 프로토콜은 전체 마운트 염색 및 비브라톰 두께 단면화를 사용하며, 이는 글리세롤과 같은 평형 용액 또는 수크로오스와 같은 냉동 보호제 용액의 사용을 피한다. 그것은 세포 확장의 최대 보존을 허용하기 위해 절편 조직 취급을 최소화하는 것을 목표로합니다. 절편화 후 조직의 감소된 취급은 사이토네임의 전반적인 보존에 지속적으로 더 나은 결과를 제공하였다. 따라서, 배아의 절편화는 영상화 전의 최종 단계 중 하나이다.
배양된 세포의 세포관을 보존하기 위해 개발된 고정 기술인 MEM-fix는 글루타르알데히드와 PFA의 조합으로 구성되어 있어 살아있는 치수16,17에 필적하는 선천적 세포 구조의 향상된 3D 보존을 가능하게 합니다. 불행하게도, MEM-픽스는 글루타르알데히드가 자가형광을 띠고 높은 단백질 가교 활성22,23으로 인해 세포에서 항체 침투 및 에피토프 결합을 심각하게 제한할 수 있기 때문에 배아 고정에 유용하지 않았다. 따라서, PFA 고정 후 절편화 프로토콜은 배아 조직에서 세포 확장의 보존을 허용하도록 최적화되었다. PFA는 배아 조직에서 시토닌과 유사한 확장을 보존할 수 있지만, 이미지 분석은 신중하게 수행되어야 합니다. PFA는 개별 세포 및 조직의 부분적인 탈수를 일으킬 수 있으며, 이는 경미한 부피 감소 및 고정 조직 내의 작은 세포외 공간의 형성으로 이어질 수 있다.
이 프로토콜은 슈크로스 또는 글리세롤 용액이 조직(24)의 경미한 재포화를 야기할 수 있기 때문에 동결보호 및 조직 소거를 위한 슈크로스 재포화의 추가적인 단계를 회피한다. 결과적으로 발생하는 경미한 팽창은 고정 된 세포 확장과 세포 간 및 조직 간 이동을 파괴 할 수 있습니다. 이것은 두꺼운 단면의 비브라톰을 cryostat 섹션과 비교할 때 분명했습니다. 조직 두께의 증가는 무손상 사이토네임의 보존을 개선시켰지만, 수크로스-재포화 냉동 절편은 지속적으로 검출가능한 사이토네임의 발생률이 낮았다.
이 프로토콜의 최적화는 100 μm 두께의 절편이 손상되지 않은 시토네임의 보존을 보장하는 데 가장 적합하다는 것을 보여주었습니다. 더 얇은 절편은 일반적으로 이미징에 사용되는데, 대부분의 공초점 현미경은25를 클리어링하지 않고 ~20-40 μm 깊이까지 세포 확장을 시각화하기에 충분한 해상도로만 이미징할 수 있기 때문입니다. 그러나, 얇은 부분을 절단하는 동안 블레이드에서 배아 세포에 가해지는 기계적 힘과 왜곡은 사이토 네임을 파괴합니다. 더 두꺼운 섹션은 조직 내에서 손상되지 않은 확장을 유지하면서 섹션 내에서 더 큰 깊이의 영역을 허용합니다. 추가적으로, 더 두꺼운 절편의 사용은 조직 절편의 과도한 접힘 또는 좌굴을 방지하기 위해 취급의 용이성을 허용한다.
이 프로토콜은 E8-10.5 마우스 배아의 조직에서 사이토네임의 최대 보존을 위해 최적화되었다. 절편화 후 조직의 최소 조작은 지속적으로 향상된 사이토네임 보존을 제공하였다. 크기 및 조직 복잡성 증가로 인해 후기 발달 단계 및 성인 조직 절편에 대한 기술을 적용하기 위해 추가 최적화가 필요할 가능성이 큽니다. 이를 위해서는 절편화에 이어 면역형광 염색이 필요할 것이다. 이러한 조직은 사이토네임-유사 연장을 보존하기 위해 절편화 동안 조직 취급의 추가적인 클리어링 단계 및 적응을 필요로 할 수 있다. 이러한 추가 단계는 이 프로토콜의 향후 적용을 위해 고려되고 해결되어야 합니다.
Disclosures
저자는 선언 할 경쟁 이익이 없습니다.
Acknowledgments
이미지는 St. Jude Children 's Research Hospital의 Cell and Molecular Biology Imaging Core에서 유지 관리하는 현미경을 사용하여 획득되었습니다. 마우스 균주를 JAX로부터 수득하였다. 이 연구는 국립 보건원 보조금 R35GM122546 (SKO)과 세인트 주드 아동 연구 병원의 ALSAC에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
| 24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
| Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
| Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
| Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
| chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
| CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
| Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
| Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
| Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
| Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
| Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
| Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
| Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
| Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
| PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
| Super Glue | Gorilla | ||
| SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
| Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
| Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |
References
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