Summary
Her er en optimalisert trinnvis protokoll gitt for fiksering, immunoppnåelse og seksjonering av embryoer for å oppdage spesialiserte signalering filopodia kalt cytoner i utviklingen av musevev.
Abstract
Utviklingsvevsmønster og postdevelopmental vev homeostase avhenger av kontrollert levering av cellulære signaler kalt morfogener. Morfogener virker på en konsentrasjons- og tidsavhengig måte for å spesifisere distinkte transkripsjonsprogrammer som instruerer og forsterker celle skjebnen. En mekanisme som passende morfogensignaleringster terskler sikres er gjennom levering av signalproteiner ved spesialisert filopodia kalt cytoner. Cytonemes er veldig tynne (≤200 nm i diameter) og kan vokse til lengder på flere hundre mikron, noe som gjør deres bevaring for fastbildeanalyse utfordrende. Dette dokumentet beskriver en raffinert metode for delikat håndtering av museembryoer for fiksering, immunstaining og tykk seksjonering for å muliggjøre visualisering av cytoner ved hjelp av standard konfokal mikroskopi. Denne protokollen har blitt brukt til å visualisere cytonemer som kobler distinkte cellulære signalrom under utvikling av muse nevralrør. Teknikken kan også tilpasses for å oppdage cytoner på tvers av vevstyper for å lette avhør av utviklingssignalering ved enestående oppløsning.
Introduction
Embryonal utvikling er orkestrert gjennom koordinert aktivering av morfogen signalveier. Morfogener er små, utskilte proteiner som er kategorisert i Sonic Hedgehog (SHH), transformerer vekstfaktor β (TGF-β)/bone morphogenic protein (BMP), Wingless-related integration site (WNT), og fibroblast og epidermal vekstfaktor (FGF / EGF) familier. Morfogenes produseres og frigjøres fra cellulære organiseringssentre under vevsutvikling og etablerer signalgradienter på tvers av organiseringsfelt av celler for å informere vevsmorfogenese 1,2,3,4,5. En representasjon av morfogen gradienter finnes i det utviklende nervesystemet, hvor det presumptive sentralnervesystemet er mønstret gjennom morfogenveisaktivering. Dette vevet, referert til som nevralrøret, består av motsatte gradienter av SHH utskilt av ventral-mest notokord og gulvplate, og WNTs / BMPs utskilt fra dorsal takplate, for å mønster distinkt nevrale forfedre region6. Nevralrøret brukes ofte til å forhøre morfogen gradient integritet i utviklingsforskning.
Morfogen gradient formasjon er avhengig av tett regulering av signaldispersjon7. En cellulær mekanisme som dette skjer ved er gjennom dannelsen av lange signalfilopodia kalt cytoner som letter direkte levering av morfogener fra signalproduserende celler til spesifikke målcellepopulasjoner. Cytonemer har blitt observert for å utvide hundrevis av mikrometer for å deponere morfiner på signalmottakende cellemembraner 8,9. Forstyrrelse av cytoneme-mediert morfogentransport fører til utviklingsavvik hos både fluer og vertebrater, og fremhever deres betydning under vevsmønster 10,11,12,13,14.
Til dags dato har cytoner blitt dokumentert i Drosophila, kylling og sebrafiskmodeller, men avbildning av strukturene i utvikling av pattedyrembryoer er fortsatt utfordrende 8,9,15. Et hinder for effektivt å avbilde cytoner i komplekse pattedyrvev in situ er deres tynne og skjøre natur, noe som gjør dem utsatt for skade ved konvensjonelle fikseringsmetoder8. Vi hadde tidligere utviklet og optimalisert protokoller for en modifisert elektronmikroskopifiksativ (MEM-fix) for å bevare cytoner i dyrkede celler og muliggjøre studien deres ved hjelp av konfokal mikroskopi16,17.
Bruk av MEM-fix-teknikken har tillatt identifisering av noen av molekylene som er involvert i SHH-indusert cytonemedannelse og funksjon 11,16,17. Imidlertid nødvendiggjorde bekreftelse av disse funnene i den fysiologisk relevante konteksten av nevral rørmønster utviklingen av nye teknikker for å fikse og bildemus embryonalt vev. En protokoll for å fikse museembryoer på en måte som opprettholder cytoneme integritet og tillater immunstaining og etterfølgende seksjonering av embryonalt vev for konfokal analyse er skissert her. Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av et membran-bundet grønt fluorescerende protein (GFP) for å merke membranforlengelser fra SHH-produserende celler i det utviklende nevrale røret. Implementering av denne protokollen vil ta opp ubesvarte spørsmål knyttet til utbredelsen og betydningen av cytoner i utviklingen av pattedyrsystemer.
Protocol
Denne protokollen følger de godkjente retningslinjene for dyrepleie i Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og St. Jude Children's Research Hospital. Alle stammer ble tilbakekrysset fem generasjoner til C57BL/6J-stammen.
1. Embryoisolasjon og helfestefarging
- Ras 6 uker gamle kvinner og overvåke for tilstedeværelse av vaginal plugg.
- Avlive den gravide demningen ved CO 2-innånding i et CO2-kammer etterfulgt av livmorhalsdislokasjon i henhold til AVMA-retningslinjene18. Lag et Y-snitt til bukhulen ved hjelp av dissekering av saks og tang. Sluk livmoren som inneholder E9,5 embryoer i henhold til godkjente institusjonelle retningslinjer.
- Disseker embryoene i fullstendig vekstmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, supplert med unødvendige aminosyrer, Na-pyruvat, L-glutamin og 10% foster bovint serum). Bruk tang til å fjerne eggeplommesekken, morkaken og de omkringliggende membranene.
MERK: Når det er nødvendig, må du lagre hver eggeplommesekk for embryogenotyping. - Skyll de isolerte embryoene i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) for å fjerne eventuelt gjenværende fostervev og blod.
- Forbered fikseringen. Tilsett paraformaldehyd (PFA) i HBSS for en endelig arbeidskonsentrasjon på 4% PFA.
FORSIKTIG: PFA er et giftig kjemikalie, så innånding eller direkte hudeksponering må unngås. Forberedelse av den fikseringsløsningen utføres under en avtrekkshette med riktig personlig verneutstyr av hansker og en labfrakk. - Tilsett 1 ml fikseringsmiddel til hver brønn av en 24-brønns plate og legg hvert embryo i en individuell brønn. Inkuber embryoene i fixative i 45 min med mild agitasjon på en rocker.
MERK: Kritisk: Alle vasker og inkubasjoner må gjøres med mild agitasjon (maksimalt 20 RPM) på en rocker eller sirkulær shaker, da brå håndtering eller bevegelse av embryoene vil ødelegge de faste cytonemene. Bruk en pipette for å fjerne alle løsninger forsiktig. - Fjern fikseringsmiddelet og vask embryoene 3 x 30 min i fosfatbufret saltvann (PBS) med Ca2+ og Mg2+ med tilsatt 0,1% Triton.
- Etter vask, inkuber embryoene i blokkeringsløsning (PBS med Ca2 + og Mg2 +, 0,1% Triton og 5% geitserum) med mild agitasjon. Blokk 2 x 1 t. Etter den andre blokkerende inkubasjonen, utfør en rask skylling av embryoene ved hjelp av fersk blokkeringsløsning.
- Under det andre blokkeringstrinnet forbereder du den primære antistoffløsningen11. Fortynn antistoffene mot den optimaliserte konsentrasjonen i PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1% Tween-20 og 5% geitserum.
MERK: For forbedret visualisering av membran GFP kan kylling anti-GFP (1:250) brukes. - Fjern blokkeringsløsningen og tilsett 1 ml primær antistoffløsning til hver brønn. Inkuber ved 4 °C med skånsom rotasjon i 3 dager.
- Etter den primære antistoffinkubasjonen, vask embryoene 5 x 1 t ved 20 RPM på en rocker i PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1% Tween-20 og 5% geitserum.
- Forbered den sekundære antistoffløsningen ved hjelp av F(ab')2 fragment secondaries ved en 1:1000 fortynning i PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1% Tween-20 og 5% geitserum.
MERK: Bruk av F(ab')2 fragmenter forbedrer antistoffinntrengningen i prøven betraktelig. - Tilsett 1 ml sekundær antistoffløsning til hver brønn. Inkuber med skånsom gynging ved 4 °C i mørket i 3 dager.
MERK: Viktig: Minimer embryoeksponeringen fra dette tidspunktet til direkte lys. Valgfritt: For å forhindre bakterievekst, tilsett 0,2% natriumazid til den sekundære antistoffoppløsningen. - Fjern den sekundære antistoffløsningen og vask embryoene 3 x 30 min i PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1% Tween-20 og 5% geitserum. Hvis du ikke utfører aktinfarging med phalloidin eller andre aktinfarger, legg til 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) til PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1% Tween-20 og 5% geitserum og inkuber i 1 time, etterfulgt av 3 x 30 minutter over.
MERK: På dette tidspunktet kan embryoene lagres over natten ved 4 °C i PBS eller HBSS i mørket til innebyggingstrinnet dagen etter. Det anbefales imidlertid at embryoer er innebygd og seksjonert umiddelbart.
2. Embryoinnbygging, seksjonering og montering
- Forbered en 4% m / v Low Melting Point (LMP) agarose løsning oppløst i HBSS eller PBS med Ca2 + og Mg2 + til et endelig volum på ~ 3 ml per embryo. Tilsett riktig vekt av LMP-agarose til HBSS eller PBS med Ca2+ og Mg2+ og mikrobølgeovn til LMP-agarose er oppløst.
MERK: Når LMP-agarose er oppløst, oppbevar oppløsningen i et perlebad, inkubator eller vannbad satt til 55 °C for å forhindre at LMP-agaroseløsningen størkner. - Bruk en 12-brønns plate som innebyggingsform for embryoer. Plasser 12-brønnsplaten i det 55 °C perlebadet. Tilsett 2,5-3 ml 4% LMP agarose til hver brønn som vil holde et embryo.
MERK: Selv om andre former kan brukes, er 12-brønns platevolumer optimale for å forberede agaroseblokken på senere stadier for seksjonering. - Bruk en perforert skje og overfør embryoene til individuelle brønner som inneholder 4 % LMP-agaroseoppløsning (figur 1A).
- Overfør 12-brønnsplaten fra perlebadet til en benkeplate. Bruk pipettespisser for å forsiktig legge inn og orientere embryoet slik at det er sentrert i løsningen. Når embryoene er orientert, plasser platen ved -20 °C i 10 minutter for å tillate rask størkning av blokken.
KRITISK: Sørg for at embryoet er plassert i midten av blokken. Embryoer som synker til bunnen eller er for nær kanten av formen, vil sannsynligvis bli løsnet fra agaroseblokken under seksjonering.
- Overfør 12-brønnsplaten fra perlebadet til en benkeplate. Bruk pipettespisser for å forsiktig legge inn og orientere embryoet slik at det er sentrert i løsningen. Når embryoene er orientert, plasser platen ved -20 °C i 10 minutter for å tillate rask størkning av blokken.
- Fjern hele agaroseblokken fra brønnen ved hjelp av en skalpell og kutt en rektangulær blokk rundt embryoet og la ~ 0,3 cm blokk på hver side. Tillat ekstra lengde langs den kaudale enden av embryoet. Når det er montert på vibratomet, orienter embryoet i oppreist stilling i den øvre delen av blokken (figur 1B).
- Påfør en stripe tape på prøveholderen på vibratomet og superglue agaroseblokken på båndet, orientert slik at bladet vil generere aksiale deler av embryoet i en fremre (kranial) til bakre sekvens.
- Fyll vibratomkammeret med kaldt HBSS for å sikre at prøven er helt nedsenket, og omgi deretter kammeret med is.
- Sett vibratomhastigheten til 0,2 mm/s og frekvens mellom 5 og 7 (50-70 Hz) med kuttet tykkelse satt til 100 μm. Utfør seriell aksial seksjonering av embryoet.
MERK: Bruk en langsom hastighet for seksjonering. Hvis kuttehastigheten økes over 0,25 mm/s, kan seksjonering rive embryoet eller løsne embryoet fra blokken.- Under seksjonsserien bruker du tang til forsiktig å overføre individuelle seksjoner til en separat 60 mm tallerken fylt med HBSS. Bruk tang for å gripe blokken, ikke vevet, for å unngå vevsskade og ødeleggelse av cytoner.
MERK: Vevsseksjonene skal forbli innenfor agaroseblokken. Hvis vevet faller ut av blokken inn i vibratomkammeret, må du forsiktig overføre ved å løfte delen ut. Ikke ta tak i eller klem vevet. KRITISK: Enhver folding av vevsseksjoner eller brå håndtering vil ødelegge faste cytoner i vevsdelene.
- Under seksjonsserien bruker du tang til forsiktig å overføre individuelle seksjoner til en separat 60 mm tallerken fylt med HBSS. Bruk tang for å gripe blokken, ikke vevet, for å unngå vevsskade og ødeleggelse av cytoner.
- Hvis du ikke utfører F-aktinfarging, går du videre til trinn 2.10.
- For å utføre F-aktinfarging, fjern HBSS og inkuber seksjoner i 40 min med Actin-Red og DAPI-løsning fortynnet i PBS med Ca2+ og Mg2+, 0,1% Tween-20 og 5% geitserum ved romtemperatur.
- Vask seksjonene 3 x 20 min i PBS med Ca2+ og Mg2+ og 0,1% Tween-20.
- Bruk en hydrofob markørpenn til å tegne en hydrofob barriere rundt kantene på et ladet mikroskop og legg til et lite volum HBSS for å fylle området.
- Bruk tang eller en perforert skje for å overføre seksjoner til lysbildet.
MERK: Alle vevsseksjoner som ikke er innkapslet i agarose kan overføres via en overføringspipette. - Fjern overflødig agarose blokk ved hjelp av tang.
- Når alle seksjonene er overført til lysbildet, fjern overflødig væske via pipettering og hjørnet av et absorberende håndkle, og legg deretter til flere dråper monteringsmedium til lysbildet. Bruk nok monteringsmedium til å dekke hele dekslet når det er herdet. Monter dekslene ved å plassere den forsiktig på lysbildet.
MERK: Unngå å påføre trykk eller forstyrrende deksler til monteringsmediet er herdet.
3. Bildebehandling
- Utfør avbildning av vevsseksjoner på et hvilket som helst konfikalt eller høyere oppløsningsmikroskop11. Analyser minst tre embryoer per genotype.
MERK: Bilder av vevsseksjoner ble anskaffet ved hjelp av et TCS SP8 STED 3x konfokalt mikroskop, etterfulgt av LIGHTNING-dekonvolusjon.
Representative Results
Bruk av en større form av en 12-brønns plate med 2,5-3 ml agaroseoppløsning per brønn var ideell for innbygging og suspendering av flere embryoer over kort tid (figur 1A). Det overskytende området gir riktig orientering når du kutter agaroseblokken for seksjonering. Ved kutting av agaroseblokken er det viktig å opprettholde overflødig agarose langs bunnen av blokken der den limes til båndet på objektholderen. Embryoet skal være i øvre halvdel av blokken (figur 1B). Den nederste delen bør imidlertid ikke være for stor, da overflødig blokk øker sjansene for å endre kuttevinkelen når bladet skyver inn i blokken mens du seksjonerer. Eksempler på korrekt orienterte avsnitt vises (figur 1C,D).
Mens du utviklet denne protokollen, ble vibratome seksjonering sammenlignet med kryostat seksjonering. Kryostat-seksjonering av vevet bevarte sjelden cellulære forlengelser (figur 2 kryostat og figur 3A, B vibratom). Kryostatsseksjoner tillot påvisning av noen GFP-positive membranfragmenter mellom celler i notokord og nevralrør (figur 2A pilspiss) og mellom tilstøtende nevrale rørceller (figur 2B, B' pilspisser). F-aktinfarging av cellulære forlengelser i de svært filamentøse mesenchymale cellene rundt nevralrøret ble imidlertid svekket i kryostatsseksjoner (figur 2C, C' pil, vs. figur 3C,D). Disse kryostatresultatene indikerer at bare noen spor av ødelagte cellulære utvidelser forblir etter denne metoden. Dermed er vibratome seksjonering foretrukket å effektivt bevare disse delikate utvidelsene for etterfølgende analyse.
Minimal forstyrrelse av hele embryo- og individuelle vevsseksjoner er avgjørende for avbildning av cellulære utvidelser av høy kvalitet. Vevsseksjoner som har gjennomgått noen folding eller spenne vil være tydelig ved fravær av notokord eller en stor separasjon (>30 μm) mellom hakkeordet og den ventrale gulvplaten på nevralrøret (figur 3B). Dette ledsages vanligvis av tap av mesenchymale celler som normalt omgir nevralrøret (figur 3A, pil). Skadede seksjoner vil også føre til tap av synlige cellulære membranforlengelser som migrerer mellom epitelceller (figur 3B sammenlignet med figur 3A, pilspisser). Selv mindre forvrengninger til seksjonene kan føre til fragmentering av aktinbaserte forlengelser og store hull som dannes mellom celler (figur 3D, pilspisser, sammenlignet med godt bevart figur 3C), noe som understreker behovet for delikat håndtering i alle trinn.
Figur 1: Eksempel på E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG farget, innebygd og seksjonert embryo. (A) Et enkelt embryo i en 12-brønns plate, innebygd i 4% LMP agarose. (B) Eksempel på et korrekt orientert embryo i agaroseblokken kuttet ned til størrelse for vibratommontering. Overflødig agarose blokk er til stede langs bunnen. (C) Lysfeltbilde av 100 μm tykk embryoseksjon innebygd i LMP-agarose. (D) Immunfluorescence avbildning av en seksjon etter fjerning av agarose. Anti-GFP-farget mGFP (grønn) representerer Shh-uttrykkende celler i vevet, med andre celleavstamninger som uttrykker membran Tomat (rød), DAPI i blått. Nevralrør (brakett) og mGFP-positiv notokord (pil) er tydelig synlige. Skalastenger = 1 cm (A), 5 mm (B) og 100 μm (C, D). Forkortelser: LMP = lavt smeltepunkt; mGFP = membrangrønn fluorescerende protein; Shh = Sonisk pinnsvin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på kryostat-seksjonert nevralrørgulvplate og notokord med fragmenterte membranforlengelser. Rosa26 mTmG 19,20,21 seksjon farget for GFP (grønn), F-aktin (rød) og DAPI (blå). mGFP puncta er synlige mellom notokordet og gulvplaten (pilspissen) og (B,B') som migrerer mellom tilstøtende celler i nevralrøret. (C,C') F-aktinfarging klarer ikke å oppdage noen klare cytoner på mesenchymale celler rundt nevralrøret (pil). Skalastenger = 20 μm. Forkortelser: mGFP = membrangrønn fluorescerende protein; Shh = Sonisk pinnsvin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempler på optimale og suboptimale vibratomvevsseksjoner og farging av nevralrørgulvplaten, notokord og omkringliggende celler. Eksempler på delikat håndterte seksjoner (A,C), sammenlignet med (B) en brettet vevsseksjon og (D) en dårlig håndtert seksjon fra en Shh-Cre; Rosa26 mTmG og et ShhGFP/+ embryo 19,20,21. Optimalt håndterte seksjoner tillater deteksjon av cytoner mellom tilstøtende lokaliserte gulvplate nevrale epitelceller (A, pilspisser). Neural tube tilstøtende notochord (A, mGFP-uttrykkende) og mesenchymale celler (A, pil) skal være synlige. (C,D) F-aktin- og DAPI-fargede seksjoner bør ha konsistent avstand mellom mesenchymale celler og F-aktinbaserte cytoner (piler) rundt nevralrøret og notokordet (C). Enhver mindre folding eller forstyrrelse av seksjonene kan forårsake hull og ødelagte F-aktinfragmenter (D, pilspisser). Skalastenger = 10 μm. Forkortelser: mGFP = membrangrønn fluorescerende protein; Shh = Sonisk pinnsvin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen ble utviklet for bevaring av delikate cytoner i embryonale vevsseksjoner for høyoppløselig fluorescensmikroskopi. Til dags dato har visualisering av cytoner i vev på tvers av ulike modellorganismer i stor grad stolt på ektopisk uttrykk for fluorescerende merkede proteiner ved hjelp av levende vevsavbildning. Dessverre bidrar bruken av fluorescerende merket levende bildebehandling sjelden til analyse av endogene uttrykte proteiner, kan introdusere tidsbegrensninger og krever spesialiserte bildestadier og mikroskoper. Fargings- og seksjoneringsmetoden som er beskrevet her, bevarer cytoner og andre cellulære utvidelser for å tillate immunhiistokjemi for eventuell påvisning av endogenede uttrykte proteiner. Denne teknologien vil legge til rette for ny innsikt i hvordan morfiner transporteres over forskjellige vev in vivo og utvider omfanget av modellsystemer der cytoner kan studeres.
Denne protokollen bruker helmontert farging og vibratom tykk-seksjonering, som unngår bruk av likevektsløsning som glyserol eller kryorotektant løsninger som sukrose. Det tar sikte på å minimere seksjonert vevshåndtering for å muliggjøre maksimal bevaring av cellulære utvidelser. Redusert håndtering av vevet etter seksjonering ga konsekvent bedre resultater i den totale bevaringen av cytoner. Dermed er seksjonering av embryoet et av de siste trinnene før avbildning.
MEM-fix, en fikseringsteknikk utviklet for bevaring av cytoner av dyrkede celler, består av en kombinasjon av glutaraldehyd og PFA som muliggjør forbedret 3D-bevaring av den medfødte cellearkitekturen som kan sammenlignes med deres levende dimensjoner16,17. Dessverre var MEM-fix ikke nyttig for embryofiksering fordi glutaraldehyd kan auto-fluoresce og sterkt begrenser antistoffinntrengning og epitopbinding i celler på grunn av høy protein krysskoblingsaktivitet22,23. Dermed ble seksjoneringsprotokoller etter PFA-fikseringsforhold optimalisert for å tillate bevaring av cellulære utvidelser i embryonalt vev. Selv om PFA kan bevare cytoneme-lignende utvidelser i embryonalt vev, bør bildeanalyse utføres med forsiktighet. PFA kan forårsake delvis dehydrering av individuelle celler og vev, noe som fører til mindre volumreduksjon og dannelse av små ekstracellulære rom i det faste vevet.
Denne protokollen unngår de ekstra trinnene for sukrose resaturation for kryoprotection og vev clearing fordi sukrose eller glyserol løsninger kan forårsake en mindre resaturation avvevet 24. Den resulterende mindre hevelsen kan ødelegge faste cellulære utvidelser og cytonemer som migrerer mellom celler og over vev. Dette var tydelig når man sammenlignet tykk-seksjonert vibratom med cryostat seksjoner. Selv om økende vevstykkelse forbedret bevaringen av intakte cytoner, hadde de sukrose-resettede kryostatseksjonene konsekvent en lavere forekomst av påvisbare cytoner.
Optimalisering av denne protokollen avslørte at 100 μm tykke seksjoner var de beste for å sikre bevaring av intakte cytoner. Tynnere seksjoner brukes vanligvis til avbildning fordi de fleste konfokale mikroskoper bare er i stand til å avbilde med tilstrekkelig oppløsning for å visualisere cellulære utvidelser til en dybde på ~ 20-40 μm uten å fjernemerket 25. Imidlertid ødelegger de mekaniske kreftene og forvrengningen som brukes på embryonale celler fra bladet mens du kutter tynne seksjoner, cytoner. Tykkere seksjoner gir mulighet for et større dybdeområde i seksjonen samtidig som intakte forlengelser i vevet bevares. I tillegg gir bruk av tykkere seksjoner enkel håndtering for å forhindre overdreven folding eller spenne av vevsdelene.
Denne protokollen ble optimalisert for maksimal bevaring av cytoner i vev av E8-10,5 museembryoer. Minimal manipulering av vevet etter seksjonering ga konsekvent forbedret generell bevaring av cytoner. Det er sannsynlig at ytterligere optimalisering vil være nødvendig for å tilpasse teknikken for senere utviklingsstadier og voksne vevsseksjoner på grunn av økt størrelse og vevskompleksitet. Dette vil kreve seksjonering etterfulgt av immunfluorescensfarging. Slike vev kan kreve ytterligere ryddetrinn og tilpasning av vevshåndtering under seksjonering for å bevare cytoneme-lignende utvidelser. Disse tilleggstrinnene må vurderes og behandles for fremtidige programmer i denne protokollen.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å erklære.
Acknowledgments
Bilder ble anskaffet ved hjelp av mikroskoper vedlikeholdt av Cell and Molecular Biology Imaging Core ved St. Jude Children's Research Hospital. Musestammer ble oppnådd fra JAX. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant R35GM122546 (SKO) og av ALSAC ved St. Jude Children's Research Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
| 24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
| Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
| Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
| Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
| chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
| CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
| Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
| Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
| Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
| Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
| Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
| Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
| Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
| Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
| PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
| Super Glue | Gorilla | ||
| SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
| Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
| Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |
References
- Crick, F.
- Zeng, X., et al. A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling. Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).
- Yu, S. R., et al. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).
- Zhou, S., et al. Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc. Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).
- Ribes, V., Briscoe, J. Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).
- Le Dréau, G., Martí, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).
- Kornberg, T. B., Guha, A. Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (4), 264-271 (2007).
- Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
- Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
- Bischoff, M., et al. Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia. Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).
- Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. eLife. 10, 61432 (2021).
- Huang, H., Kornberg, T. B. Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes. eLife. 5, 18979 (2016).
- Brunt, L., et al. Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/β-catenin signaling. Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Mattes, B., et al. Wnt/PCP controls spreading of Wnt/β-catenin signals by cytonemes in vertebrates. eLife. 7, 36953 (2018).
- Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport. Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).
- Hall, E. T., Ogden, S. K. Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation. Bio-protocol. 8 (13), (2018).
- American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals. American Veterinary Medical Association. , (2020).
- Harfe, B. D., et al. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-528 (2004).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 368-380 (2006).
- Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method. Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).
