Summary
Denna artikel beskriver en metod för kronisk in vivo-observation av vilande mikroglia i mushippocampus CA1 med hjälp av exakt kontrollerad kirurgi och tvåfotonmikroskopi.
Abstract
Microglia, de enda immuncellerna som finns i hjärnan, deltar aktivt i neurala kretsunderhåll genom att modifiera synapser och neuronal excitabilitet. Nya studier har avslöjat det differentiella genuttrycket och funktionella heterogeniteten hos mikroglia i olika hjärnregioner. De unika funktionerna i det hippocampus neurala nätverket i inlärning och minne kan associeras med de aktiva rollerna av microglia i synaps remodeling. Emellertid har inflammatoriska svar inducerade av kirurgiska ingrepp varit problematiska i tvåfotonmikroskopisk analys av hippocampus mikroglia. Här presenteras en metod som möjliggör kronisk observation av mikroglia i alla lager av hippocampus CA1 genom ett avbildningsfönster. Denna metod möjliggör analys av morfologiska förändringar i mikroglialprocesser i mer än 1 månad. Långvarig och högupplöst avbildning av vilande mikroglia kräver minimalt invasiva kirurgiska ingrepp, lämpligt objektivval av lins och optimerade bildtekniker. Det övergående inflammatoriska svaret hos hippocampus mikroglia kan förhindra avbildning omedelbart efter operationen, men mikroglia återställer sin vilande morfologi inom några veckor. Dessutom tillåter avbildande neuroner samtidigt med mikroglia oss att analysera interaktionerna mellan flera celltyper i hippocampus. Denna teknik kan ge viktig information om mikrogliafunktionen i hippocampus.
Introduction
Microglia är de enda immuncellerna och vävnadsmakrofager som finns i hjärnan. Förutom deras funktioner som immunceller, såsom snabbt svar på inflammation, har de visat sig spela en mängd olika fysiologiska roller vid underhåll och ombyggnad av neurala kretsar, såsom synaptisk beskärning, reglering av synaptisk plasticitet och kontroll av neuronaktivitet 1,2,3,4,5 . Fysiologiska interaktioner mellan mikroglia och neuroner är av ökande intresse för både neural kretsutveckling och sjukdomsneurobiologi. Att analysera fysiologin hos microglia in vivo kräver metoder för att observera microglia utan vävnadsskada och inflammatoriska svar. Microglia är dock känsliga för inflammation och förändrar dramatiskt deras former och funktioner som svar på vävnadsskador 6,7.
Tvåfotonavbildning in vivo är ett idealiskt verktyg för att fånga den fysiologiska dynamiken hos microglia8. Initiala tillämpningar av in vivo tvåfotonavbildning avslöjade den dynamiska rörelsen av mikrogliaprocesser för miljöövervakning i den vuxna muscortexen 9,10. Följande tvåfotonavbildningsstudier utvidgade ytterligare in vivo-övervakningen av mikroglia för analys av funktionella och strukturella interaktioner med neuroner 5,11,12,13,14. Bilddjupet för konventionell tvåfotonmikroskopi har dock begränsats till mindre än 1 mm från hjärnytan15,16. Denna begränsning förklarar bristen på tidigare studier som rapporterar beteendet hos microglia i djupa hjärnregioner, såsom hippocampus.
Nya RNA-sekvenseringsstudier har avslöjat en betydande regional heterogenitet av mikroglia, vilket ökar möjligheten till distinkta funktionella roller 17,18,19,20,21. Därför är det nödvändigt att registrera mikroglialinteraktioner med neuroner i olika hjärnregioner, men tekniska svårigheter har hindrat sådana studier. I synnerhet har mikroglialt aktivt engagemang i synapsremodellering rapporterats vara avgörande för utvecklingen av det hippocampus neurala nätverket och dess minnesrelaterade funktioner22,23. Effektiva metoder för att observera obestridda hippocampus mikroglia in vivo har dock inte varit tillgängliga.
Detta protokoll förklarar procedurerna för kronisk in vivo-observation av vilande mikroglia i CA1 i dorsal hippocampus med hjälp av exakt kontrollerade kirurgiska tekniker. Tvåfotonavbildning av CA1-området i CX3CR1-GFP-möss (CX3CR1 + / GFP), som uttrycker GFP i mikroglia24, möjliggjorde observation av den förgrenade mikroglia i alla lager av CA1 med tillräcklig upplösning. Protokollet innehåller flera tips för framgångsrik implantation av observationsfönstret och lämpliga bildförhållanden. Dessutom presenteras samtidig visualisering av pyramidala neuroner och mikroglia i CA1 som ett applikationsexempel. Fördelarna, begränsningarna och potentialerna med denna teknik diskuteras också.
Protocol
Alla djurförsök godkändes och genomfördes enligt riktlinjerna från djuretikkommittén och säkerhetskommittén för genetiska rekombinanta experiment vid universitetet i Tokyo. Både manliga och kvinnliga CX3CR1-GFP-möss, i åldern 2-4 månader, användes i experimenten. För experimenternas säkerhet och upprätthållandet av sterila förhållanden utfördes alla procedurer med vita rockar, masker och sterila handskar. Alla instrument steriliserades före användning.
1. Förberedelse av instrument och djur
- Montera ett metallrör med glasbotten (figur 1A).
- Applicera en liten droppe UV-härdande optiskt lim i ena änden av ett specialtillverkat rostfritt rör (ytterdiameter 3,0 mm, innerdiameter 2,8 mm, höjd 1,7 mm). Sprid limet på rörets cirkulära kant jämnt.
OBS: En tillräcklig mängd lim bör användas för att täcka hela rörets kant. - Placera ett cirkulärt glastäckglas (3,0 mm diameter, 0,15 ± 0,02 mm tjocklek) på den limtäckta änden av metallröret och tryck lätt täckglaset mot röret så att gapet mellan röret och glaset fylls med limet. Justera sedan glasets position så att det passar in i metallrörets ytterkant.
- Bestråla glaset med UV-ljus under tillräckligt lång tid för att härda limet.
OBS: Se till att glaset och röret är helt fastsatta. Om vidhäftningen är otillräcklig kan glaset lossna efter operationen, vilket resulterar i misslyckad avbildning eller läckage av cerebrospinalvätska (CSF). - Desinficera det monterade metallröret med glasbotten med 70% etanol och tvätta med steril saltlösning för att avlägsna skräp.
- Applicera en liten droppe UV-härdande optiskt lim i ena änden av ett specialtillverkat rostfritt rör (ytterdiameter 3,0 mm, innerdiameter 2,8 mm, höjd 1,7 mm). Sprid limet på rörets cirkulära kant jämnt.
- Sterilisera alla kirurgiska instrument med en torr värmesterilisator.
- Förbered möss för operation av fönsterimplantation.
OBS: Möss bör vara i lämplig ålder. Det är att föredra att de är genetiskt konstruerade för att uttrycka fluorescerande proteiner i CA1 och dentate gyrus (DG). Dessa punkter förklaras närmare i avsnittet Diskussion.
2. Anestesi och huvudfixering
- Bedöva en mus genom intraperitoneal injektion av ketamin-xylazin (100 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin). Administrera meloxikam (2 mg/kg) genom subkutan injektion för preoperativ analgesi. Bekräfta försvinnandet av svaret på smärtsamma stimuli, såsom svansklämning för att säkerställa tillräckligt djup av anestesi. Tillsätt en halv dos ketamin-xylazin varje gång anestesin avtar under operationen, vanligtvis 1 h efter den första administreringen och var 30: e minut därefter. Använd en värmedyna under kroppen för att ge termiskt stöd och applicera oftalmisk salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
OBS: Valet av anestesi för kirurgi är viktigt. Denna punkt diskuteras i detalj i avsnittet Diskussion. - Applicera hårborttagningskräm för att ta bort hår från hårbotten. Desinficera hårbotten flera gånger i en cirkulär rörelse med povidon-jodskrubb följt av alkohol. Placera musen på den kirurgiska plattformen förberedd med en steril vattentät dyna och applicera sterila draperier för att säkra operationsområdet. Skär sedan och ta bort hårbotten cirkulärt med en skalpell så att parietal- och occipitalbenen exponeras helt på operationssidan.
- Ta bort den subkutana bindväven genom att gnugga den med en bomullspinne medan du applicerar steril saltlösning för att rensa blödningen. Skrapa försiktigt kranialytan med en rundspetsad miniatyrkniv för att ta bort periosteumet, vilket hjälper till att stärka vidhäftningen mellan cementet och benet (se steg 2.6).
- Applicera tandetsningsmaterial på hela ytan, vänta i tiotals sekunder och skölj med tillräcklig steril saltlösning.
- Markera med vattentätt bläck det område av benet som ska tas bort (ett cirkulärt område med en diameter på 3,0 mm, centrerat ca 2,5 mm bakom och 2,5 mm lateralt till bregma). Efter markering, torka skalleytan noggrant.
OBS: Kraniotomins position beror på hippocampusens storlek och bör optimeras för olika åldrar. Användbara indikatorer för kraniotomins position kommer att presenteras nedan (se steg 3.4.5, OBS). - Fäst den rektangulära aluminiumplattan med en tjocklek av 1,0 mm och med ett hål med en diameter på 5,0 mm i mitten på skallen med tandhartscement enligt tillverkarens instruktioner.
- Rikta försiktigt in hålet i mitten av plattan mot det cirkulära området markerat med en penna (se steg 2.5) så att aluminiumplattan är parallell med skallens markerade yta (figur 1B). Se till att cementet tätar alla luckor mellan plattan och benet. Vänta i ca 5 minuter tills cementet härdas tillräckligt.
- Placera musen på huvudhållaren med vinkeljusterare via den bifogade plattan.
3. Implantation av observationsfönstret
OBS: Följande kirurgiska ingrepp bör utföras under ett stereomikroskop.
- Gör ett cirkulärt spår på skallen med en dermal stans med en diameter av 3,0 mm. Rikta in det cirkulära spåret och det område som markerats med en penna i steg 2.5. Vrid dermalstansen med försiktigt tryck så att spårdjupet gradvis ökar. Kontrollera ofta att spårdjupet är konstant över hela omkretsen.
- När hudstansen når det innersta lagret av kraniet, innan du rör vid den underliggande dura, lyft försiktigt den centrala benön med en 30 G nål.
OBS: Lätt vätskeläckage från botten av spåret indikerar att spåret är nära dura. - Ta bort dura med en dura picker.
OBS: Fullständigt avlägsnande av dura inom kranialfönstret är nödvändigt och kommer att kräva noggrann resektion av kvarvarande dura i periferin med fina pincett. - Aspirera försiktigt vävnaden för att exponera hippocampusens alveus med 23 G eller 25 G trubbiga nålar anslutna till aspiratorn.
Det här steget är det viktigaste för framgångsrik avbildning. Viktiga tekniska punkter för vävnadsaspirationen beskrivs i detalj i avsnittet Diskussion.- Aspirera pia och pialkärlen.
- Aspirera den kortikala vävnaden från ytan. Håll djupet på exponerad vävnadsyta homogen över hela kranialfönstret. Fördjupa gradvis aspirationen tills fibrerna i den yttre kapseln exponeras.
- Placera försiktigt sugspetsen mot den yttre kapseln nära sidoventrikeln (LV) som är belägen vid den rostrolaterala änden av kranialfönstret. Ta bort ytskiktet på den yttre kapseln som löper i caudomedial till rostrolateral riktning och sedan det inre skiktet som löper i mediolateral riktning.
OBS: Den externa kapseln nära LV kan enkelt tas bort från den underliggande strukturen. - Bekräfta avlägsnandet av hela den yttre kapseln genom att kontrollera den fulla exponeringen av alveusytan och dorsal hippocampus commissure (DHC).
DHC täcker den caudomediala delen av CA1. Alveus och DHC kan särskiljas från den externa kapseln genom deras fiberorienteringar. Namnlösa: Fibrerna i alveus och DHC löper i rostromedial till caudolateral riktning och kan särskiljas från fibrerna i den yttre kapseln. Alveus och DHC är tätt fastsatta på CA1 och bör inte skadas. Alla fragment av den yttre kapseln ska avlägsnas, eftersom eventuella återstående fragment förhindrar direkt kontakt med glaslocket till alveus. - Bekräfta att blödningen har slutat noggrant och fyll hålet med steril saltlösning till nivån på skallytan.
OBS: Synfältet här hjälper till att bedöma om hålet är i rätt läge för musens specifika ålder. Helst bör alveus och den underliggande CA1 uppta större delen av det centrala området. En del av DHC är synlig i caudomedialområdet. LV-öppningen kan detekteras vid den rostrolaterala kanten (figur 3A).
- För in metallröret med glasbotten (se steg 1.1) vertikalt i hålet medan du aspirerar överflödigt vatten som rinner över från rörets sidor tills glasbotten trycker lätt mot alveusen och delvis plattar till den underliggande CA1.
OBS: Detta tryck måste justeras på lämpligt sätt. Om den är för stark kommer CA1 att skadas. Om den är för svag kommer den sfäriska aberrationen på grund av CA1: s krökning att försämra bildupplösningen i djupa strukturer. - Använd tandhartscement och fäst väggen på det införda röret på den omgivande skallen (figur 1C). Se till att hela omkretsen är tätt förseglad och att det inte finns något läckage av luft eller CSF. Vänta i ca 5 minuter tills cementet härdar.
OBS: Om cementet placeras när dess viskositet är låg kan det läcka in i hjärnparenkymet genom gapet mellan röret och skallen och skada hjärnan. Därför bör cementet appliceras efter polymerisationsinitiering, vilket ökar viskositeten och minskar läckage genom gapet. - Tvätta hela plattan, skallen och insidan av röret med steril saltlösning för att ta bort skräp.
4. Tvåfotonmikroskopi omedelbart efter operationen för kvalitetskontroll av operationen
- Ställ musen i huvudhållningsanordningen under objektivlinsen i tvåfotonmikroskopet och på det motoriserade XY-skanningssteget. Använd en värmedyna för termiskt stöd. Övervaka och justera anestesidjupet enligt beskrivningen i steg 2.1, eftersom denna kvalitetskontroll kan ta upp till 30 minuter.
OBS: Objektivobjektivet med vattensänkning med ett arbetsavstånd (WD) längre än 3 mm och en hög numerisk bländare (NA) rekommenderas. En korrigeringskrag på objektivlinsen kan förbättra upplösningen genom att kompensera för brytningsindexmatchningen mellan glaset och biomaterialen. - Fyll utrymmet mellan glaset och objektivlinsen med vatten, var särskilt försiktig för att undvika luftbubblor. Om nödvändigt, expandera området på metallplattan med en plastfilm, som rymmer mer vatten, för att täcka hela objektivets främre lins.
- Slå på en femtosekundpulsad laser med 920 nm våglängd för excitation av de fluorescerande sonderna uttryckta i hjärnan och starta bildinsamlingsprogramvara.
- Justera fokus till CA1 med hjälp av det motoriserade steget och det motoriserade fokussystemet. Placera målstrukturen med vägledning av fluorescensen som emitteras från hjärnparenkymet och det reflekterade ljuset från metallrörets kant under kontinuerlig belysning av den pulserade lasern.
- Mät djupet av hjärnparenkymet som berör glasbotten genom att justera fokus med det motoriserade fokussystemet. Jämför djupet på olika horisontella platser för att bedöma inriktningen av glasbotten och bildplanet.
- Justera mushuvudets vinkel genom att luta huvudhållaren tills glasets botten är inställd på att vara parallell med bildplanet.
- Justera målets korrigeringskrag för att uppnå högsta upplösning på djupet av målstrukturen i CA1.
- Bekräfta att de fluorescerande cellerna i molekylskiktet (ML) på DG:s övre blad på ett djup av 500 μm från glasbotten kan avbildas i hela synfältet.
OBS: Detta steg är viktigt för att bedöma kvaliteten på operationen. Om CA1 är skadad förhindrar fokalt hjärnödem fluorescensdetektering på ett djup av mer än 200 μm från ytan. Endast när det inte finns någon skada på CA1 och krökningen av CA1-skikten är ordentligt tillplattad av den överliggande täckglaset, kan DG-signalerna detekteras omedelbart efter operationen (figur 2A-D). Avsnittet Representativa resultat är ett enkelt sätt att fastställa gränsen mellan CA1 och generaldirektoratet.
5. Postoperativ vård
- Aspirera vattnet inuti röret och täck det med en plasttätning för att förhindra att skräp tränger in.
- Håll musen varm och vänta på återhämtning från anestesin.
- Administrera meloxikam (2 mg/kg) subkutant var 24:e timme så länge musen uppvisar smärtrelaterat beteende.
- Höj den postoperativa musen i enskilda bostäder i flera veckor.
6. In vivo kronisk tvåfotonavbildning av mikroglia med CX3CR1-GFP-möss
- Efter induktion av anestesi, tvätta insidan av metallröret med steril saltlösning för att avlägsna skräp. Se till att hippocampusens vita alveus är synlig genom glaset (figur 3A) och det finns inga komplikationer som postoperativ blödning.
- Ställ musen under tvåfotonmikroskopet enligt steg 4.1 till 4.6.
- Kontrollera kvaliteten och intensiteten hos bilder som erhållits genom tvåfotonexcitation av hippocampus (figur 3B). Se till att bilderna som tas efter minskningen av postoperativt ödem är jämförbara med eller bättre än de som togs på operationsdagen (figur 2A, se steg 4.5).
OBS: Bildförsämring indikerar förekomsten av vävnadsskada inuti hjärnan. - Se till att mikroglia redan har återfått sin förgrenade morfologi (figur 3C).
OBS: Bilddata för microglia indikerar att minst 3-4 veckor krävs för att microglia ska återgå till sitt basala tillstånd. - Utför in vivo-avbildning i alla lager av CA1 för experimentets särskilda syfte.
Representative Results
Med hjälp av denna teknik kan den förgrenade och vilande mikroglia observeras kroniskt inom alla lager av dorsal CA1, inklusive stratum oriens (SO), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) och stratum lacunosum-moleculare (SLM), särskilt 3-4 veckor efter operationen när inflammationen avtar. Om operationen utförs på lämpligt sätt kan avbildning utföras upp till flera månader efter operationen. Detta avsnitt innehåller tre ämnen som är användbara för utvärdering av intravital avbildning. Först tillhandahålls provbilder omedelbart efter operationen och i kronisk fas som referenser för lämpliga kirurgiska och avbildningsprocedurer. För det andra beskrivs den distinkta morfologin hos mikroglia, deras fluorescensintensitet och blodkärlsfördelning i specifika hippocampusskikt för att hjälpa läsarna att uppskatta bilddjupet som sträcker sig från alveus till DG. För det tredje ges ett applikationsexempel som illustrerar samtidig avbildning av neuroner och mikroglia.
De representativa bilderna av mikroglia hos CX3CR1-GFP-möss omedelbart efter operationen visas i figur 2. Om det inte finns någon uppenbar skada på CA1 och CA1-skiktens krökning är ordentligt tillplattad av det överliggande täckglaset, överskrider mikroglias tvåfotonavbildningsdjup hela CA1-skikten och når 500 μm från den kirurgiska ytan, där ML eller granulatcellskiktet (GCL) i DG finns (figur 2A; se steg 4.7 och figur 4E). Microglia är något mindre förgrenade, särskilt i skiktet nära den kirurgiska ytan jämfört med dem i den intakta hippocampus. Ändå uppvisar de ingen framträdande aktivering, vilket tyder på korrekta kirurgiska ingrepp (figur 2B). Å andra sidan kommer ödem i CA1 inducerad av vävnadsskada att begränsa bilddjupet till 200 μm (figur 2C). Vävnadsskada inducerar också onormal mikroglialaktivering, såsom ackumulering av utbuktande processer mot den fria vävnadsytan (figur 2D; jämför med den övre bilden i figur 2B). Detta är tecken på olämplig operation.
De representativa bilderna av mikroglia i kronisk fas mer än 3 veckor efter operationen visas i figur 3. Microglia kan avbildas igen bortom CA1 till de djupare skikten av DG med högre fluorescerande intensitet och upplösning och med mer homogen fördelning (se steg 6.3, figur 3B). Bildkvaliteten är bättre än omedelbart efter operationen (figur 2A). Denna skillnad kan förklaras av minskat ödem och inflammation. Microglia i alla lager har redan återställt sin förgrenade morfologi (figur 3C), som skiljer sig från deras postoperativa utseende (figur 2B). Time-lapse-avbildning av mikroglia i CA1 avslöjar de orörliga cellkropparna och de mycket rörliga processerna för övervakning (Video 1-2). Deras rörliga beteende liknar den tidigare rapporten om mikroglial processdynamik i cortex9.
Det är enkelt att specificera de avbildade hippocampusskikten baserat på fördelningen och djupet av neuronala cellkroppar, med hjälp av möss som uttrycker fluorescerande sonder i hippocampus neuronerna25,26,27. Utan hjälp av positionsinformationen om neuroncellkropparna ger signalerna från fluorescerande mikroglia ensam några ledtrådar till identifieringen av hippocampusskikt (figur 3B). Microglia i alveus har långsträckta cellkroppar och processer som tenderar att sträcka sig längs axonala kanaler (figur 4A). Microglia i andra lager kan särskiljas genom sina runda cellkroppar och processer som strålar ut utan föredragna riktningar. Microglia i SP är bland de tätt packade pyramidala neuronerna och kan särskiljas av den lägre densiteten av mikroglialprocesser. Lagren ovanför och under SP identifieras som SO respektive SR (figur 4B). Det är omöjligt att skilja mellan SR och SLM baserat på mikrogliaegenskaper ensam. Gränsen mellan CA1 och DG känns igen av tjocka blodkärl som löper längs gränsen (figur 4C). Dessa kärl kan kännas igen bättre genom att märka kärl med färgämnen som sulforhodamin 101 (SR101; 5 mM, 4 μL / g kroppsvikt) injicerad intraperitonealt (figur 4D). Fluorescenssignalen från mikroglia sjunker kraftigt i DG jämfört med den överliggande CA1, troligen på grund av skillnaden i brytningsindex för dessa strukturer. Denna skillnad i fluorescensintensitet kan också bidra till att specificera gränsen mellan GD och CA1. Som ett applikationsexempel visas samtidig avbildning av GFP-positiva mikroglia och tdTomat-märkta pyramidala neuroner (figur 4E). I detta experiment fick CX3CR1-GFP-möss en injektion av adenoassocierat virus (AAV) för uttryck av tdTomato i hippocampus pyramidala neuroner. Neuronal märkning hjälper till att förstå de exakta lagerstrukturerna för CA1.
Figur 1: Schematiska ritningar för implantation av observationsfönstret . (A) Tvärsnittsvy av det monterade metallröret med glasbotten. Ett cirkulärt glastäckglas fäster vid ena änden av det cylindriska rostfria röret. (B) Tvärsnittsvy av aluminiumplattan fäst vid skallen. Plattan ska vara parallell med den markerade ytan på skallen för att inte störa objektivlinsen, placerad nära plattan för fokusering. (C) Tvärsnittsvy av det implanterade röret. Glasbotten ska vara nära fäst vid hippocampusens alveus för att försiktigt trycka och platta ytan på CA1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: In vivo-avbildning av mikroglia hos CX3CR1-GFP-möss omedelbart efter operation. (A) Representativ 3D-rekonstruktion från in vivo CA1-avbildning av en CX3CR1-GFP-mus på postoperativ dag (POD) 0 (bredd: 511 μm, höjd: 511 μm, djup: 550 μm). Den fluorescerande mikroglian i DG: s ML på ett djup av 500 μm från glasbotten kan avbildas genom hela CA1. (B) Typiska GFP-fyllda mikroglia erhållna i (A) visas som de maximala intensitetsprojektionerna (MIP) för bildstaplar med 20 μm tjocklek på djup av 100, 300 och 520 μm från glasbotten. Mikroglialmorfologin kan detekteras från den ytliga CA1 till ML i DG, men med uppenbar bildförsämring i DG. Microglia, särskilt i skiktet nära den kirurgiska ytan, är mindre förgrenade men uppvisar ingen uppenbar aktivering. Skalstänger, 50 μm. (C) Representativ 3D-bildrekonstruktion av den kirurgiskt skadade CA1. Data förvärvades från en CX3CR1-GFP-mus på POD 0 (bredd: 399 μm, höjd: 399 μm, djup: 450 μm). Mikrogliafluorescens kan endast detekteras upp till 200 μm djup, i motsats till den oskadade CA1 (A) med fluorescerande mikroglia detekterad på ett djup av 500 μm. (D) Den typiska bilden av onormalt aktiverad mikroglia i (C). MIP för GFP-bildstaplar med 20 μm tjocklek på ett djup av 60 μm visar mikrogliala utbuktningsprocesser som sträcker sig mot den kirurgiskt exponerade vävnadsytan. Den övergripande mikroglialmorfologin skiljer sig från bilden i (B). Skalstång, 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: In vivo-avbildning av mikroglia hos CX3CR1-GFP-möss i kronisk fas . (A) Det implanterade fönstrets representativa utseende på höger dorsal CA1 i den kroniska fasen. Genom glasbotten observeras de vita fibrerna i alveus tydligt utan postoperativ blödning. DHC och LV är delvis synliga i caudomedialområdet respektive i den rostrolaterala kanten. Skalstång, 1 mm. (B) Representativ 3D-rekonstruktion från kronisk CA1-avbildning in vivo av en CX3CR1-GFP-mus på POD 24 (bredd: 511 μm, höjd: 511 μm, djup: 670 μm). Jämfört med bilderna omedelbart efter operationen (figur 2A) visar microglia en mer homogen fördelning och kan observeras tydligare i de djupare skikten av DG på grund av minskningen av ödem och inflammation. (C) Typiska bilder av mikroglia från (B) med helt återställd ramifierad morfologi visas som MIP för GFP-bildstaplar med 20 μm tjocklek på djup av 100, 280 och 500 μm från den kirurgiska ytan. Skalstänger, 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ledtrådar för att identifiera varje lager av hippocampus under in vivo-avbildning och ett applikationsexempel på denna metod. (A) Den typiska bilden av mikroglia i alveus hos CX3CR1-GFP-möss i kronisk fas. Mikrogliacellkroppar och processer som sträcker sig längs axonalkanalerna visas i MIP för GFP-bildstaplar med 10 μm tjocklek på ett djup av 15 μm. Skalstapel, 50 μm. (B) Representativa bilder av mikroglia i SO, SP och SR i kronisk fas visas som MIP för GFP-bildstaplar med 5 μm tjocklek. Den lokala densiteten hos mikrogliaprocesser är lägre i SP än i omgivande SO eller SR på grund av de tätt packade pyramidala neuronerna i SP. Skalstänger, 100 μm. (C) De tjocka blodkärl som löper längs gränsen mellan CA1 och DG kan endast kännas igen av mikroglialfluorescensen. Den genomsnittliga intensitetsprojektionen av kaklade GFP-bildstaplar med 90 μm tjocklek i den kroniska fasen på ett djup av cirka 500 μm visas. GFP-signalens tomrum motsvarar de tjocka kärlen. Skalstång, 500 μm. (D) (Övre) Bilden av samma synfält som C efter intraperitoneal injektion av SR101. Skalstång, 500 μm. (Nedre) 3D-rekonstruktion av kaklatbilderna efter SR101-injektion (bredd: 2,60 mm, höjd: 1,73 mm, djup: 0,69 mm). De tjocka kärlen som löper längs gränsen mellan CA1 och DG kan lätt kännas igen av den intravaskulära SR101-fluorescensen. (E) (vänster) 3D-rekonstruktion av CA1 och DG (bredd: 255 μm, höjd: 255 μm, djup: 730 μm) och (höger) MIP för GFP och tdTomatfluorescens i SP tillverkad av bildstaplar med en tjocklek på 20 μm. 1 vecka före operationen injicerades 1,5 μl av en blandning av AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5,0 x 1012 vg/ml) och AAV1-hSyn-Cre (1,0 x 109 vg/ml) i hippocampus hos en CX3CR1-GFP-mus för att märka neuronerna glest. Avbildning utfördes på POD 0. SP och GCL känns lätt igen av positionen för neuronala cellkroppar. Skalstång, 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Time-lapse-avbildning av SO-mikroglia i kronisk fas. MIP för GFP-bilden staplas med 20 μm tjocklek i time-lapse-avbildningen av SO-mikroglia, animerad så att 28 min spelar på 1 sekund. Skalstång, 50 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Time-lapse-avbildning av SR microglia i kronisk fas. MIP för GFP-bilden staplas med 20 μm tjocklek i time-lapse-avbildningen av SR-mikroglia, animerad så att 28 min spelar på 1 sekund. Skalstång, 50 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Denna metod innehåller utarbetade kirurgiska ingrepp, men den kan ge högupplösta bilder över hela CA1 under en längre period om den förbereds ordentligt. Experiment med flera möss bekräftade att bildkvaliteten i den kroniska postoperativa fasen är bättre än vid akut postoperativ avbildning. Den bättre bildkvaliteten bibehölls i mer än 2 månader. Den vanligaste orsaken till misslyckande är oavsiktlig skada på CA1 under operation, vilket identifieras i den postoperativa kvalitetskontrollen (se steg 4). Detta kan bero på direkt skada genom aspiration, torkning av hjärnan, överdrivet tryck av glaset eller toxicitet från tandcement i det sista steget. En annan orsak till misslyckande är postoperativ blödning, som kan bekräftas genom glasbottenfönstret inom 1 vecka efter operationen (se steg 6.1). Läs protokollet noggrant och vidta alla försiktighetsåtgärder för att undvika sådana problem.
Även med den nuvarande installationen av tvåfotonmikroskop med GaAsP-detektorer i laboratoriet resulterar försöket att avbilda dorsal CA1 genom cortex i en signifikant förlust av upplösning på grund av den icke-försumbara spridningen av ljus. För att erhålla tillräcklig upplösning för att observera rörelsen av mikroglialprocesser eller bildandet av dendritiska spines av neuroner i CA1 är det därför oundvikligt att avlägsna en del av den överliggande cortexen, som i den nuvarande metoden. Det enda alternativa sättet att minska omfattningen av kortikal borttagning samtidigt som hög bildupplösning bibehålls är att bädda in en relälins, till exempel en GRIN-lins (gradient refractive index). I detta tillvägagångssätt har en GRIN-lins placerats inuti ett styrrör implanterat direkt ovanför CA1 för kronisk CA1-avbildning28,29. Styrrörets ytterdiameter var 1,8 mm, vilket är mindre än 3,0 mm av enheten i detta papper, samtidigt som den producerade hög upplösning (NA; 0,82) jämförbar med systemet här (effektiv NA; 0,88). Tillvägagångssättet med en GRIN-lins har dock ett smalt synfält för högupplöst observation och ett kort bilddjup begränsat av GRIN-objektivets WD. Därför är avbildning av alla hippocampusskikt i ett brett synfält med hög upplösning en specifik fördel med metoden i detta papper.
En begränsning av denna procedur är att det partiella avlägsnandet av cortex och inflammation kan ha vissa skadliga effekter på hippocampus. Men eftersom den borttagna cortexen inte har någon direkt inmatning till hippocampus, entorhinal cortex inte skadas och hippocampus i sig inte är direkt skadad, är den övergripande utvärderingen att funktionsnedsättningen av hippocampus inte är signifikant. Flera tidigare studier har bekräftat att hippocampus funktioner, inklusive inlärning och minne, bevaras efter hippocampus fönsterimplantation 25,26,27,30,31,32,33,34. Därför förväntas avbildningsmetoden som beskrivs här troget rapportera hippocampus funktioner efter en tillräcklig postoperativ period.
Framtida riktningar för forskningspersoner baserade på denna bildteknik kan innefatta synaptisk beskärning detekterad genom samtidig avbildning av mikroglia och neuroner5, inlärningsrelaterad mikroglial interaktion med synapser35, mikroglial motilitet reglerad av hippocampus neural aktivitet36 och mikrogliala svar på perifer inflammation eller vävnadsskada7. Denna metod kommer också att bidra till att belysa utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar. Till exempel, i Alzheimers sjukdom (AD), ackumuleras amyloid β och tau-proteiner parallellt med neuronala celldöd och hippocampus atrofi, vilket leder till kognitiv dysfunktion; Microglia har rapporterats vara inblandade i denna process37,38. In vivo kronisk avbildning av mikroglia och neuroner med hjälp av AD-musmodellerna gör det möjligt för oss att övervaka korrelationen mellan mikrogliafunktioner och neuronal patologi i hippocampus hos AD-musmodellerna.
Detta dokument fokuserar på mikroglialavbildning, men samma avbildningsprocedur är tillämplig på de andra neuronala och gliacelltyperna i CA1. Dessutom är protokollet begränsat till avbildning av bedövade möss, men tekniken kan också utvidgas till övervakning av hippocampus mikroglia hos vakna möss. Rörelseartefakterna inducerade av andning, hjärtslag och kroppsrörelser, särskilt i de djupa hippocampusskikten bort från glasfönstret, kan existera i experiment med vakna möss. Därför kan ett lämpligt rörelsekorrigeringssystem krävas för att fånga mikroglial morfologi och dynamik.
Diskussion om protokollet
Det är lämpligt att välja möss av lämplig ålder och genetiska modifieringar för uttryck av fluorescerande sonder med tidsmässig och rumslig specificitet (se steg 1.3). Möss vid 1 månads ålder kan användas för experiment, men möss äldre än 2 månader är lättare att hantera, med sin större kroppsstorlek och motståndskraft mot kirurgisk stress. Dessutom är den yttre kapseln och hippocampusens alveus svårare att separera hos yngre möss. Därför kräver borttagning av den externa kapseln hos unga möss kirurgiska färdigheter (se steg 3.4.3-4). Bedömningen av operationen och efterföljande avbildning blir enklare med möss som uttrycker fluorescerande proteiner reproducerbart och enhetligt i CA1 och DG (se steg 4.7). Därför är det i de första prövningarna av operationen lämpligt att använda transgena möss med glest märkta neuroner, såsom Thy1-YFP eller Thy1-GFP-möss39, eller möss med märkt mikroglia, såsom CX3CR1-GFP-möss24.
För framgångsrik operation är valet av anestesi viktigt (se steg 2.1). Olika typer av anestesi kan orsaka olika grader av intraoperativt hjärnödem, vilket påverkar svårigheten med operationen, den relativa positionen för det implanterade metallröret och omfattningen av hjärnkompression av glasfönstret. Dessa faktorer kan också påverka överlevnaden av hippocampus nervceller efter operation.
I aspirationsprocessen för att exponera hippocampus (se steg 3.4) bör följande punkter noteras för att minimera skadorna på hjärnan och säkerställa framgångsrik avbildning. Tillför ständigt steril saltlösning på vävnadsytan genom att placera ett utlopp vid sidan av kranialfönstret. Förhindra att vävnadsytan utsätts för luft under aspiration. Grundprincipen för vävnadsaspiration är att avlägsna vävnadsytan genom ett vätskeflöde in i sugspetsen. Direkt kontakt med sugspetsen till vävnaden bör undvikas. Justera undertrycket som appliceras på sugröret så att det är minimalt. Aspirera vävnaden steg för steg och bekräfta att blödningen kontrolleras i varje steg. När blödningen är långvarig, vänta tills blödningen slutar spontant. Håll aspirationen från ett kort avstånd från blödningsplatsen med ett konstant flöde av steril saltlösning. Aspirera vävnaden för att skapa ett cylindriskt utrymme med dess storlek som passar till metallröret med glasbotten (se steg 1.1). Välj 23 G nålar för att aspirera tjocka pialkärl eller stora vävnadsfragment och 25 G nålar för att suga små vävnadsskräp.
Disclosures
Ingen av författarna har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka M. Kondo och M. Matsuzaki för att låna oss XLPLN25XSVMP objektivobjektiv. Detta arbete stöddes ekonomiskt från Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) av Grant-in-Aid for JSPS Research Fellow (18J21331 till R.K.) och Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 till S.O.), från Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 och JP17gm5010003 till S.O.) och från Japan Science and Technology Agency av Moonshot R&D (JPMJMS2024 till H.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G blunt needles | NIPRO | 02-166 | Suction tips for aspiration. |
| 25 G blunt needles | NIPRO | 02-167 | Suction tips for aspiration. |
| 3 mm dermal punches (DermaPunch) | Maruho | 213001610 | Tools for craniotomy. |
| 30 G needles | Dentronics | Disposable needle No. 30 | Tools for craniotomy. |
| A femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | MaiTai Deep See | A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength. |
| A two-photon microscope | Nikon | A1R MP+ | Microscope for the CA1 imaging. |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
| AAV1-hSyn-Cre | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
| An objective lens for two-photon imaging | Olympus | XLPLN25XSVMP | 25× objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar |
| Aspirators | Shin-ei Industries | KS-500 | Tools for aspiration. |
| Aluminum plates | Narishige | CP-1 | Plates made of alminum for head fixation. |
| Chemical depilatory cream | YANAGIYA | Cream for hair removal around the surgical site. | |
| Circular glass coverslips | Matsunami Glass | 3φ No.1 | Coverslips bonded to stainless steel tubes. |
| CX3CR1-GFP mice | The Jackson Laboratory | 008451 | Transgenic mice for microglial imaging. |
| Cylindrical stainless steel tubes | MORISHITA | Custom-made | Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm. |
| Dental etching material | Sun Medical | 204610461 | Used to etch the skull bones. |
| Dental resin cement (Super-Bond C&B) | Sun Medical | 204610555 | Dental cement. |
| Dura pickers (Micro Points) | Fine Science Tools | 10063-15 | Tools for dura removal. |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11252-20 | Surgical tools. |
| Forceps | Bio Research Center | PRI13-3374 | Used to disinfect the surgical site. |
| Head holding device | Narishige | MAG-2 | The head holding device of mice with angle adjusters |
| Heating pad | Bio Research Center | BWT-100A and HB-10 | Tools to provide thermal support for the mouse during surgery. |
| Heating pad | ALA Scientific | HEATINGPAD-1 and Hot-1 | Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device. |
| Ketamine (Ketalar) | Daiichi Sankyo Company | S9-001665 | Anesthesia during surgery. |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | Analgesia during surgery. |
| Ophthalmic ointment | Sato Pharmaceutical | Used to prevent eye dryness during surgery. | |
| Povidone-iodine scrub solution | Meiji Seika Pharma | 2612701Q1137 | Used to disinfect the surgical site. |
| Round-tipped miniature knives | Surgistar | 4769 | Surgical tools. |
| Scalpel | MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS | 450-098-67 | Disposable surgical tool. |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | S8 APO | Microscopes for surgery. |
| Sterile saline | Otsuka Pharmaceutical Factory | 3311401A2026 | Washing solution during surgery. |
| Sterile waterproof pad | AS ONE | 8-5945-01 | Surgical platform. |
| Sulforhodamine 101 | Sigma-Aldrich | S7635 | A dye for in vivo vessel imaging. |
| Surgical drape | Medline Industries | MP-0606F6T | Perforated drape for surgery. |
| UV light | Toshiba | GL15 | Used to cure the adhesives. |
| UV-curing optical adhesives | Thorlabs | NOA81 | Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes. |
| Xylazine (Celactal 2%) | Bayer | Anesthesia during surgery. |
References
- Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H.
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
- Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
- Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A.
- Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4 (1), 27 (2011).
- Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 1000527 (2010).
- Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7, 12540 (2016).
- Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), 0088 (2018).
- Favuzzi, E., et al. GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits. Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).
- De Biase, L. M., et al. Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia. Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).
- Ayata, P., et al. Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity. Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).
- Böttcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).
- Masuda, T., et al. Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution. Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Wang, C., et al. Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination. Science. 367 (6478), 688-694 (2020).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
- Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
- Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
- Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
- Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
- Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
- Parkhurst, C., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
- Sarlus, H., Heneka, M. T.
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M.
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
