Summary
Tumorsferoïden worden steeds vaker gebruikt om tumorcel-micro-omgevingsinteracties en therapierespons te beoordelen. Het huidige protocol beschrijft een robuuste maar eenvoudige methode voor semi-high-throughput beeldvorming van 3D-tumorsferoïden met behulp van snelle optische clearing.
Abstract
Tumorsferoïden worden snel gemeengoed in fundamenteel kankeronderzoek en medicijnontwikkeling. Het verkrijgen van gegevens over eiwitexpressie in de sferoïde op cellulair niveau is belangrijk voor analyse, maar bestaande technieken zijn vaak duur, bewerkelijk, gebruiken niet-standaard apparatuur, veroorzaken aanzienlijke vervorming van de grootte of zijn beperkt tot relatief kleine sferoïden. Dit protocol presenteert een nieuwe methode voor het monteren en opruimen van sferoïden die deze problemen aanpakken en tegelijkertijd confocale analyse van de binnenste structuur van sferoïden mogelijk maken. In tegenstelling tot bestaande benaderingen voorziet dit protocol in een snelle montage en opruiming van een groot aantal sferoïden met behulp van standaardapparatuur en laboratoriumbenodigdheden. Het monteren van sferoïden in een pH-neutrale agarose-PBS-geloplossing voordat een refractieve-index-gematchte clearingoplossing wordt geïntroduceerd, minimaliseert de vervorming van de grootte die gebruikelijk is bij andere vergelijkbare technieken. Dit maakt gedetailleerde kwantitatieve en statistische analyse mogelijk waarbij de nauwkeurigheid van maatmetingen van het grootste belang is. Bovendien houdt de agarose-geltechniek, in vergelijking met vloeibare clearingoplossingen, sferoïden op hun plaats, waardoor driedimensionale (3D) confocale beelden kunnen worden verzameld. Het huidige artikel legt uit hoe de methode hoogwaardige twee- en 3D-afbeeldingen oplevert die informatie geven over intercellige variabiliteit en de binnenste sferoïde structuur.
Introduction
Driedimensionale (3D) celculturen, zoals sferoïden, bieden biologisch realistische en reproduceerbare modellen van geaggregeerde celgroei 1,2. Deze modellen worden snel gemeengoed in zowel fundamenteel onderzoek als medicijnontwikkeling, waarbij verschillen in sferoïde grootte en structuur tussen behandelingen worden onderzocht om de werkzaamheid van geneesmiddelen vast te stellen 3,4. In deze contexten is het vermogen om gedetailleerde informatie te verzamelen van een groot aantal sferoïden zeer voordelig, zowel vanuit een statistisch vermogensperspectief als om een snelle beoordeling van celgedrag over verschillende behandelingen mogelijk te maken.
Veelgebruikte technieken voor het verkrijgen van gedetailleerde microscopiebeelden van de sferoïdestructuur zijn tijdrovend, duur of produceren afbeeldingen van slechte kwaliteit die belangrijke kwantitatieve kenmerken zoals sferoïdegrootte 4,5 niet behouden. Histologische technieken op basis van cryosectie kunnen bijvoorbeeld beelden van hoge kwaliteit opleveren, maar zijn vaak tijdrovend, vereisen geschoolde arbeid en creëren vaak sectieartefacten 6,7, terwijl elegante technologieën, zoals single plane illumination microscopy (SPIM)8 en multifotonmicroscopie9 gespecialiseerde microscopen vereisen die niet direct beschikbaar zijn. Moderne microscopietechnologieën hebben onlangs de zogenaamde optische sectioning mogelijk gemaakt, waarbij sferoïden worden geplaatst in een brekingsindex die overeenkomt met clearingoplossing en beelden worden verkregen met behulp van confocale microscopie 4,5. Hoewel deze technieken het potentieel hebben om een hoge opbrengst te produceren, zijn veel voorkomende problemen sferoïde beweging tijdens beeldvorming, vervorming van de grootte tijdens het wissen en de hoge kosten van eigen clearingoplossingen. Bovendien zijn veel bestaande protocollen alleen van toepassing op relatief kleine sferoïden met een diameter van minder dan 300 μm of een diepte tot 100 μm, waardoor de technologie wordt beperkt tot de vroege stadia van tumorgroei 5,10,11.
Het huidige protocol maakt semi-high-throughput, high-yield verzameling van gedetailleerde sferoïde beelden mogelijk met behulp van een goedkope refractieve index-matched clearingoplossing afgeleid van hele orgaan clearing procedures12,13. Om sferoïde beweging tijdens beeldvorming te voorkomen en structurele ondersteuning te bieden om vervorming van de grootte te verminderen, zijn de sferoïden gemonteerd in agarose-PBS-gel in een 24-well # 1.5 glazen bodemplaat. Omdat deze techniek het mogelijk maakt om meerdere sferoïden in elke put in een 24-well plaat te monteren, kunnen tot 360 sferoïden (15 sferoïden / put) snel worden gemonteerd en in beeld gebracht in verschillende experimentele omstandigheden. Een brekingsindex-matched clearingoplossing gemaakt van direct beschikbare verbruiksartikelen wordt gebruikt om gemonteerde sferoïden en de omliggende gel optisch te verwijderen. Na een bezinkingsperiode van 24 uur biedt dit protocol hoogwaardige 2D- en 3D-beelden van de sferoïdestructuur, zelfs voor relatief grote sferoïden (ongeveer 700 μm in diameter), met minder dan 2% vervorming.
Protocol
Het protocol beschrijft de bereiding van een voldoende hoeveelheid tumorsferoïden om één 24-well plaat (ongeveer 240-360 sferoïden of 10-15 sferoïden / put) te monteren op 200 μL agarose-gel per put en 500 μL clearingoplossing per put. De volledige procedure wordt geïllustreerd in figuur 1.
1. 2% agarose-PBS gelpreparaat
- Weeg 0,5 g laagsmeltende agarose (zie materiaaltabel) in een glazen fles en voeg 25 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe.
- Smelt de agarose door de oplossing 30-60 s in een magnetron te koken met het deksel gesloten maar niet afgesloten en met constant draaien. Zorg ervoor dat agarose volledig is opgelost en dat de oplossing niet overkookt.
OPMERKING: Gel kan bij kamertemperatuur worden bewaard; controleer het volume voor gebruik om rekening te houden met verdamping. Breng in de vloeibare toestand (magnetron; 20-60 s met werveling) voor gebruik.
2. Bereiding van de clearingoplossing
- Weeg 9 g N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethyleendiamine, 22 g ureum, 44 g sucrose, 0,1 g Triton X-100 en 24,9 g gedeïoniseerd water af (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Het is gemakkelijker om de geschatte hoeveelheid N, N, N ′, N′-Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethyleendiamine te wegen en het gewicht van andere componenten aan te passen om de gewenste concentratie te verkrijgen. - Verwarm de oplossing in een waterbad van 56 °C met constante menging en ga door totdat alle kristallen zijn opgelost.
- Laat de oplossing op kamertemperatuur rusten om de tijdens het mengen gevormde bellen naar de oppervlakte te laten stijgen. De oplossing is stabiel bij kamertemperatuur gedurende maximaal 2 maanden.
3. Sferoïde voorbereiding
- Genereer sferoïden met behulp van de agarose-overlaymethode zoals eerder beschreven 1,3,14.
OPMERKING: Sferoïden die door andere methoden worden gegenereerd, zijn ook compatibel met dit beeldvormingsprotocol. - Snijd de punt van een pipetpunt van 1 ml met behulp van een scalpel om de opening te vergroten.
OPMERKING: Alle sferoïden werden behandeld met 1 ml of 200 μL pipetten met gesneden uiteinden. - Gebruik de sferoïden met behulp van de pipet uit de putten en breng ze over naar een heldere conische buis van 1,5 ml. Meerdere sferoïden van dezelfde omstandigheden kunnen in dezelfde buis worden gecombineerd.
OPMERKING: Laat de sferoïden altijd naar de bodem van de buis zakken om het medium te aspirateren. - Was de sferoïden tweemaal in 1 ml PBS, voeg neutrale 4% voorverwarmde paraformaldehyde (PFA) oplossing toe en incubeer de sferoïden bij 37 °C gedurende 20 minuten.
- Verwijder de PFA-oplossing en was de sferoïden tweemaal met 1 ml PBS.
4. Sferoïde kleuring
- Breng met behulp van een pipet tot 15 sferoïden over in een PCR-buis van 200 μL.
OPMERKING: Voor fragiele sferoïden, monteer de sferoïden in gel (stappen 5.1-5.4) voordat u verdergaat. - Permeabiliseer de cellen met 200 μL van 0,5% Triton X-100 in PBS. Plaats PCR-buizen in 50 ml schroefdopbuizen en incubeer de sferoïden gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met milde agitatie.
OPMERKING: Alle incubaties worden gedaan met roeren op een rotor, roller of shaker (zie Materiaaltabel), tenzij anders aangegeven. Dit is belangrijk om uniforme kleuring te bereiken. Vaste sferoïden in PBS kunnen soms aan de zijkanten van de pipetpunt blijven plakken. Door de tip in 0,5% Triton X-100 te spoelen, worden de sferoïden geminimaliseerd om aan de uiteinden te blijven plakken. - Vervang de oplossing (stap 4.2) door 200 μL antilichaamverdunningsbuffer (ABDIL)15 en incubeer 's nachts bij kamertemperatuur.
- Verwijder ABDIL, voeg 75 μL primair antilichaam toe aan ABDIL en incubeer bij 4 °C gedurende 2,5 dagen.
- Verwijder het supernatant en was tweemaal met 200 μL PBS met 0,1% Tween en 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) en incubeer met 200 μL PBS-TT gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder PBS-TT, voeg 100 μL secundair antilichaam toe aan ABDIL en incubeer bij 4 °C gedurende 2,5 dagen.
OPMERKING: DAPI of andere nucleaire kleurstof kan in dit stadium worden toegevoegd. De meeste kleurstoffen hebben minder incubatietijd nodig dan antilichamen. - Verwijder het supernatant en was tweemaal met 200 μL PBS-TT en incubeer gedurende 4 uur met 200 μL PBS-TT. De sferoïden zijn klaar voor montage.
5. Montage
- Breng met behulp van een pipet van 200 μL vaste en gekleurde sferoïden over naar 500 μL PCR-buizen bij één buis per toestand (ongeveer 10-15 sferoïden).
- Vervang de oplossing door 200 μL van 2% (w/v) vloeibare agarosegel en centrifugeer op de snelle spin (bij de vaste maximumsnelheid, zie Materiaaltabel) bij kamertemperatuur gedurende 30 s.
OPMERKING: Tenzij u onmiddellijk wordt gemonteerd, plaatst u het in een verwarmingsblok bij 50 °C om uitharding van de gel te voorkomen. - Aspirateer de sferoïden in ~ 50 μL vloeibare agarose-gel en doseer in een put van een 24-well glasbodemplaat.
- Voordat de gel hard wordt, scheidt u de sferoïden met behulp van een pipetpunt in de omringende gel en zorgt u ervoor dat de sferoïden bedekt zijn met gel. Plaats de plaat eventueel op ijs om de gel snel in te stellen.
OPMERKING: Het aantal sferoïden per put is afhankelijk van de grootte van de sferoïden. Sferoïden worden ver van elkaar geplaatst, zodat slechts één sferoïde tijdens het beeld in beeld komt. Dit is belangrijk voor geautomatiseerde beeldverwerking. - Voeg 500 μL reinigingsoplossing (stap 2) per put toe en zorg ervoor dat de gel ondergedompeld is. Incubeer bij RT gedurende ten minste 24 uur en breng de sferoïden in de clearingoplossing in beeld. Sferoïden zijn stabiel in deze oplossing voor maximaal een maand bij kamertemperatuur en wanneer beschermd tegen verdamping.
6. Beeldvorming
- Kies een objectief met een werkafstand die lang genoeg is om de hele sferoïde te omvatten, inclusief de montagehoogte van de sferoïde in het vat.
OPMERKING: Objectieven met een werkafstand van 3 mm of langer zijn vereist om het equatoriale vlak van de sferoïden in beeld te brengen. Hogere vergrotingsdoelstellingen met een hogere NA kunnen zorgen voor een betere resolutie, maar beperken de maximale diepte waarop de sferoïden kunnen worden afgebeeld. - Om het equatoriale vlak te identificeren, past u de focus aan totdat het grootste oppervlak in het XY-vlak is bereikt en beeldt u met het vereiste laservermogenspercentage, detectorspanning, versterking en offset-instellingen.
OPMERKING: Het laservermogenspercentage, de detectorspanning, de versterking en de offset variëren sterk, afhankelijk van de fluorofoor, kleuringsintensiteit, laserintensiteit, detectorgevoeligheid, enz. - Voor 3D-beelden stelt u het begin en einde van de sferoïden in en kiest u de juiste signaalintensiteit op verschillende z-diepte met behulp van z-intensiteitscorrectie-instellingen voordat u gaat fotograferen.
OPMERKING: Voor de beste afbeeldingsresolutie gebruikt u de Nyquist-bemonsteringsfrequentie voor x, y en z (zie referentie16 voor meer informatie).
Representative Results
Om het vermogen van deze clearingmethode aan te tonen om hoogwaardige twee- en driedimensionale beelden te leveren, werden sferoïden met diameters van 300-600 μm gekweekt uit Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator (FUCCI) transduced melanoom cellijnen FUCCI-WM164 en FUCCI-WM983b 9,17 , die monomeer Kusabira Orange2 (mKO2) en monomeer Azami Green (mAG) eiwit tot expressie brengen wanneer ze zich in Gap1 bevinden, en vroege S-fase/Gap2/mitosefase van de celcyclus, respectievelijk volgens de procedures in stap 3 1,3,14. De sferoïden werden vervolgens gefixeerd met 4% formaldehyde-oplossing bij 37 °C, permeabiliseerd en gekleurd met anti-p27kip1/anti-konijn Alexa Fluor 647 anti-pimonidazol/anti-muis Alexa Fluor 647, DAPI of DRAQ7 (zie Materiaaltabel) (Figuur 2). Alle microscopiebestanden worden geüpload naar de GitHub-opslagplaats (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting). In vergelijking met pbs-gemonteerde sferoïden biedt de clearingoplossing beelden met een hoge helderheid met minimale vervorming van de grootte (figuur 2A). Het protocol maakt beeldvorming met hoge resolutie mogelijk van details op cellulair niveau dieper in de sferoïden zonder histologische secties, en het dwarsdoorsnedebeeld werd verkregen van een 20x luchtdoel (0,7 NA) met een resolutie van 4096 x 4096 px zonder stiksels (figuur 2B). Met behulp van een lagere vergroting en een lager numeriek diafragmaobjectief met een langere werkafstand kunnen 3D-confocale beelden worden verkregen die details op cellulair niveau bieden op een diepte van ten minste 200 μm (figuur 2C). Sferoïden werden ook gecrycregeerd en gekleurd volgens het protocol van Spoerri et al.4 en vergeleken met hele sferoïde kleuring (figuur 2D, E). Figuur 2D toont het hypoxische gebied van de sferoïde gekleurd door pimonidazol, en figuur 2E toont p27kip1-kleuring die celcyclusstilstand (geel) en DAPI-kernvlek (grijs) markeert. Eiwitlokalisatie en kleuringspatroon zijn vergelijkbaar tussen cryosectie en clearing en worden daarom niet beïnvloed door deze clearingmethode.
Signaalintensiteitscorrectie in z maakt de beeldvorming van de hele sferoïde mogelijk. Lichtverstrooiing als gevolg van de necrotische kern beperkt echter het vermogen om de andere kant van de sferoïde in beeld te brengen. Diepere penetratie en minder verstrooiing van een verrode fluorofoor, zoals DRAQ7 nucleaire vlek, zorgt voor nog verder verbeterde 3D-sferoïde structuurrepresentatie (figuur 3). Film 1 toont de 3D-weergave van de FUCCI-sferoïden gekleurd met DRAQ7. Een dunnere z-slice kan zorgen voor een betere z-resolutie, maar dit verhoogt de beeldtijd en fotobleaching van de fluoroforen aanzienlijk.
Om te bepalen of de clearingoplossing vervorming van de grootte veroorzaakt, werden twaalf sferoïden in 2% agarose-PBS-gel afgebeeld op 6 h, 12 h, 24 h, 72 h en 168 h na de introductie van de clearingoplossing. De beelden werden samengevat door de diameter van de sferoïde te bepalen, gedefinieerd op basis van een bol met dezelfde dwarsdoorsnede als de sferoïde (figuur 4A). Terwijl de sferoïden in de eerste 6 uur licht in omvang toenemen, aangegeven door een diameterplooiverandering tussen 2% en 6% (figuur 4B), keren de sferoïden na 24 uur tot 72 uur terug naar een grootte die ongeveer gelijk is aan de overeenkomstige grootte in PBS-post PFA-fixatie (figuur 4C).
Figuur 1: Illustratie van het sferoïde montage- en clearingprotocol. Vaste en gekleurde sferoïden worden overgebracht naar een buis van 500 μL; overtollig vocht wordt vervangen door 200 μL agarose-PBS-gel en gecentrifugeerd. Sferoïden worden vervolgens overgebracht naar een put met glazen bodem in een plaat met 24 putten. Nadat de gel is gaan stollen, wordt 500 μL clearingoplossing toegevoegd en mogen sferoïden in evenwicht komen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van gewiste en onduidelijke FUCCI humane melanoom sferoïden. Kleuring geeft celkernen positief aan voor mKO2 (rood), wat cellen in gap 1 aangeeft; en celkernen positief voor mAG (groen), wat cellen in gap 2 aangeeft. (A) Sferoïden gekweekt uit 5000 FUCCI-WM983b-cellen, geoogst op dag 10 en afgebeeld in agarose-PBS-gel en 24 uur na clearing oplossing wordt toegevoegd. Het vergelijken van brightfield- en confocale beelden voor en na het wissen van de oplossing toont minimale vervorming van de grootte en een grote winst in helderheid. Afbeeldingen worden verkregen met behulp van een 10x-objectief. (B) Sferoïden gekweekt uit FUCCI-WM164-cellen die zijn gepermeabiliseerd met Triton X-100 en gekleurd met DRAQ7, waarbij alle celkernen worden gekleurd. Het beeld wordt verkregen met behulp van een 20x-objectief (0,75 NA), wat aantoont dat de clearingoplossing beeldvorming met hoge resolutie van details op celniveau mogelijk maakt. (C) 3D-beelden (10x, 0,4 NA) werden verkregen van FUCCI-WM164-sferoïden in PBS en 24 uur nadat de clearingoplossing was toegevoegd. Het aanpassen van het laservermogen, de spanning en de offset op verschillende z-vlakken maakt beeldvorming dieper in de sferoïde mogelijk. (D,E) Vergelijking tussen cryosectie en geklaarde hele sferoïde gekleurd voor pimonidazol en p27kip1. (D) Pimonidazolkleuring in magenta toont het hypoxische gebied in de sferoïden. Rood en groen geven FUCCI aan. (E) Cryosecties en gewiste sferoïde met DAPI (grijs) en p27kip1 (geel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Clearing maakt beeldvorming dieper in de sferoïde mogelijk met minimaal lichtverlies. Confocale microscopiebeelden van een FUCCI humaan melanoom sferoïde bij 10x vergroting en lagere NA (0,4), waardoor beeldvorming op hogere z-diepte mogelijk is met minimaal signaalverlies. (A) 3,88 μm plakjes van bolvormige kernen gekleurd met DRAQ7. (B-D) y / z-resolutie in respectievelijk de kanalen 488 (mAG), 568 (mKO2) en 647 nm (DRAQ7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Clearingoplossing heeft minimale impact op de grootte van de sferoïden. (A) Verdeling van de oorspronkelijke sferoïdegrootte (equivalente diameter) in PBS-gel (n = 12 sferoïden). (B) Diameter vouwverandering in de loop van de tijd sinds toevoeging van de clearingoplossing. Bij 0 h zijn sferoïden alleen in PBS-gel. (C) Verdeling van diameter vouwveranderingen bij 12 h, 24 h en 72 h. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: 3D-weergave van een FUCCI-sferoïde gekleurd met DRAQ7. Klik hier om deze film te downloaden.
Discussion
Een protocol voor het verkrijgen van hoogwaardige twee- en driedimensionale beelden van tumorsferoïden wordt hier gepresenteerd. Bestaande methoden, zoals CLARITY, See deep brain (SeeDB) en ScaleS, veroorzaken vaak vervorming van de grootte tot 30%, terwijl technieken zoals BenzylAlcohol / Benzyl Benzoate (BABB) en 3D-beeldvorming van solvent-cleared organen (3DISCO) fluorescerend eiwit kunnen doven18. Veel van deze methoden zijn ontworpen voor het opruimen van weefsel met structurele integriteit en vervormen de grootte en structuur wanneer ze worden toegepast op sferoïden18. In tegenstelling tot andere protocollen die in de handel verkrijgbare dure clearingoplossingen gebruiken, gebruikt dit protocol direct beschikbare verbruiksartikelen met behoud van optische helderheid en endogene fluorescentie en het minimaliseren van vervorming van de grootte. Het inbedden van sferoïden in agarose-PBS-gel biedt structurele ondersteuning voor sferoïden en minimaliseert osmotische schokken wanneer de clearingoplossing wordt toegevoegd. Dit is cruciaal bij het afbeelden van fragiele sferoïden na medicamenteuze behandeling. Er wordt aangenomen dat deze optische clearingmethode geschikt is voor sferoïden die door elke methode worden gevormd, omdat dit protocol is aangepast aan het opruimen van het hele weefsel. De aanname is gebaseerd op de gelijkenis in de sferoïden verkregen door verschillende sferoïde vormingsmethoden. De keuze van fixatief kan de sferoïdegrootte en endogene fluorescentie beïnvloeden. Deze clearingmethode is geschikt voor sferoïden die zijn gefixeerd met een neutrale 4% PFA-oplossing. Verdere tests zijn nodig om de compatibiliteit met andere fixeermiddelen te controleren.
Aangezien deze techniek het mogelijk maakt om meerdere sferoïden tegelijkertijd in een multi-well plaat te monteren, is het zeer geschikt voor kwantitatieve analysepijplijnen die sferoïde structuurinformatie vereisen van maximaal 360 sferoïden per 24-well plaat. Microscopen met geautomatiseerde podium- en plaatkarteringsfuncties kunnen beeldvorming minder handmatig maken. Hoewel deze methode sneller en eenvoudiger is dan secties, is deze momenteel niet geschikt voor volledige automatisering. Beelden verkregen door deze methode zijn echter geschikt voor geautomatiseerde beeldverwerking 4,19, en de snelheid waarmee sferoïden kunnen worden gemonteerd met behulp van dit protocol leent zich voor kwantitatieve analyse van de sferoïde binnenstructuur 20,21,22.
Voor het kleuren van hele sferoïden moeten de antilichaamconcentratie, het volume en de incubatietijd voor elk antilichaam worden geoptimaliseerd. Gebruik als richtlijn 2,5x van de aanbevolen 2D-immunofluorescentie-antilichaamconcentratie en 100-200 μL antilichaam, afhankelijk van het aantal sferoïden per buis. Zorg ervoor dat alle sferoïden bedekt zijn met een kleuringsoplossing wanneer ze zich op de rotor bevinden. De incubatietijd hangt af van vele factoren, waaronder de grootte en dichtheid van sferoïden en het antilichaam, en kan variëren van 16-72 uur. Ondanks de methode die signaaldetectie dieper in de sferoïde mogelijk maakt, veroorzaken fluoroforen die door UV worden aangeslagen een aanzienlijke lichtverstrooiing, wat leidt tot een lage signaal-ruisverhouding. Voorzichtigheid is geboden bij het kiezen van fluoroforen om het doeleiwit te visualiseren. Het kleuren van minder overvloedige en structurele eiwitten met fluoroforen met een langere golflengte en meer overvloedige eiwit- of nucleaire vlekken met fluoroforen met een kortere golflengte zal bijvoorbeeld het beste resultaat bereiken. Ten slotte vertonen gewiste sferoïden nog steeds lichtverlies als gevolg van verstrooiing in de necrotische kern, wat duidelijk blijkt uit de y /z-dimensie van beelden verkregen van 600 μm sferoïden (figuur 2C).
Hogere vergrotingsbeelden met hogere NA-doelstellingen zijn mogelijk met sferoïden die met dit protocol zijn gemonteerd en gewist, maar de werkafstand van het objectief beperkt de beelddiepte. Voor een olie-immersielens is het belangrijk om olie te gebruiken met een RI van 1,51 voor het beste resultaat.
Samenvattend, de agarose-PBS gel embedded clearing methode maakt visualisatie van cellen diep in sferoïden mogelijk met behulp van algemeen beschikbare verbruiksartikelen. Sferoïden die met deze methode zijn gemonteerd en geklaard, ondergaan minimale vervorming van de grootte en behouden hun structurele integriteit, waardoor hoogwaardige gegevens met betrekking tot de binnenste sferoïdestructuur en de daaropvolgende geautomatiseerde kwantificering mogelijk zijn.
Disclosures
Olympus droeg bij aan de kosten van publicatie.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd uitgevoerd aan het Translational Research Institute (TRI), Woolloongabba, QLD. TRI wordt ondersteund door een subsidie van de Australische regering. Wij danken het personeel van de microscopiekernfaciliteit van TRI voor hun uitstekende technische ondersteuning. We danken Prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, voor het leveren van de FUCCI-constructies, Prof. Meenhard Herlyn en Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, PA, voor het leveren van de cellijnen. Wij danken Dr Loredana Spoerri voor het leveren van C8161 cryosectie beelden.
Dit werk werd ondersteund door projectsubsidies aan N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) en Meehan Project Grant (021174 2017002565).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
| 500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
| Deionized water | MILLI Q | ||
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
| DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
| Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
| Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
| Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
| Microwave | Sharp | ||
| N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
| NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
| NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
| p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
| Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
| Pipette | Eppendorf | ||
| Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
| Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
| Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
| Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
| Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
| Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |
References
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2008).
- Spoerri, L., Gunasingh, G., Haass, N. K. Fluorescence-based quantitative and spatial analysis of tumour spheroids: A proposed tool to predict patient-specific therapy response. Frontiers in Digital Health. 3, 668390 (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 20 (2020).
- Kabadi, P. K., et al. Into the depths: Techniques for in vitro three-dimensional microtissue visualization. BioTechniques. 59 (5), 279-286 (2015).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
- Spoerri, L., et al. Phenotypic melanoma heterogeneity is regulated through cell-matrix interaction-dependent changes in tumor microarchitecture. bioRxiv. , (2021).
- Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment Cell & Melanoma Research. 27 (5), 764-776 (2014).
- Ahmad, A., et al. Clearing spheroids for 3D fluorescent microscopy: combining safe and soft chemicals with deep convolutional neural network. bioRxiv. , 428996 (2021).
- Villani, T., Rossi, A. E., Sherman, H. Image-based characterization of 3-D cell culture models grown in spheroid microplates. American Laboratory. 50 (6), 12 (2018).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-time cell cycle imaging in a 3D cell culture model of melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Cold Spring Harbor.
- Pawley, J. B. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. US. 20-42 (2006).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Browning, A. P., Murphy, R. J. Zenodo. , (2021).
- Browning, A. P., et al. Quantitative analysis of tumour spheroid structure. eLife. 10, 73020 (2021).
- Klowss, J. J., et al. A stochastic mathematical model of 4D tumour spheroids with real-time fluorescent cell cycle labelling. Journal of The Royal Society Interface. 19 (189), 20210903 (2022).
- Murphy, R. J., Browning, A. P., Gunasingh, G., Haass, N. K., Simpson, M. J. Designing and interpreting 4D tumour spheroid experiments. Communications Biology. 5 (1), 91 (2022).
