Summary
В данной работе описан метод хронического наблюдения in vivo микроглии покоя в гиппокампе мыши CA1 с использованием точно контролируемой хирургии и двухфотонной микроскопии.
Abstract
Микроглия, единственные иммунные клетки, находящиеся в головном мозге, активно участвуют в поддержании нейронной цепи, изменяя синапсы и возбудимость нейронов. Недавние исследования выявили дифференциальную экспрессию генов и функциональную гетерогенность микроглии в разных областях мозга. Уникальные функции нейронной сети гиппокампа в обучении и памяти могут быть связаны с активной ролью микроглии в ремоделировании синапсов. Тем не менее, воспалительные реакции, вызванные хирургическими процедурами, были проблематичными при двухфотонном микроскопическом анализе микроглии гиппокампа. Здесь представлен метод, который позволяет хронически наблюдать микроглию во всех слоях гиппокампа CA1 через окно визуализации. Этот метод позволяет проводить анализ морфологических изменений микроглиальных процессов на протяжении более 1 месяца. Долгосрочная визуализация микроглии покоя с высоким разрешением требует минимально инвазивных хирургических процедур, соответствующего выбора объектива и оптимизированных методов визуализации. Преходящая воспалительная реакция микроглии гиппокампа может препятствовать визуализации сразу после операции, но микроглия восстанавливает свою морфологию в состоянии покоя в течение нескольких недель. Кроме того, визуализация нейронов одновременно с микроглией позволяет нам анализировать взаимодействия нескольких типов клеток в гиппокампе. Этот метод может предоставить важную информацию о функции микроглии в гиппокампе.
Introduction
Микроглия являются единственными иммунными клетками и тканевыми макрофагами, находящимися в головном мозге. Было показано, что в дополнение к их функциям иммунных клеток, таким как быстрая реакция на воспаление, они играют различные физиологические роли в поддержании и ремоделировании нейронных цепей, такие как синаптическая обрезка, регуляция синаптической пластичности и контроль активности нейронов 1,2,3,4,5 . Физиологические взаимодействия между микроглией и нейронами представляют все больший интерес как для развития нейронных цепей, так и для нейробиологии заболеваний. Анализ физиологии микроглии in vivo требует методов наблюдения за микроглией без повреждения тканей и воспалительных реакций. Однако микроглии чувствительны к воспалению и резко меняют свою форму и функции в ответ на повреждение тканей 6,7.
Двухфотонная визуализация in vivo является идеальным инструментом для фиксации физиологической динамики микроглии8. Первоначальные применения двухфотонной визуализации in vivo выявили динамическое движение микроглиальных процессов для наблюдения за окружающей средой в коре головного мозга взрослых мышей 9,10. Следующие исследования двухфотонной визуализации еще больше расширили мониторинг микроглии in vivo для анализа функциональных и структурных взаимодействий с нейронами 5,11,12,13,14. Однако глубина визуализации обычной двухфотонной микроскопии была ограничена менее чем 1 мм от поверхности мозга15,16. Это ограничение объясняет скудность предыдущих исследований, в которых сообщалось о поведении микроглии в глубоких областях мозга, таких как гиппокамп.
Недавние исследования секвенирования РНК выявили значительную региональную гетерогенность микроглии, что повышает вероятность различных функциональных ролей 17,18,19,20,21. Поэтому необходимо регистрировать микроглиальные взаимодействия с нейронами в различных областях мозга, но технические трудности мешают таким исследованиям. В частности, сообщалось, что активное участие микроглии в ремоделировании синапсов имеет решающее значение для развития нейронной сети гиппокампа и ее функций, связанных с памятью22,23. Однако эффективных методов наблюдения за неоспоримой микроглией гиппокампа in vivo не было.
Этот протокол объясняет процедуры хронического наблюдения in vivo микроглии покоя в CA1 дорсального гиппокампа с использованием точно контролируемых хирургических методов. Двухфотонная визуализация области CA1 у мышей CX3CR1-GFP (CX3CR1+/GFP), которые экспрессируют GFP в микроглии24, позволила наблюдать разветвленную микроглию во всех слоях CA1 с достаточным разрешением. Протокол включает в себя несколько советов для успешной имплантации смотрового окна и соответствующих условий визуализации. Кроме того, в качестве примера применения представлена одновременная визуализация пирамидных нейронов и микроглии в СА1. Также обсуждаются преимущества, ограничения и возможности этой техники.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены и проведены в соответствии с политикой Комитета по этике животных и Комитета по безопасности генетических рекомбинантных экспериментов Токийского университета. В экспериментах использовались как самцы, так и самки мышей CX3CR1-GFP в возрасте 2-4 месяцев. Для безопасности экспериментаторов и поддержания стерильных условий все процедуры проводились в белых халатах, масках и стерильных перчатках. Все инструменты были стерилизованы перед использованием.
1. Подготовка инструментов и животных
- Соберите металлическую трубку со стеклянным дном (рис. 1А).
- Нанесите небольшую каплю оптического клея УФ-отверждения на один конец изготовленной по индивидуальному заказу нержавеющей трубки (наружный диаметр 3,0 мм, внутренний диаметр 2,8 мм, высота 1,7 мм). Равномерно распределите клей по круглому краю тюбика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует использовать достаточное количество клея, чтобы покрыть весь край трубки. - Поместите круглое стеклянное покровное стекло (диаметр 3,0 мм, толщина 0,15 ± 0,02 мм) к покрытому клеем концу металлической трубки и слегка прижмите покровное стекло к трубке, чтобы зазор между трубкой и стеклом был заполнен клеем. Затем отрегулируйте положение стекла так, чтобы оно соответствовало внешнему краю металлической трубки.
- Облучайте стекло ультрафиолетовым светом в течение достаточного времени, чтобы клей затвердел.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что стекло и трубка полностью прикреплены. Если адгезия недостаточна, стекло может оторваться после операции, что приведет к неудачной визуализации или утечке спинномозговой жидкости (CSF). - Собранную металлическую трубку со стеклянным дном продезинфицируйте 70% этанолом и промойте стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить мусор.
- Нанесите небольшую каплю оптического клея УФ-отверждения на один конец изготовленной по индивидуальному заказу нержавеющей трубки (наружный диаметр 3,0 мм, внутренний диаметр 2,8 мм, высота 1,7 мм). Равномерно распределите клей по круглому краю тюбика.
- Стерилизуйте все хирургические инструменты с помощью сухожарового стерилизатора.
- Подготовьте мышей к операции по имплантации окна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши должны быть соответствующего возраста. Предпочтительно, чтобы они были генетически модифицированы для экспрессии флуоресцентных белков в CA1 и зубчатой извилине (DG). Эти моменты более подробно разъясняются в разделе «Обсуждение».
2. Анестезия и фиксация головы
- Обезболивают мышь внутрибрюшинной инъекцией кетамина-ксилазина (100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина). Вводят мелоксикам (2 мг / кг) путем подкожной инъекции для предоперационной анальгезии. Подтвердите исчезновение реакции на болевые раздражители, такие как защемление хвоста, чтобы обеспечить достаточную глубину анестезии. Добавляйте половину дозы кетамина-ксилазина каждый раз, когда анестезия прекращается во время операции, обычно через 1 час после первоначального введения и каждые 30 минут после этого. Используйте грелку под телом, чтобы обеспечить тепловую поддержку, и нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор анестезии для операции имеет важное значение. Этот момент подробно обсуждается в разделе «Обсуждение». - Нанесите крем для депиляции, чтобы удалить волосы с кожи головы. Продезинфицируйте кожу головы несколько раз круговыми движениями повидон-йодным скрабом с последующим добавлением спирта. Поместите мышь на хирургическую платформу, подготовленную стерильной водонепроницаемой прокладкой, и наложите стерильные простыни, чтобы закрепить место операции. Затем разрезайте и удалите кожу головы по кругу скальпелем, чтобы теменная и затылочная кости были полностью обнажены на операционной стороне.
- Удалите подкожную соединительную ткань, протерев ее ватным тампоном, применяя стерильный физиологический раствор, чтобы очистить кровотечение. Аккуратно соскребите поверхность черепа миниатюрным ножом с круглым наконечником, чтобы удалить надкостницу, которая помогает укрепить сцепление между цементом и костью (см. шаг 2.6).
- Нанесите материал для травления зубов на всю поверхность, подождите десятки секунд и смойте достаточным количеством стерильного физиологического раствора.
- Используя водостойкие чернила, отметьте область кости, подлежащую удалению (круглая область диаметром 3,0 мм, с центром примерно на 2,5 мм сзади и на 2,5 мм сбоку от брегмы). После разметки тщательно высушите поверхность черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Положение трепанации зависит от размера гиппокампа и должно быть оптимизировано для разных возрастов. Полезные индикаторы положения трепанации черепа будут представлены ниже (см. шаг 3.4.5, ПРИМЕЧАНИЕ). - Прикрепите прямоугольную алюминиевую пластину толщиной 1,0 мм и отверстием диаметром 5,0 мм в центре к черепу с помощью цемента из стоматологической смолы в соответствии с инструкциями производителя.
- Аккуратно совместите отверстие в центре пластины с круглой областью, отмеченной ручкой (см. шаг 2.5), так, чтобы алюминиевая пластина была параллельна размеченной поверхности черепа (рис. 1B). Убедитесь, что цемент плотно закрывает все зазоры между пластиной и костью. Подождите около 5 минут, чтобы цемент достаточно затвердел.
- Поместите мышь на устройство для удержания головы с помощью регуляторов угла наклона через прикрепленную пластину.
3. Имплантация смотрового окна
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие хирургические процедуры следует проводить под стереомикроскопом.
- Сделайте круговую бороздку на черепе с помощью дермального пуансона диаметром 3,0 мм. Совместите круглую канавку и область, отмеченную пером, на шаге 2.5. Скрутите дермальный пуансон легким нажимом так, чтобы глубина бороздки постепенно увеличивалась. Часто проверяйте, чтобы глубина канавки была постоянной по всей окружности.
- Когда дермальный пуансон достигнет самого внутреннего слоя черепа, прежде чем коснуться нижележащей твердой мозговой оболочки, осторожно поднимите центральный костный остров с помощью иглы 30 G.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое вытекание жидкости из нижней части канавки указывает на то, что канавка находится близко к твердой мозговой оболочке. - Удалите твердую мозговую оболочку с помощью средства подбора твердой мозговой оболочки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полное удаление твердой мозговой оболочки в черепном окне необходимо и потребует тщательной резекции остаточной твердой мозговой оболочки на периферии с использованием тонких щипцов. - Аккуратно аспирируйте ткань, чтобы обнажить альвеус гиппокампа тупыми иглами 23 G или 25 G, соединенными с аспиратором.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является наиболее важным для успешной визуализации. Ключевые технические моменты тканевой аспирации подробно описаны в разделе «Обсуждение».- Аспирируйте пиа и пиальные сосуды.
- Аспирируйте корковую ткань с поверхности. Глубина открытой поверхности тканей должна быть однородной по всему черепному окну. Постепенно углубляйте аспирацию до тех пор, пока волокна внешней капсулы не обнажаются.
- Осторожно поднесите всасывающий наконечник к внешней капсуле рядом с боковым желудочком (ЛЖ), расположенным на ростролатеральном конце черепного окна. Удалите поверхностный слой наружной капсулы, идущий в хвостомедиальном направлении в ростролатеральном направлении, а затем внутренний слой, идущий в медиолатеральном направлении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Внешняя капсула рядом с LV может быть легко удалена из нижележащей структуры. - Подтвердите удаление всей внешней капсулы, проверив полное обнажение поверхности альвеуса и дорсальной спайки гиппокампа (DHC).
ПРИМЕЧАНИЕ: DHC покрывает хвостомедиальную часть CA1. Альвеус и ДГК можно отличить от внешней капсулы по ориентации волокон. А именно, волокна внутри альвеуса и DHC проходят в ростомедиальном и каудолатеральном направлении, и их можно отличить от волокон во внешней капсуле. Альвеус и DHC плотно прикреплены к CA1 и не должны быть повреждены. Все фрагменты внешней капсулы должны быть удалены, так как любые оставшиеся фрагменты будут препятствовать прямому контакту стеклянного покровного стекла с альвеусом. - Убедитесь, что кровотечение полностью остановилось, и заполните отверстие стерильным физиологическим раствором до уровня поверхности черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поле зрения здесь помогает судить о том, находится ли отверстие в подходящем положении для конкретного возраста мыши. В идеале альвеус и нижележащий CA1 должны занимать большую часть центральной области. Часть ДГК видна в хвостомедиальной области. Отверстие ЛЖ обнаруживается на ростролатеральном краю (рис. 3А).
- Вставьте металлическую трубку со стеклянным дном (см. шаг 1.1) вертикально в отверстие, всасывая лишнюю воду, которая выливается со стенок трубки, пока стеклянное дно не слегка прижмется к альвеусу и частично не сплющет нижележащий CA1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это давление должно быть отрегулировано соответствующим образом. Если он слишком прочный, CA1 будет поврежден. Если он слишком слабый, сферическая аберрация из-за кривизны CA1 ухудшит разрешение изображения в глубоких структурах. - Используя цемент из стоматологической смолы, закрепите стенку вставленной трубки к окружающему черепу (рис. 1В). Убедитесь, что вся окружность плотно закрыта и нет утечки воздуха или спинномозговой жидкости. Подождите около 5 минут, пока цемент затвердеет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если цемент помещается при низкой вязкости, он может просочиться в паренхиму мозга через зазор между трубкой и черепом и повредить мозг. Поэтому цемент следует наносить после начала полимеризации, что увеличивает вязкость и уменьшает утечку через зазор. - Промойте всю тарелку, череп и внутреннюю часть пробирки стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить мусор.
4. Двухфотонная микроскопия сразу после операции для проверки качества операции
- Установите мышь в устройство для удержания головы под объективом двухфотонного микроскопа и на моторизованном сканирующем столике XY. Используйте грелку для термоподдержки. Контролируйте и регулируйте глубину анестезии, как описано в шаге 2.1, так как эта проверка качества может занять до 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать погружной в воду объектив с рабочим расстоянием (WD) более 3 мм и высокой числовой апертурой (NA). Корректирующий воротник линзы объектива может улучшить разрешение, компенсируя несоответствие показателя преломления между стеклом и биоматериалами. - Заполните пространство между стеклом и линзой объектива водой, соблюдая особую осторожность, чтобы избежать пузырьков воздуха. При необходимости расширить площадь металлической пластины можно с помощью полиэтиленовой пленки, которая удерживает больше воды, чтобы покрыть всю переднюю линзу объектива.
- Включите фемтосекундный импульсный лазер с длиной волны 920 нм для возбуждения флуоресцентных зондов, экспрессируемых в мозге, и запустите программное обеспечение для получения изображений.
- Отрегулируйте фокусировку на CA1 с помощью моторизованной сцены и моторизованной системы фокусировки. Расположите целевую структуру под руководством флуоресценции, испускаемой паренхимой головного мозга, и отраженного света от края металлической трубки при непрерывном освещении импульсным лазером.
- Измерьте глубину паренхимы мозга, касающейся стеклянного дна, отрегулировав фокусировку с помощью моторизованной системы фокусировки. Сравните глубины в разных горизонтальных местах, чтобы судить о выравнивании стеклянного дна и плоскости изображения.
- Отрегулируйте угол наклона головки мыши, наклоняя устройство для удержания головы до тех пор, пока дно стекла не будет установлено параллельно плоскости изображения.
- Отрегулируйте корректирующий воротник объектива для достижения наибольшего разрешения на глубине целевой структуры в CA1.
- Подтвердите, что флуоресцентные клетки в молекулярном слое (ML) верхней лопасти DG на глубине 500 мкм от дна стекла могут быть отображены во всем поле зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для оценки качества операции. При повреждении СА1 очаговый отек мозга препятствует обнаружению флуоресценции на глубине более 200 мкм от поверхности. Только в том случае, если СА1 не поврежден, а кривизна слоев СА1 должным образом сглажена вышележащим покровным стеклом, сигналы ДГ могут быть обнаружены сразу после операции (рис. 2A-D). В разделе «Репрезентативные результаты» представлен простой способ определения границы между CA1 и DG.
5. Послеоперационный уход
- Аспирируйте воду внутри трубки и накройте ее пластиковым уплотнением, чтобы предотвратить попадание мусора.
- Держите мышь в тепле и дождитесь восстановления после анестезии.
- Вводите мелоксикам (2 мг / кг) подкожно каждые 24 часа, пока мышь проявляет поведение, связанное с болью.
- Выращивают послеоперационную мышь в индивидуальном жилье в течение нескольких недель.
6. Хроническая двухфотонная визуализация микроглии in vivo с использованием мышей CX3CR1-GFP
- После индукции анестезии промойте внутреннюю часть металлической трубки стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить мусор. Убедитесь, что белая альвеус гиппокампа видна через стекло (рис. 3А) и нет осложнений, таких как послеоперационное кровотечение.
- Установите мышь под двухфотонный микроскоп, выполнив шаги с 4.1 по 4.6.
- Проверьте качество и интенсивность изображений, полученных при двухфотонном возбуждении гиппокампа (рис. 3Б). Убедитесь, что изображения, сделанные после уменьшения послеоперационного отека, сопоставимы или лучше, чем изображения, сделанные в день операции (рис. 2A, см. шаг 4.5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ухудшение изображения указывает на наличие повреждения тканей внутри мозга. - Убедитесь, что микроглия уже восстановила свою разветвленную морфологию (рис. 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные визуализации микроглии показывают, что для возвращения микроглии в базальное состояние требуется не менее 3-4 недель. - Выполняйте визуализацию in vivo в любых слоях CA1 для конкретной цели эксперимента.
Representative Results
Используя этот метод, разветвленная и спокойная микроглия может хронически наблюдаться во всех слоях дорсального CA1, включая stratum oriens (SO), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) и stratum lacunosum-moleculare (SLM), особенно через 3-4 недели после операции, когда воспаление стихает. Если операция выполнена надлежащим образом, визуализация может быть выполнена в течение нескольких месяцев после операции. Этот раздел содержит три темы, полезные для оценки прижизненной визуализации. Во-первых, образцы изображений сразу после операции и в хронической фазе предоставляются в качестве эталонов для соответствующих хирургических процедур и процедур визуализации. Во-вторых, описана отчетливая морфология микроглии, интенсивность их флуоресценции и распределение кровеносных сосудов в определенных слоях гиппокампа, чтобы помочь читателям оценить глубину визуализации в диапазоне от альвеуса до ДГ. В-третьих, приведен пример применения, иллюстрирующий одновременную визуализацию нейронов и микроглии.
Репрезентативные изображения микроглии у мышей CX3CR1-GFP сразу после операции показаны на рисунке 2. Если нет видимых повреждений CA1 и кривизна слоев CA1 должным образом сплющена вышележащим покровным стеклом, глубина двухфотонной визуализации микроглии превышает все слои CA1 и достигает 500 мкм от хирургической поверхности, где существует ML или слой гранулярных клеток (GCL) DG (рис. 2A; см. шаг 4.7 и рис. 4E). Микроглия немного менее разветвлена, особенно в слое, близком к хирургической поверхности, по сравнению с таковыми в интактном гиппокампе. Тем не менее, они не проявляют заметной активации, что свидетельствует о надлежащих хирургических процедурах (рис. 2B). С другой стороны, отек в CA1, вызванный повреждением тканей, ограничит глубину визуализации до 200 мкм (рис. 2C). Повреждение тканей также вызывает аномальную активацию микроглии, такую как накопление выпуклых процессов к поверхности свободных тканей (рис. 2D; сравните с верхним изображением на рисунке 2B). Это признаки неправильного хирургического вмешательства.
Репрезентативные изображения микроглии в хронической фазе более чем через 3 недели после операции показаны на рисунке 3. Микроглия может быть снова визуализирована за пределами CA1 в более глубокие слои DG с более высокой интенсивностью флуоресценции и разрешением и с более однородным распределением (см. шаг 6.3, рис. 3B). Качество визуализации лучше, чем сразу после операции (рис. 2A). Эта разница может быть объяснена уменьшением отека и воспаления. Микроглия во всех слоях уже восстановила свою разветвленную морфологию (рис. 3В), отличную от их послеоперационного вида (рис. 2В). Покадровая визуализация микроглии в CA1 выявляет неподвижные клеточные тела и высокоподвижные процессы для наблюдения (видео 1-2). Их подвижное поведение аналогично предыдущему сообщению о динамике микроглиальных процессов в кореголовного мозга 9.
Легко определить визуализированные слои гиппокампа на основе распределения и глубины тел нейрональных клеток, используя мышей, экспрессирующих флуоресцентные зонды в нейронах гиппокампа25,26,27. Без помощи позиционной информации о телах нейронных клеток сигналы от флуоресцентной микроглии сами по себе дают некоторые подсказки для идентификации слоев гиппокампа (рис. 3B). Микроглия в альвеусе имеет удлиненные клеточные тела и отростки, которые имеют тенденцию распространяться вдоль аксональных путей (рис. 4А). Микроглию в других слоях можно отличить по их круглым клеточным телам и отросткам, расходящимся без предпочтительных направлений. Микроглии в SP относятся к числу плотно упакованных пирамидных нейронов и могут быть различимы по меньшей плотности микроглиальных процессов. Слои выше и ниже SP обозначаются как SO и SR соответственно (рис. 4B). Невозможно провести различие между SR и SLM, основываясь только на свойствах микроглии. Граница между CA1 и DG распознается по толстым кровеносным сосудам, идущим вдоль границы (рис. 4C). Эти сосуды можно лучше распознать, пометив сосуды такими красителями, как сульфорходамин 101 (SR101; 5 мМ, 4 мкл / г массы тела), вводимыми внутрибрюшинно (рис. 4D). Сигнал флуоресценции от микроглии резко падает в DG по сравнению с вышележащим CA1, вероятно, из-за разницы в показателе преломления этих структур. Этот разрыв в интенсивности флуоресценции также может помочь определить границу между DG и CA1. В качестве примера применения показана одновременная визуализация GFP-положительной микроглии и tdTomato-меченных пирамидных нейронов (рис. 4E). В этом эксперименте мыши CX3CR1-GFP получили инъекцию аденоассоциированного вируса (AAV) для экспрессии tdTomato в пирамидных нейронах гиппокампа. Маркировка нейронов поможет понять точные слоистые структуры CA1.
Рисунок 1: Схематические чертежи для имплантации смотрового окна . (А) Вид в поперечном сечении собранной металлической трубы со стеклянным дном. Круглый стеклянный покров прилипает к одному концу цилиндрической нержавеющей трубки. (B) Вид в поперечном сечении алюминиевой пластины, прикрепленной к черепу. Пластина должна быть параллельна размеченной поверхности черепа, чтобы не мешать линзе объектива, расположенной близко к пластине для фокусировки. (C) Вид имплантированной трубки в поперечном сечении. Стеклянное дно должно быть плотно прикреплено к альвеусу гиппокампа, чтобы мягко прижать и сплющить поверхность CA1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Визуализация микроглии in vivo у мышей CX3CR1-GFP сразу после операции. (A) Репрезентативная 3D-реконструкция на основе визуализации in vivo CA1 мыши CX3CR1-GFP в послеоперационный день (POD) 0 (ширина: 511 мкм, высота: 511 мкм, глубина: 550 мкм). Флуоресцентная микроглия в МЛ ДГ на глубине 500 мкм от дна стекла может быть визуализирована через весь СА1. (B) Типичные микроглии, заполненные GFP, полученные в (A), показаны как проекции максимальной интенсивности (MIP) стеков изображений толщиной 20 мкм на глубинах 100, 300 и 520 мкм от дна стекла. Морфология микроглии обнаруживается от поверхностного CA1 до ML DG, хотя и с явным ухудшением изображения в DG. Микроглия, особенно в слое, близком к хирургической поверхности, менее разветвлена, но не проявляет очевидной активации. Масштабные линейки, 50 мкм. (C) Репрезентативная реконструкция 3D-изображения хирургически поврежденного CA1. Данные были получены с мыши CX3CR1-GFP на POD 0 (ширина: 399 мкм, высота: 399 мкм, глубина: 450 мкм). Флуоресценция микроглии обнаруживается только на глубине до 200 мкм, в отличие от неповрежденной CA1 (A) с флуоресцентной микроглией, обнаруженной на глубине 500 мкм. (D) Типичное изображение аномально активированной микроглии в (C). MIP стопок изображений GFP толщиной 20 мкм на глубине 60 мкм показывает процессы выпячивания микроглии, распространяющиеся к поверхности ткани, подвергшейся хирургическому воздействию. Общая морфология микроглии отличается от изображения, показанного на (B). Масштабная линейка, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Визуализация микроглии in vivo у мышей CX3CR1-GFP в хронической фазе. (A) Репрезентативный вид имплантированного окна на правом дорсальном CA1 в хронической фазе. Через стеклянное дно отчетливо наблюдаются белые волокна альвеуса без послеоперационного кровотечения. ДГК и ЛЖ частично видны в хвостомедиальной области и в ростролатеральном крае соответственно. Масштабная линейка, 1 мм. (B) Репрезентативная 3D-реконструкция хронической визуализации CA1 мыши CX3CR1-GFP in vivo на POD 24 (ширина: 511 мкм, высота: 511 мкм, глубина: 670 мкм). По сравнению со снимками сразу после операции (рис. 2А), микроглия показывает более однородное распределение и может наблюдаться более четко в более глубоких слоях ДГ из-за уменьшения отека и воспаления. (C) Типичные изображения микроглии из (B) с полностью восстановленной разветвленной морфологией показаны в виде MIP стеков изображений GFP толщиной 20 мкм на глубинах 100, 280 и 500 мкм от хирургической поверхности. Масштабные линейки, 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Подсказки для идентификации каждого слоя гиппокампа во время визуализации in vivo и пример применения этого метода. (A) Типичное изображение микроглии в альвеусе мышей CX3CR1-GFP в хронической фазе. Тела микроглиальных клеток и отростки, простирающиеся вдоль аксональных трактов, показаны в стеках изображений MIP GFP толщиной 10 мкм на глубине 15 мкм. Масштабная линейка, 50 мкм. (B) Репрезентативные изображения микроглии в SO, SP и SR в хронической фазе, показанные в виде MIP стопок изображений GFP толщиной 5 мкм. Локальная плотность микроглиальных процессов в SP ниже, чем в окружающих SO или SR из-за плотно упакованных пирамидных нейронов в SP. Масштабные линейки, 100 мкм. (C) Толстые кровеносные сосуды, проходящие вдоль границы между CA1 и DG, могут быть распознаны только по флуоресценции микроглии. Показана средняя проекция интенсивности мозаичных стеков изображений GFP толщиной 90 мкм в хронической фазе на глубине около 500 мкм. Пустота сигнала GFP соответствует толстым сосудам. Масштабная линейка, 500 мкм. (D) (Верхний) Изображение того же поля зрения, что и C после внутрибрюшинной инъекции SR101. Масштабная линейка, 500 мкм. (нижняя) 3D-реконструкция изображений плитки после инъекции SR101 (ширина: 2,60 мм, высота: 1,73 мм, глубина: 0,69 мм). Толстые сосуды, идущие вдоль границы между CA1 и DG, можно легко распознать по внутрисосудистой флуоресценции SR101. (E) (слева) 3D-реконструкция CA1 и DG (ширина: 255 мкм, высота: 255 мкм, глубина: 730 мкм) и (справа) MIP флуоресценции GFP и tdTomato в SP, выполненная из стопок изображений толщиной 20 мкм. За 1 неделю до операции 1,5 мкл смеси AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5,0 x 10 12 мкг/мл) и AAV1-hSyn-Cre (1,0 x10 9 мкг/мл) вводили в гиппокамп мыши CX3CR1-GFP для редкой маркировки нейронов. Визуализация проводилась на POD 0. SP и GCL легко распознаются по положению тел нейрональных клеток. Масштабная линейка, 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Покадровая визуализация микроглии SO в хронической фазе. MIP изображения GFP имеет толщину 20 мкм в покадровой съемке микроглии SO, анимированной таким образом, что 28 минут воспроизведения за 1 секунду. Масштабная линейка, 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Покадровая визуализация микроглии SR в хронической фазе. MIP изображения GFP имеет толщину 20 мкм в покадровой съемке микроглии SR, анимированной таким образом, что 28 минут воспроизведения за 1 секунду. Масштабная линейка, 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Discussion
Этот метод содержит сложные хирургические процедуры, но при правильной подготовке он может обеспечить изображения с высоким разрешением по всему CA1 в течение длительного периода времени. Эксперименты с несколькими мышами подтвердили, что качество изображения в хронической послеоперационной фазе лучше, чем при острой послеоперационной визуализации. Лучшее качество изображения сохранялось более 2 месяцев. Наиболее частой причиной отказа является непреднамеренное повреждение СА1 во время операции, которое выявляется при послеоперационной проверке качества (см. шаг 4). Это может быть связано с прямым повреждением аспирацией, высыханием мозга, чрезмерным давлением стекла или токсичностью зубного цемента на последнем этапе. Другой причиной неудачи является послеоперационное кровотечение, которое может быть подтверждено через стеклянное нижнее окно в течение 1 недели после операции (см. шаг 6.1). Внимательно прочитайте протокол и примите все меры предосторожности, чтобы избежать подобных неприятностей.
Даже при нынешней установке двухфотонного микроскопа с детекторами GaAsP в лаборатории попытка визуализировать дорсальный CA1 через кору головного мозга приводит к значительной потере разрешения из-за непренебрежимо малого рассеяния света. Поэтому для получения достаточной разрешающей способности наблюдать за движением микроглиальных процессов или формированием дендритных шипиков нейронов в СА1 неизбежно удаление части вышележащей коры, как и в настоящем способе. Единственным альтернативным способом уменьшить степень удаления коры головного мозга при сохранении высокого разрешения изображения является встраивание релейной линзы, такой как линза с градиентным показателем преломления (GRIN). В этом подходе линза GRIN была помещена внутрь направляющей трубки, имплантированной непосредственно над CA1, для хронической визуализации CA128,29. Наружный диаметр направляющей трубки составлял 1,8 мм, что меньше, чем 3,0 мм устройства в этой статье, при этом обеспечивая высокое разрешение (NA; 0,82), сравнимое с системой здесь (эффективный NA; 0,88). Однако подход с использованием объектива GRIN имеет узкое поле зрения для наблюдения с высоким разрешением и малую глубину изображения, ограниченную WD объектива GRIN. Таким образом, визуализация всех слоев гиппокампа в широком поле зрения с высоким разрешением является специфическим преимуществом метода в данной работе.
Ограничением этой процедуры является то, что частичное удаление коры и воспаление могут иметь некоторые пагубные последствия для гиппокампа. Однако, поскольку удаленная кора не имеет прямого входа в гиппокамп, энторинальная кора не повреждается, а сам гиппокамп не повреждается напрямую, общая оценка заключается в том, что функциональное нарушение гиппокампа не является значительным. Несколько предыдущих исследований подтвердили, что функции гиппокампа, включая обучение и память, сохраняются после имплантации окна гиппокампа 25,26,27,30,31,32,33,34. Таким образом, ожидается, что описанный здесь подход к визуализации будет точно сообщать о функциях гиппокампа после достаточного послеоперационного периода.
Будущие направления исследований субъектов, основанных на этом методе визуализации, могут включать синаптическую обрезку, обнаруженную при одновременной визуализации микроглии и нейронов5, связанное с обучением взаимодействие микроглии с синапсами35, подвижность микроглии, регулируемую нейронной активностьюгиппокампа 36, и реакции микроглии на периферическое воспаление или повреждение тканей7. Этот метод также поможет выяснить прогрессирование нейродегенеративных заболеваний. Например, при болезни Альцгеймера (БА) амилоидные β и тау-белки накапливаются параллельно с гибелью нейрональных клеток и атрофией гиппокампа, что приводит к когнитивной дисфункции; Сообщалось, что микроглия участвует в этом процессе37,38. Хроническая визуализация микроглии и нейронов in vivo с использованием моделей мышей с болезнью Альцгеймера позволит нам отслеживать корреляцию между функциями микроглии и патологией нейронов в гиппокампе моделей мышей с болезнью Альцгеймера.
В этой статье основное внимание уделяется микроглиальной визуализации, но та же процедура визуализации применима к другим типам нейрональных и глиальных клеток в CA1. Кроме того, протокол ограничен визуализацией анестезированных мышей, но этот метод также может быть распространен на мониторинг микроглии гиппокампа у бодрствующих мышей. Артефакты движения, вызванные дыханием, сердцебиением и движениями тела, особенно в глубоких слоях гиппокампа вдали от стеклянного окна, могут существовать в экспериментах с бодрствующими мышами. Следовательно, может потребоваться соответствующая система коррекции движения для захвата морфологии и динамики микроглии.
Обсуждение, связанное с Протоколом
Целесообразно отбирать мышей соответствующего возраста и генетических модификаций для экспрессии флуоресцентных зондов с временной и пространственной специфичностью (см. шаг 1.3). Мыши в возрасте 1 месяца могут быть использованы для экспериментов, но с мышами старше 2 месяцев легче обращаться, с их большими размерами тела и устойчивостью к хирургическому стрессу. Кроме того, внешнюю капсулу и альвеус гиппокампа труднее отделить у молодых мышей. Поэтому удаление внешней капсулы у молодых мышей требует хирургических навыков (см. шаги 3.4.3-4). Оценка хирургического вмешательства и последующей визуализации будет более простой с мышами, экспрессирующими флуоресцентные белки воспроизводимо и равномерно в CA1 и DG (см. шаг 4.7). Следовательно, в первоначальных испытаниях операции рекомендуется использовать трансгенных мышей с редко мечеными нейронами, таких как мыши Thy1-YFP или Thy1-GFP39, или мышей с меченой микроглией, таких как мыши CX3CR1-GFP24.
Для успешной операции важен выбор анестезии (см. шаг 2.1). Различные виды анестезии могут вызывать различные степени интраоперационного отека мозга, которые влияют на сложность операции, взаимное расположение имплантированной металлической трубки и степень сжатия мозга стеклянным окном. Эти факторы также могут влиять на выживание нейронов гиппокампа после операции.
В процессе аспирации обнажить гиппокамп (см. шаг 3.4) следует отметить следующие моменты, чтобы свести к минимуму повреждение мозга и обеспечить успешную визуализацию. Постоянно подавайте стерильный физиологический раствор на поверхность ткани, расположив выходное отверстие сбоку от черепного окна. Не допускайте контакта воздуха с поверхностью тканей во время аспирации. Основным принципом тканевой аспирации является удаление тканевой поверхности потоком жидкости во всасывающий наконечник. Следует избегать прямого контакта всасывающего наконечника с тканью. Отрегулируйте отрицательное давление, приложенное к всасывающей трубке, до минимума. Аспирируйте ткань шаг за шагом и убедитесь, что кровотечение контролируется на каждом этапе. Когда кровотечение затягивается, подождите, пока кровотечение не прекратится самопроизвольно. Держите аспирацию на небольшом расстоянии от места кровотечения с постоянным потоком стерильного физиологического раствора. Аспирируйте ткань, чтобы создать цилиндрическое пространство, размер которого соответствует металлической трубке со стеклянным дном (см. шаг 1.1). Выбирайте иглы 23 г для аспирации толстых пиальных сосудов или крупных фрагментов тканей и иглы 25 г для отсасывания мелкого тканевого мусора.
Disclosures
Ни у кого из авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить М. Кондо и М. Мацудзаки за предоставление нам объектива XLPLN25XSVMP. Эта работа была финансово поддержана Японским обществом содействия науке (JSPS) грантом для научного сотрудника JSPS (18J21331 для Р.К.) и грантами в помощь для научных исследований (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 для S.O.), от Японского агентства медицинских исследований и разработок (JP19gm1310003 и JP17gm5010003 для S.O.) и от Японского агентства по науке и технологиям от Moonshot R&D (JPMJMS2024 до HM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G blunt needles | NIPRO | 02-166 | Suction tips for aspiration. |
| 25 G blunt needles | NIPRO | 02-167 | Suction tips for aspiration. |
| 3 mm dermal punches (DermaPunch) | Maruho | 213001610 | Tools for craniotomy. |
| 30 G needles | Dentronics | Disposable needle No. 30 | Tools for craniotomy. |
| A femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | MaiTai Deep See | A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength. |
| A two-photon microscope | Nikon | A1R MP+ | Microscope for the CA1 imaging. |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
| AAV1-hSyn-Cre | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
| An objective lens for two-photon imaging | Olympus | XLPLN25XSVMP | 25× objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar |
| Aspirators | Shin-ei Industries | KS-500 | Tools for aspiration. |
| Aluminum plates | Narishige | CP-1 | Plates made of alminum for head fixation. |
| Chemical depilatory cream | YANAGIYA | Cream for hair removal around the surgical site. | |
| Circular glass coverslips | Matsunami Glass | 3φ No.1 | Coverslips bonded to stainless steel tubes. |
| CX3CR1-GFP mice | The Jackson Laboratory | 008451 | Transgenic mice for microglial imaging. |
| Cylindrical stainless steel tubes | MORISHITA | Custom-made | Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm. |
| Dental etching material | Sun Medical | 204610461 | Used to etch the skull bones. |
| Dental resin cement (Super-Bond C&B) | Sun Medical | 204610555 | Dental cement. |
| Dura pickers (Micro Points) | Fine Science Tools | 10063-15 | Tools for dura removal. |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11252-20 | Surgical tools. |
| Forceps | Bio Research Center | PRI13-3374 | Used to disinfect the surgical site. |
| Head holding device | Narishige | MAG-2 | The head holding device of mice with angle adjusters |
| Heating pad | Bio Research Center | BWT-100A and HB-10 | Tools to provide thermal support for the mouse during surgery. |
| Heating pad | ALA Scientific | HEATINGPAD-1 and Hot-1 | Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device. |
| Ketamine (Ketalar) | Daiichi Sankyo Company | S9-001665 | Anesthesia during surgery. |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | Analgesia during surgery. |
| Ophthalmic ointment | Sato Pharmaceutical | Used to prevent eye dryness during surgery. | |
| Povidone-iodine scrub solution | Meiji Seika Pharma | 2612701Q1137 | Used to disinfect the surgical site. |
| Round-tipped miniature knives | Surgistar | 4769 | Surgical tools. |
| Scalpel | MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS | 450-098-67 | Disposable surgical tool. |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | S8 APO | Microscopes for surgery. |
| Sterile saline | Otsuka Pharmaceutical Factory | 3311401A2026 | Washing solution during surgery. |
| Sterile waterproof pad | AS ONE | 8-5945-01 | Surgical platform. |
| Sulforhodamine 101 | Sigma-Aldrich | S7635 | A dye for in vivo vessel imaging. |
| Surgical drape | Medline Industries | MP-0606F6T | Perforated drape for surgery. |
| UV light | Toshiba | GL15 | Used to cure the adhesives. |
| UV-curing optical adhesives | Thorlabs | NOA81 | Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes. |
| Xylazine (Celactal 2%) | Bayer | Anesthesia during surgery. |
References
- Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H.
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
- Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
- Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A.
- Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4 (1), 27 (2011).
- Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 1000527 (2010).
- Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7, 12540 (2016).
- Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), 0088 (2018).
- Favuzzi, E., et al. GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits. Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).
- De Biase, L. M., et al. Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia. Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).
- Ayata, P., et al. Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity. Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).
- Böttcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).
- Masuda, T., et al. Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution. Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Wang, C., et al. Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination. Science. 367 (6478), 688-694 (2020).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
- Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
- Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
- Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
- Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
- Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
- Parkhurst, C., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
- Sarlus, H., Heneka, M. T.
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M.
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
