Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Mikrotensiometer for konfektmikroskopivisualisering av dynamiske grensesnitt

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64110
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

Dette manuskriptet beskriver utformingen og driften av et mikrotensiometer/konfokalt mikroskop for å gjøre samtidige målinger av interfacial spenning og overflatedilatasjonsreologi mens man visualiserer interfacial morfologi. Dette gir sanntidskonstruksjon av struktur-eiendomsrelasjoner av grensesnitt som er viktige i teknologi og fysiologi.

Abstract

Adsorpsjon av overflateaktive molekyler til væskevæskegrensesnitt er allestedsnærværende i naturen. Karakterisering av disse grensesnittene krever måling av overflateaktive adsorpsjonshastigheter, evaluering av likevektsoverflatespenninger som en funksjon av bulk overflateaktiv konsentrasjon, og relatert til hvordan overflatespenningen endres med endringer i det interfaciale området etter likevekt. Samtidig visualisering av grensesnittet ved hjelp av fluorescensavbildning med et høyhastighets konfokalt mikroskop tillater direkte evaluering av strukturfunksjonsrelasjoner. I det kapillære trykkmikrotensiometeret (CPM) festes en halvkuleformet luftboble på slutten av kapillæren i et flytende reservoar på 1 ml volum. Det kapillære trykket over boblegrensesnittet styres via en kommersiell mikrofluid strømningsregulator som muliggjør modellbasert trykk, boblekurvatur eller bobleområdekontroll basert på Laplace-ligningen. Sammenlignet med tidligere teknikker som Langmuir trough og anhengsfall, er måle- og kontrollpresisjons- og responstiden sterkt forbedret; kapillære trykkvariasjoner kan påføres og kontrolleres i millisekunder. Den dynamiske responsen til boblegrensesnittet visualiseres via en annen optisk linse når boblen utvides og trekker seg sammen. Boblekonturen passer til en sirkulær profil for å bestemme boblekurvaturradiusen, R, samt eventuelle avvik fra sirkularitet som vil ugyldiggjøre resultatene. Laplace-ligningen brukes til å bestemme grensesnittets dynamiske overflatespenning. Etter likevekt kan små trykkoscillasjoner pålegges av den datastyrte mikrofluidiske pumpen for å svinge bobleradiusen (frekvenser på 0,001-100 sykluser/min) for å bestemme dilatasjonsmodulus De overordnede dimensjonene til systemet er tilstrekkelig små til at mikrotensiometeret passer under linsen til et høyhastighets konfokalt mikroskop som gjør det mulig å spore fluorescerende merkede kjemiske arter kvantitativt med submikron lateral oppløsning.

Introduction

Luftvannsgrensesnitt dekket av overflateaktive filmer er allestedsnærværende i hverdagen. Overflateaktive vanninjeksjoner brukes til å øke oljeutvinningen fra utarmede felt og brukes som hydrauliske oppsprekkingsløsninger for skifergass og olje. Gass-væske skum og væske-væske emulsjoner er felles for mange industrielle og vitenskapelige prosesser som smøremidler og rengjøringsmidler og er vanlige i mat. Overflateaktive stoffer og proteiner ved grensesnitt stabiliserer antistoffkonformasjoner under emballasje, lagring og administrasjon 1,2,3,4,5, tårefilmstabilitet i øyet 6,7,8, og lungemekanikk 9,10,11,12,13,14, 15.

Studien av overflateaktive agenter eller overflateaktive midler adsorbing til grensesnitt og deres egenskaper har en lang historie med mange forskjellige eksperimentelle teknikker 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . En nylig utvikling er det kapillære trykkmikrotensiometeret (CPM), som tillater undersøkelse av interfaciale egenskaper på svært buede grensesnitt, i mye mindre lengdeskalaer, samtidig som det bruker betydelig færre materialer enn andre vanlige metoder 9,23,24,25. Confocal fluorescence mikroskopi (CFM) kan brukes til å studere morfologien til lipider og proteiner ved luft-vann grensesnitt i CPM22 eller på Langmuir troughs 20,26,27,28,29. Her er en CPM og CFM kombinert for å koble morfologiske fenomener til dynamiske og likevektsinterfaciale egenskaper for å utvikle strukturfunksjonsrelasjoner for biologiske og teknologiske grensesnitt.

Det er mange parametere av betydning i interfaciale overflateaktive systemer som er tilgjengelige for CPM-CFM. I CPM er en luftboble med en diameter på 30-200 μm festet til spissen av et glasskapillært rør. I tidligere versjoner av CPM ble kapillærtrykkforskjellen mellom innsiden og utsiden av boblen kontrollert via en vannsøyle og oscillatorisk sprøytepumpe 9,30 ; Den nye versjonen som er beskrevet her, erstatter disse med en datastyrt mikrofluidpumpe med høyere presisjon. Overflatespenningen (γ) bestemmes via Laplace-ligningen, ΔP = 2γ/R, fra trykkfallet over grensesnittet som er satt av pumpen, ΔP og optisk analyse av krumningsradiusen til boblen, R. Den dynamiske overflatespenningen til grensesnittet kan bestemmes med 10 ms tidsoppløsning etter generering av en ny boble i kontakt med en bulkvæske som inneholder et løselig overflateaktivt middel. Den overflateaktive adsorpsjonsdynamikken kan beskrives av den klassiske Ward-Tordai-ligningen10,31 for å bestemme essensielle egenskaper til overflateaktivaet, inkludert diffusivitet, overflatedekning og forholdet mellom bulkkonsentrasjon og likevektsoverflatespenning. Når en likevektsoverflatespenning er oppnådd, kan det interfaciale området oscilleres for å måle dilatasjonsmodulen, Equation 1, ved å registrere endringene i overflatespenning, indusert av små endringer i bobleoverflateområdet, A32. For mer komplekse grensesnitt som utvikler sine egne indre strukturer som viklet polymerer eller proteiner, er overflatespenningen erstattet av en mer generell overflatespenning 4,33, Equation 2.

Lungestabilitet under pusten kan være direkte knyttet til å opprettholde både en lav overflatespenning og en høy dilatasjonsmodul ved alveolar luftvæskegrensesnitt 9,10. Alle indre lungeflater er foret med en kontinuerlig, mikron-tykk film av epitelforingsvæske for å opprettholde vevshydrering34. Denne epitelforingsvæsken er hovedsakelig vann, med salter og forskjellige andre proteiner, enzymer, sukker og lungeoveraktivt middel. Som det er tilfelle for et buet væskedampgrensesnitt, blir et kapillærtrykk indusert med trykket høyere på innsiden av alveolus (eller boblen). Men hvis overflatespenningen var konstant overalt i lungene, viser Laplace-ligningen, ΔP = 2γ/R, at mindre alveoli ville ha et høyere internt trykk i forhold til større alveoler, noe som tvinger gassinnholdet i den mindre alveolene til å strømme til større alveoler med lavere trykk. Dette er kjent som "Laplace Instability"9,35. Nettoresultatet er at den minste alveolen ville kollapse og bli fylt med væske og bli vanskelig å blåse opp igjen, noe som fikk en del av lungen til å kollapse, og andre deler ville overoppblåses, som begge er typiske symptomer på akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS). Men i en riktig fungerende lunge endres overflatespenningen dynamisk etter hvert som luftepitelvæskegrensesnittet i alveolus interfacialområdet utvides og trekkes sammen under pusten. HvisEquation 3, eller Equation 4, Laplace-trykket reduseres med synkende radius og øker med økende radius for å eliminere Laplace-ustabiliteten, og dermed stabilisere lungen9. Derfor , Equation 5og hvordan det avhenger av frekvens, monolayer morfologi og sammensetning, og alveolarvæskesammensetning kan være avgjørende for lungestabilitet. CPM-CFM har også gitt de første demonstrasjonene av effekten av interfacial krumning på overflateaktiv adsorpsjon25, monolayer morfologi22 og dilatasjonsmodulus9. Det lille volumet (~1 ml) av reservoaret i CPM muliggjør rask innføring, fjerning eller utveksling av væskefasen og minimerer den nødvendige mengden dyre proteiner eller overflateaktive stoffer10.

Kontrast i et CPM-CFM-bilde skyldes distribusjon av små brøkdeler av fluorescerende merkede lipider eller proteiner ved grensesnittet16,27. Todimensjonale overflateaktive monolayers viser ofte lateral faseseparasjon som en funksjon av overflatespenning eller overflatetrykk, Equation 6 π er forskjellen mellom overflatespenningen til et rent væskevæskegrensesnitt, γ0, og et overflateaktivt dekket grensesnitt, γ. π kan tenkes som 2D-trykket forårsaket av samspillet mellom overflateaktive molekyler ved grensesnittet som virker for å senke den rene væskeoverflaten. Ved lavt overflatetrykk er lipidmonolayers i en væskelignende uorganisert tilstand; Dette er kjent som den væskeutvidede (LE) fasen. Etter hvert som overflatetrykket øker og området per lipidmolekyl reduseres, orienterer lipidene seg med hverandre og kan gjennomgå en første ordrefaseovergang til den langtrekkende bestilte væskekondenserte (LC) fase 16,20,27. LE- og LC-fasene kan eksistere sammen ved ulike overflatetrykk og kan visualiseres ettersom fluorescerende merkede lipider er utelukket fra LC-fasen og segregate til LE-fasen. Dermed er LE-fasen lys og LC-fasen er mørk når den er avbildet med CFM16.

Målet med dette manuskriptet er å beskrive trinnene som er nødvendige for å bygge og betjene det kombinerte konfiske mikroskopmikrotensiometeret. Dette vil tillate leseren å utføre adsorpsjonsstudier, måle overflatespenning, reologisk oppførsel og undersøke interfacial morfologi samtidig på et mikronskala luft / vann eller olje / vann grensesnitt. Dette inkluderer en diskusjon om hvordan du trekker, kutter og hydrofoberer de nødvendige kapillærene, instruksjoner for bruk av trykk, krumning og kontrollmodus for overflateareal, og interfacial overføring av uoppløselig overflateaktivt middel til det mikrotensiometer buede grensesnittet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tilberedning av kapillærrør

  1. Plasser kapillæren i en kapillærtrekker og kjør ønsket trekkprogram for å lage to koniske kapillærer med en utvendig diameter (OD) på ~ 1 μm på spissen.
    MERK: OD på kapillæren før trekking må være OD som er angitt for å passe inn i kapillærholderen i mikrotensiometercellen. Kapillærens indre diameter (ID) kan variere, men vil påvirke den kritiske radiusen til kapillæren etter trekking. Et trekkprogram er valgt slik at den resulterende konen i utgangspunktet reduserer kapillær OD og ID raskt, når deretter en radius nær ønsket kapillær OD og ID, og reduserer deretter i diameter langsommere. Dette vil skape en større kapillær lengde som kan scores for å gi en brukbar kapillær på 30-100 μm i ID.
  2. Score spissen av kapillæren på ønsket sted for å få en ID på 30-100 μm og bryte av spissen. Kapillæren vil nå ha en OD og ID for ønsket radius på spissen (figur 1A). Kapillærene kan lagres til trinn 2.
    MERK: Skjærekanten på kapillæren må være en 90° ren pause. Eventuelle feil i kuttkanten vil føre til dårlig festing av boblen til kapillære og dårlige overflateegenskapsmålinger. Koniske kapillærspisser er veldig delikate. De vil bli ødelagt hvis de kommer i kontakt med noe annet enn løsningene (f.eks. hetteglassvegger, luftdyse).

2. Hydrofobisering av kapillærer

  1. Samle trukket glass kapillærene, syrerengjøringsløsningen, plast pinsett, deionisert (DI) vann, hydrofobiseringsløsning (2% silan i etanol), vakuumpumpe og etanoloppløsning. Se Tabell over materialer for mer informasjon.
    FORSIKTIG: Syrerengjøringsløsningen er giftig, forårsaker hud- og øyekorrosjon/irritasjon, oksiderer. Hydrofobiseringsløsning er et hud/øye/åndedrettsmiddel. Bruk vernebriller, labfrakker og hansker og arbeid med løsninger i en avtrekkshette.
  2. Syrerens kapillæren
    MERK: Syrerengjøring av kapillæren fjerner eventuelle organiske rester inne i kapillæren og forbereder glassoverflaten for silaniseringsreaksjonen som gjør kapillærhydrofob.
    1. Ta en kapillær fast nær den brede enden med pinsettene.
    2. Dypp den koniske spissen i syrerengjøringsløsningen mens du fester slangen fra vakuumpumpen til den brede enden av kapillæren. Dette vil suge løsningen inn i kapillæren.
      MERK: En pipettespiss kan festes til enden av kapillærslangen for å gi bedre passform med den kapillære enden.
    3. Stopp når syrerengjøringsløsningen har fylt omtrent halvparten av kapillæren.
      MERK: Etter fjerning av kapillærspissen fra syrerengjøringsløsningen danner løsningen på utsiden av kapillæren ofte en perle nær kapillærspissen. Berør forsiktig kapillæren til halsen på hetteglasset for å fjerne overflødig løsning.
    4. La syrerengjøringsløsningen forbli i kapillærene i minst 30 minutter, og sørg for at væskens støpsel forblir i den koniske enden av kapillæren.
    5. Fjern syrerengjøringsløsningen fra kapillæren ved å holde kapillæren godt sammen med pinsettene og bruke vakuumslangen til å trekke ut væsken fra den store enden av kapillæren.
  3. Skyll kapillæren
    1. Senk den koniske enden av kapillæren ned i DI-vann, og sørg for at den er nedsenket dypt nok til å dekke ethvert eksteriør som var nedsenket i syrerengjøringsløsningen. Mens spissen er nedsenket, bruk vakuumslangen til å trekke DI-vann gjennom kapillæren. Fjern kapillæren fra vannet og fjern det gjenværende vannet med vakuumslangen.
    2. Gjenta trinnet ovenfor minst 4x.
  4. Utfør trinn 2.3 igjen erstatte etanol for DI vann.
  5. Påfør sug kontinuerlig til etanol helt fordampes fra det indre av kapillæren. Kapillæren blir overskyet og kjølig å berøre når etanol begynner å fordampe, men vil fjerne etter 30 til 45 s.
  6. Belegge kapillæren med hydrofobiseringsløsningen
    1. Dypp kort den brede enden av kapillæren i ~ 2% silan i etanoloppløsning. Kapillær virkning vil føre til at beleggløsningen stiger i kapillæren. Fjern kapillæren fra oppløsningen når en plugg på ~1 cm har steget i kapillæren.
    2. Orienter kapillæren slik at den koniske spissen vender nedover, slik at beleggløsningen kan falle med tyngdekraften mot den koniske spissen.
    3. La beleggløsningen forbli i kapillæren i minst 3 minutter.
      MERK: Det må ikke være luftbobler i pluggen til beleggløsningen som er i kontakt med det indre av den koniske spissen. Hvis det er en luftboble, ble kapillærinteriøret sannsynligvis ikke tilstrekkelig tørket i trinn 2.5. For å rette opp dette, gjenta trinn 2.4-2.6 etter behov.
  7. Skyll kapillærene med etanol 1x på samme måte som trinn 2.3.
  8. Sett det hydrofobe belegget på kapillæren
    1. Plasser rene og tørre scintillation hetteglass i en vakuumovn satt til 120 °C. Plasser belagte kapillærer i hetteglassene (ideelt sett en kapillær per hetteglass) med brede ender som hviler på bunnen av hetteglasset. La kapillærene forbli i ovnen i minst 6 timer (over natten foretrukket) for å oppnå permanent binding av det hydrofobe silanlaget til kapillærene. Kapillærene kan lagres til trinn 4.

3. Prøveforberedelse og lagring

  1. Bland og oppbevar overflateaktive og fluorofore løsninger i rene syrevaskede hetteglass for å unngå forurensning.
    MERK: Kommersielt tilgjengelige lipider må være av høyeste renhet og oppbevares mellom bruk ved - 20 °C. Gamle eller forurensede lipider fører ofte til at resultatene blir vanskelige å reprodusere.

4. Sette opp mikrotensiometeret

  1. Sett sammen CPM-cellen som beskrevet i figur 2.
    1. Plasser den store siden av kapillæren øverst i CPM-cellen til den skyver gjennom til undersiden av cellen.
    2. Stram PEEK-pluggen forsiktig for å feste kapillæren, og fest deretter røret fra mikrofluidpumpen til den store siden av kapillæren. Vær forsiktig så du ikke berører den koniske kapillærspissen.
  2. Fest eventuelt reservoarutvekslings- og/eller temperaturkontrollslangene til de respektive innløpene og uttakene på CPM-cellen (figur 2); Ellers kobler du til de ubrukte innløpene og uttakene.
  3. Fest CPM-cellen til det konfokale mikroskopstadiet, og juster den omtrent etter CFM-målet, CPM-kameraet og CPM-lyskilden (figur 3).
  4. Åpne gassstrømmen til den mikrofluidiske pumpen ved anbefalt driftstrykk på pumpen (150 mbar for mikrofluidpumpen som brukes her) og sørg for at strømmen til kapillæren er åpen.
  5. Begynn å kjøre det virtuelle CPM-grensesnittet (Supplemental Coding File 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi) i trykkkontrollmodus med den kapillære trykkoscillasjonsfrekvensen og amplituden satt til null (figur 4-7). Figur 4 viser et skjermbilde av det virtuelle grensesnittet. For DI-vann og en kapillær radius på ~ 35 μm sikrer et trykk på ~ 20 mbar at det ikke kommer vann inn i kapillæren.
  6. Fyll CPM-cellen med vann ved hjelp av en pipette.
  7. Fokuser på kapillærspissen ved hjelp av mikrotensiometerkameraet.
  8. Fokuser på kapillærspissen med CFM. Hvis det er vanskelig å finne kapillæren, kan du bruke CPM-kameraet til å finne CFM-målet. Dette vil bidra til å anslå avstanden mellom CFM-målet og boblen, og oppnå riktig arbeidsavstand.
  9. Etter at annulus (grønn sektorprojeksjon) er sentrert på boblen, juster fokuset manuelt slik at boblekanten kan ses tydelig (figur 4-3).
    MERK: Posisjonen, start- og sluttvinkelen og den indre og ytre radier av annulus kan justeres via menyen under visningsvinduet.
  10. Klikk på Tilbakestill boble, og sørg for at en ny boble dannes (man vil kunne høre den gamle boblen pop, og den nye boblen vil være observerbar fra kontrollpanelets visningsvindu; Figur 4-3). Hvis boblen ikke spretter opp, øker du tilbakestillingstrykket eller øker tilbakestillingsforsinkelsestiden i kategorien Bobletilbakestilling under visningsvinduet. Kontroller om overflatespenningen er rundt 73 mN/m (for saltvanns- eller vann-/luftbobler) (figur 4-9).
  11. Ta ut vannet via direkte-til-celle-sprøyten (figur 3-13), tøm den og fest den på nytt. Prøven er klar for lasting for å kjøre eksperimentet.

5. Adsorpsjonsstudie

  1. Fyll cellen med ønsket prøve ved hjelp av en autoklavert pipette som holder CPM-programvaren i trykkkontrollmodus . Kontroller at den første overflatespenningen er rundt 73 mN/m når et nytt boblegrensesnitt opprettes.
  2. Bestem radiusen til den nylig dannede boblen og skriv inn verdien i midtlinjeområdekontrollen (figur 4-7) og endre kontrolltypen til områdekontroll ved å klikke kategorien Områdekontroll (figur 4-8).
    MERK: Konstant trykkkontroll kan også brukes, men dette fører til at bobleradiusen endres kontinuerlig etter hvert som overflatespenningen til grensesnittet endres. Dette skiftende området kan komplisere analysen av overflateaktive adsorpsjonshastigheter og føre til at boblen popper under studien.
  3. Begynn å spille inn den konfektvideoen.
  4. Klikk på Tilbakestill boble (figur 4-5), og klikk umiddelbart på Samle inn data (figur 4-6). Signallampen på knappen lyser grønt.
  5. Juster dataregistreringshastigheten i henhold til konsentrasjonen av prøven ved å skyve stangen vist i figur 4-6. For langsommere adsorpsjoner, bruk en lavere opptakshastighet. Dette kan justeres midt i en løpetur hvis en høyere opptakshastighet ønskes tidlig, men en lavere hastighet er å foretrekke for lange studier for å redusere filstørrelsen.
  6. Etter slutten av eksperimentet (når et endelig overflatespenningsplatå er nådd), lagrer du filen ved å velge riktig filbane (figur 4-1) og klikke på Lagre-knappen (figur 4-2).
  7. Stopp og lagre innspillingen på CFM også.

6. Oscillasjons-/avslapningsstudie

  1. Fyll cellen med prøven ved hjelp av en autoklavert pipette som holder CPM-programvaren i trykkkontrollmodus . Kontroller at overflatespenningen er rundt 73 mN/m når et nytt boblegrensesnitt opprettes.
  2. Vent til prøven er fullstendig adsorbert til grensesnittet. Dette kan utføres direkte etter en adsorpsjonsstudie i stedet for å starte på nytt med et nytt boblegrensesnitt.
  3. Bestem om svingning vil være en trykkoscillasjon, områdeoscillasjon eller krumningsoscillasjon ved å velge riktig kategori (figur 4-8) og angi ønsket basislinjeverdi, oscillasjon% og oscillasjonsfrekvens (figur 4-7).
    MERK: Sawtooth, firkantede og trekantede bølgeområdeoscillasjoner er også tilgjengelige fra rullegardinmenyen i kategorien Annet område oscillasjon .
  4. Start innspillingen av den konfiskere videoen og klikk på Samle inn data (figur 4-6) på CPM-programvaren.
  5. Start svingningen. Sørg for å registrere minst syv sykluser for best resultat. Velg en datainnsamlingsrate (figur 4-6) for å gi et tilstrekkelig antall datapunkter for hver oscillasjonssyklus.
  6. Hvis andre oscillasjonsamplituder eller frekvenser ønskes, endrer du verdiene under eksperimentet.
  7. Lagre resultatene som i trinn 5.6 og 5.7.

7. Utvekslingsstudie for løsningsmiddel

  1. Fyll cellen med prøven ved hjelp av en autoklavert pipette som holder CPM-programvaren i trykkkontrollmodus. Kontroller at overflatespenningen er rundt 73 mN/m når et nytt boblegrensesnitt opprettes.
    MERK: Adsorpsjons- og/eller oscillasjonsstudier kan utføres før løsningsmiddelutvekslingsstudien.
  2. Koble innløpsrøret med flasken med ønsket bytteløsning (figur 3-11) til den peristaltiske pumpen (figur 3-10).
  3. Start innspillingen av videoen i konfikal programvare og klikk på Samle inn data (figur 4-6) på CPM-programvaren.
  4. Still inn den peristaltiske pumpehastigheten. Dette vil kontrollere væskeutvekslingshastigheten og må velges ut fra kravene til eksperimentet, det vil si hvor raskt løsningsmidlet må byttes ut.
  5. Hvis flere væsker må byttes ut, stopp den peristaltiske pumpen og koble innløpet til en annen utvekslingsløsning.
  6. Når utvekslingen er ferdig (~20 min), lagrer du resultatene som i trinn 5.6 og 5.7.

8. Uoppløselig overflateaktiv adsorpsjon

MERK: Hvis overflateaktivt middel som skal adsorbert ikke er løselig i reservoarvæsken, kan denne metoden brukes til å overføre et monolag fra cellens luft/vann-grensesnitt til bobleoverflaten. Mange bilayerdannende lipider er nesten uoppløselige i saltløsning og absorberer ikke spontant boblen når de suspenderes i reservoarløsningen.

  1. Fyll cellen med prøven ved hjelp av en autoklavert pipette som holder CPM-programvaren i trykkkontrollmodus . Kontroller at overflatespenningen er rundt 73 mN/m når et nytt boblegrensesnitt opprettes.
  2. Deponer en monolayer av uoppløselig overflateaktivt middel på luftvannsgrensesnittet til cellen fra en løsning i en flyktig organisk løsning. Bruk en sprøyte, deponer små dråper ved grensesnittet og la løsningsmidlet fordampe og etterlate lipiden bak som en tynn film.
    FORSIKTIG: Kloroform brukes som løsningsmiddel for fosfolipider som fosfatidylkoliner og fettsyrer. Spredningsløsninger er vanligvis 0,01-0,02 mg lipid per ml av løsningsmidlet. Kloroform er akutt giftig, kan forårsake hud- og øyeirritasjon, og er kreftfremkallende. Bruk passende vernebriller, labfrakk og hansker og lag oppløsningen i en avtrekkshette.
  3. Reduser overflatearealet via senterlinjetrykkkontrollen (figur 4-7) i boblen til den er nesten flat. Dette forhindrer at boblen spretter etter at overflateaktivt middel har adsorbert.
  4. Fjern reservoarvæsken fra cellen via direkte-til-celle-sprøyten til luft/vann-grensesnittet beveger seg forbi spissen av kapillæren. Mens en sprøytepumpe kan brukes, kan dette trinnet oppnås ved å bruke sprøyten manuelt.
  5. Øk reservoarets flytende høyde til startnivå.
    MERK: Etter at spissen er resubmerget, vil boblen være større på grunn av overflateaktivt middel som nå adsorberes på grensesnittet. Monolayeren vil nå være klar for oscillasjons- eller løsningsmiddelutvekslingseksperimenter.

9. Rydd opp

  1. Slå av CFM.
  2. Bytt til trykkreguleringsmodus .
  3. Fjern prøven fra cellen ved hjelp av en pipette. Last cellen med DI-vann og skru opp trykket til ~ 50 mbar for å få bobler til å stadig unnslippe kapillæren og rengjør kapillærspissen. Gjenta denne prosessen 2x.
  4. Lukk sikkerhetsventilen og slå av CPM ved å klikke på den røde knappen øverst til venstre, slå av kontrollpanelet for lys og blått trykk og lukke trykkkilden.
  5. Fjern cellen fra det konfiske mikroskopstadiet. Skyll cellen ut med etanol og DI-vann. Fjern kapillærrøret fra CPM-cellen.

10. Rengjøring av cellen

  1. Demonter cellen. Pensle innerveggen med en tannbørste mens du skyller under DI-vann. Senk delene ned i etanol og soniker det i ~ 30 min.
  2. Skyll alle delene med DI-vann et par ganger. Tørk delene enten ved å blåse dem med nitrogengass eller tørke dem inne i en vakuumovn.

11. Oscillasjonsanalyse

  1. Kjør Dilatational_Rheology_Analysis.m-koden (Supplemental Coding File 2), og velg ønsket fil som er lagret fra det virtuelle CPM-grensesnittet. Eksempeldata er inkludert i tilleggsfilene.
  2. Trykket vs. tidsplottet vises som vist i supplerende figur 1. Venstreklikk punktet der svingningen starter, og venstreklikk på nytt der svingningen slutter. Hvis dataene inneholder flere svingninger, gjentar du denne prosessen for alle svingninger.
    1. Når alle start- og sluttpunktene er venstreklikket, høyreklikker du musen hvor som helst. Som vist i Tilleggs figur 1, kan man for eksempel venstreklikke ved punkt 1, 2, 3 og 4, etterfulgt av et høyreklikk.
      MERK: Koden beregner dilatasjonsmodulus og fasevinkel, og resultatene skrives til et nytt .csv fil på den opprinnelige filplasseringen. Resultatene for eksempeldataene kan ses i koderesultatene gitt i Tilleggskodingsfil 2. MATLAB vil også generere flere grafiske representasjoner av dataene som vist i Supplerende figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En viktig målekilde oppstår fra kapillærene som har feil enten fra skjæreprosessen (figur 5A,B) eller beleggprosessen (figur 5D). Begge typer feil fører til feil i å bestemme bobleformen og størrelsen av det optiske bildeanalysesystemet, noe som fører til unøyaktige overflatespenningsverdier. Det er viktig å nøye undersøke hver nye kapillær etter at den er trukket og belagt under det optiske mikroskopet før kapillæren settes inn i CPM. En miscut kapillær må kastes, men en dårlig belagt kapillær kan syrerenses og re-belagt for å forbedre boblen pinning på slutten av kapillæren (trinn 2 i protokollen). Kapillærene fungerer best hvis endesnittet er perfekt vinkelrett på kapillæren (figur 5C) og boblepinnene direkte på enden av kapillæren (figur 5E). Det hydrofobe belegget på kapillæren blir mindre effektivt ved festing ved bruk, noe som krever at kapillæren rengjøres på nytt og re-belegges.

Representative data for overflateaktiv adsorpsjon vs. tid er presentert i figur 6. Tidligere eksperimentelle teknikker som anheng eller sessile dråper som brukes til å måle overflateaktiv adsorpsjon, hadde ikke en mekanisme for å dynamisk justere kapillærtrykket, da endringen i overflatespenningen fører til at bobleområdet endres under adsorpsjon 30,36,37. Faktisk, for større bobler og dråper, er endringer i boble- eller fallformen (og dermed overflateareal) nødvendig for å bestemme overflatespenningen fra analysen av grensesnittformen, da kapillærtrykket ikke måles uavhengig og kapillærtrykket varierer over fall- eller bobleoverflaten37. Dette kompliserer også analysen av adsorpsjonen fordi som overflateaktive adsorber til grensesnittet reduseres overflatespenningen, og for å tilfredsstille Laplace-ligningen må overflaten av boblen øke, noe som krever ekstra overflateaktivt middel for adsorb for å nå likevekt. I CPM krever et fast kapillærtrykk at den første bobleradiusen må være innenfor et lite område før overflateaktiv adsorpsjon for å forhindre at boblen kommer ut av kapillæren hvis overflatespenningen reduseres for mye. Overflateaktiv adsorpsjonsdynamikk er ofte modellert av den klassiske Ward-Tordai-ligningen31, som beskriver adsorpsjon av overflateaktive molekyler til et rent grensesnitt av konstant interfacial område. Mens Ward-Tordai-ligningen kan endres for å ta hensyn til det skiftende overflatearealet, introduserer dette ytterligere parametere og kompliserer i stor grad analysen38,39.

For å løse disse problemene ble det utviklet en modellbasert tilbakemeldingssløyfe ved hjelp av Laplace-ligningen som holder krumningen (og overflatearealet) av boblekonstanten gjennom adsorpsjonsprosessen ved å justere kapillærtrykket dynamisk. Det er betydelige forskjeller i endringshastigheten av overflatespenningen fordi boblens område ikke stadig øker. Endringene i bobleområdet under adsorpsjon er ikke konstante med tiden, da overflatespenningen endres sakte i begynnelsen, og akselererer deretter raskt før likevekt. En ekstra komplikasjon er at brøkdelsendringen i området avhenger av den første bobleradiusen. En ekstra fordel med konstant bobleradius er at avbildning av grensesnittet forenkles etter hvert som bobleoverflaten forblir fast, noe som forenkler fokuseringen av CFM. Under adsorpsjonsprosessen, som overflateaktive adsorber til grensesnittet (Video 1), øker det fluorescerende signalet fra grensesnittet. Hvis overflateaktivt middel danner overflatedomener, kan disse domenene observeres å danne og vokse22.

Endringene i overflatespenningen under svingninger i området er vist i figur 7. I tidligere versjoner av CPM ble svingninger laget i boblekapillært trykk; Å generere en sinusbølge i kapillærtrykk oversettes imidlertid ikke direkte til en sinusbølge i overflateareal, da de to er relatert via Laplace-ligningen. Ved å dra nytte av en modellbasert tilbakemeldingssløyfe ved hjelp av Laplace-ligningen, opprettes svingninger i området i stedet for i kapillærtrykk, noe som fører til data som er lettere å analysere og samle over et større spekter av amplituder. Som et resultat kan overflatespenningen vs. arealdata samlet inn fra denne metoden brukes til å direkte beregne den interfaciale dilatasjonsmodulusen til det overflateaktive laget: Equation 7 (Figur 8), hvor Equation 8 er systemets totale stress og τstresser ikke-isotropisk deviatorisk stress som ofte er fraværende i enkle overflateaktive løsninger 4,33. Dermed, for et enkelt overflateaktivt system, Equation 9. For grensesnitt der elastiske nettverk kan dannes, for eksempel overflateaktive proteiner, er ekstra spenninger ofte til stede og må derfor redegjøres for når du definerer dilatasjonsmodulus. Video 2 viser en CFM-video av bevegelsen til svarte LC-domener i en kontinuerlig farget LE-fasematrise i fosfolipidmonolayers. De distinkte LC-domenene på grensesnittet omorganiseres til et forgreningsnettverk som dekker grensesnittet når svingninger finner sted på den buede boblen22,40. Kategorien Andre områdeoscillasjoner kan brukes til å lage satooth-, firkantede og trekantede bølger som vist i Tilleggs figur 3, og kategorien Komprimering gir konstant hastighetsområdekomprimering og -utvidelse.

For løsningsmiddelutvekslingsstudier får et overflateaktivt middel først lov til å adsorbere til grensesnittet, og deretter byttes reservoarvæsken ut for å tillate en annen overflateaktiv art å kontakte det grensesnittet. Det er mulig å undersøke endringen i overflatespenningen når det andre overflateaktive middelet konkurrerer med det opprinnelige overflateaktive middelet ved grensesnittet. Overflatedilatasjonsmodulus er ofte en mer følsom sonde av overflateaktiv utveksling sammen med overflatemorfologien via CFM. Figur 9 viser endringen i overflatespenning, overflatedilatasjonsmodulus og overflatemorfologi som en slik løsningsmiddelutveksling finner sted. Selv om spesifikasjonene til en slik utveksling kan variere, kan en endring i en av de tre egenskapene indikere integrasjon av den andre komponenten i monolayer eller solvering av primærkomponenten i bulk. En annen fluorescerende tag kan festes til den sekundære arten for å observere samspillet med grensesnittet fra CFM-bildene.

Figure 1
Figur 1: Kapillær behandling. (A) Bilde som viser poengsummen til kapillæren. Glassscoringen keramikk holdes i en klemme for å holde den stødig. (B) Syrerengjøring av kapillæren. Syrerengjøringsløsningen trekkes inn i kapillæren med vakuumpumpen. (C) Hydrophobization av kapillæren. Silanløsningsplugg holdt inne i kapillæren Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Cellekonstruksjon. (1) Stor aluminiumscelleholder, (2) Fluoroelastomerpakning (fire totalt), (3) glasssklie (to totalt), (4) PEEK-celle og (5) liten aluminiumscelleholder. Når den monteres, plasseres en fluorelastomerpakning på hver side av hver glasssklie. Cellen holdes sammen med skruer og bolter. Det zoomede bildet av PEEK-cellen viser plasseringen av de forskjellige portene: (6) kapillærport, (7) løsningsmiddelbytteinntak, (8) løsningsmiddelbytteuttak og (9,10) temperaturkontrolljakkeinntak og -uttak. En PEEK-plugg kan brukes til å feste slangen eller kapillæren til cellen. Porter som ikke brukes, kan lukkes helt av plugger uten kanaler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk for CPM/CFM, må ikke skaleres. (1) CPM-cellen, (2) kapillærrøret med en boble på spissen, (3) confocal mikroskop mål, (4) mikroskop kamera mål med filter, (5) CPM lyskilde, (6) mikrofluidisk pumpe, (7) sikkerhetsventil, (8) væske utveksling innløp, (9) væske utveksling utløp, (10) peristaltic pumpe, (11) bytte væske reservoar, (12) væske utveksling avfall, (13) direkte til celle, sprøyte, sprøyte, (14) temperaturstyringsjakke innløp og utløp, og (15) temperaturkontrollert reservoar og pumpe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Virtuelt CPM-grensesnitt. (1) filbanen der dataene skal lagres; (2) systemparametere, kommentarer og Lagre-knappen. Alle feltene i dette området lagres i den endelige datafilen. (3) CPM-kamerabildet; (4) innstillinger som kontrollerer bildeanalysen, annulusmåling, bobletilbakestilling og rammer per sekundsporing; (5) bobletilbakestillingsknappen; (6) Samle inn data-knappen, dataregistreringshastighetskontroll og datainnsamlingsindikatorer; (7) kontroller for alle midtlinjeverdier i driftsmodus, oscillasjonsamplitude og oscillasjonsfrekvens; (8) driftsmodusbryter: Å klikke på hver fane endres til den kontrollmodusen. Hver modus viser trykksignalet som sendes til pumpen i "Trykksignal" -grafen, samt noen ekstra kontroller; (9) live overflatespenningsdata; (10) live trykkdata; (11) levende radius av krumningsdata; (12) data om levende overflateareal; og (13) strømførende overflatespenning og overflatedata, som kan brukes til å bestemme fasevinkelen grovt under en oscillasjonsstudie. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Kapillære defekter. (A) og (B) Feilkuttede kapillærer; (C) riktig kuttet kapillær, (D) kapillær med dårlig pinning på grunn av dårlig eller degradert belegg, og (E) riktig festet kapillær. De røde pilene i D og E angir hvor boblene er festet. For best resultat vil boblen feste seg på kapillærspissen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Adsorpsjonsstudiemikrotensiometerresultater for både konstant trykk (oransje) og konstant areal (blå) adsorpsjoner. Bobleoverflatearealet for det konstante områdets adsorpsjon øker betydelig gjennom hele studien og fører til at adsorpsjonen tar lengre tid å nå samme overflatespenning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Typisk overflatekontrolloscillasjon. (A) Trykk, (B) krumning og (C) overflateområdedata. Overflatearealdataene er en bihuleoid mens trykk- og krumningsdataene ikke er det, noe som fremgår av at midtlinjeverdiene ikke er midtpunktet i svingningen. Det matematiske forholdet mellom de tre verdiene betyr at bare én kan være en sann bihule. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Prøve reologiske resultater etter analyse. Dilatasjonsmodulus av Lyso PC (1-palmitoyl-2-hydroksy-sn-glysero-3-fosfocholine) som en funksjon av frekvens for økende konsentrasjoner av Lyso PC for ~ 45 μm radiusbobler. Konsentrasjoner >0,1 mM Lyso PC som følger med betennelse reduserer dilatasjonsmodulus over området normal ventilasjon / pustehastighet (gul) for å gjøre 2ε-γ < 0, som er crossover-verdien for å indusere Laplace ustabilitet (prikket rød linje). Lave konsentrasjoner av Lyso PC ≤0,01 mM, som kan oppstå i normale lunger, induserer ikke ustabilitet. Ved frekvenser >10 rad/ sek er alle Lyso PC-konsentrasjoner over crossover, og ville ikke være utsatt for Laplace ustabilitet. Heldekkende røde linjer passer til teorien til dataene. Figur gjengitt fra referanse9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: CFM- og CPM-resultater for en løsningsmiddelutvekslingsstudie for lungeoveraktivt middel utvekslet med DI-vann og deretter Lyso PC. (A) viser hvordan overflatespenning og overflatedilatasjonsmodulus endres gjennom hele studien. Grafen er delt inn i fire regioner: når lungeoveraktivt middel adsorbert til grensesnittet (blå), når LS utveksles med DI-vann (grønn), når utvekslingsløsningen byttes til en Lyso PC-løsning (rød), og når cellen er fylt med Lyso PC-løsningen (oransje). Egenskapene kan sees å endre seg gjennom de ulike utvekslingene som indikerer at grensesnittet endres. (B) viser et konfokalt bilde av lungens overflateaktive adsorbert til grensesnittet før utveksling, og (C) viser samme overflate etter at utvekslingen med Lyso PC-løsningen er fullført. I begge tilfeller angir den hvite stiplede sirkelen den indre kanten av kapillæren. Strukturen til domenene på monolayeren endres drastisk etter løsningsmiddelutvekslingen, noe som bekrefter CPM-resultatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Konfavsk video av konstant trykk adsorpsjon studie for lunge overflateaktivt middel. Den falske fargen viser avstanden i z-retningen med fargelinjen på venstre side av videoen, med lilla som indikerer boblen nær kapillæren og grønn er toppen av boblen. Grensesnittet er i utgangspunktet svakt opplyst, da bare litt av det fluorescerende overflateaktive middelet er adsorbert. Etter hvert som flere og flere overflateaktive adsorber vokser, begynner boblen å vokse etter hvert som fargen skifter mer til grønt og grensesnittet blir befolket av svarte LC-domener som kan bevege seg over grensesnittet. Aggregater av overflateaktivt middel i løsningen kan sees flytende i løsningen som lyse amorfe former og flere bosetter seg på boblegrensesnittet, oppløses og deponerer surfaktanten på grensesnittet. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: Konfavsk video av oscillasjonsstudie for lungeoveraktivt middel. Den falske fargen viser avstanden i z-retningen med fargelinjen på venstre side av videoen. Overflaten blir utsatt for flere forskjellige svingningsfrekvenser, og de mørke LC-domenene på grensesnittet kan sees å endre seg gjennom svingningene. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende figur 1: Eksempel på et mellomliggende trinn i koden for å bestemme dilatasjonsreologien. Når dette skjermbildet vises, bør brukeren venstreklikke på venstre kant av svingningen for å analysere, og deretter venstreklikke på høyre kant. Flere svingninger kan analyseres slik at brukeren kan venstreklikke på 1, 2, 3 og 4, og deretter høyreklikke for å analysere disse to svingningene. Svingningene som vises er av forskjellige amplituder og frekvenser. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Eksempel på de grafiske resultatene produsert av dilatasjonsrimologikoden. Dette viser anfallene til sinusoider til svingningene i trykk, radius, overflateareal og overflatespenning samt Fouriertransformasjonen av hver svingning. Ideelt sett bør den andre harmoniske i Fourier-transformasjonen være mindre enn 10% av den første harmoniske for overflatearealet og overflatespenningen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Alternative driftsmodi. (A) Sinusbølge, (B) Satooth-bølge, (C) Firkantet bølge, (D) Trekantet bølge, (E) Konstant hastighetsutvidelse og (F) Konstant hastighetskomprimering. Kompresjons- og ekspansivmodusene gjør det mulig å opprette langmuir-type isotermer for uoppløselige overflateaktive stoffer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra kodingsfil 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra kodefil 2: Dilatational_Rheology_Analysis.m. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den kombinerte CPM/CFM er et kraftig verktøy for å undersøke interfacial dynamikk, likevekt og morfologi. Denne protokollen beskriver trinnene som er nødvendige for å hente data med CPM/CFM.

Figur 2 viser celledesignet med kanaler for kapillær-, løsningsmiddel- og varmevekslingen som er angitt. Innløpet for løsningsmiddelutveksling skal være på bunnen av cellen mens utløpet skal være øverst, slik at cellen ikke kan overløpe under utvekslingen. I praksis kan innløps- og utløpsmengden være litt forskjellig for den samme peristaltiske pumpen. Et vanlig problem med denne celledesignen er å lekke fra cellen. Dette skyldes oftest en dårlig forbindelse mellom cellen og en av tilkoblingene, men hvis alle tilkoblinger er tørre og ikke lekker, kan dette skyldes en sprekk i glasssklie i cellen på grunn av overstramming av boltene rundt cellen.

Figur 3 viser forbindelsene mellom de ulike pumpene og cellen, samt justeringen av cellen med CFM- og CPM-målene. CPM-kameraet (4) brukes til å avbilde bobleformen under drift. CPM-kameraet må utstyres med et optisk filter som hindrer CFM spennende laserlys i å komme inn i CPM-kameraet. Ellers gjør CFM-laseren bilder i CPM-kameraet svært støyende og vanskelig å få plass til ved hjelp av bildeanalyse. En sikkerhetsventil kobler sammen kapillæren og den mikrofluidiske pumpen (7) og gjør det mulig å gjøre endringer i pumpen og lufttrykkskilden, uten risiko for tilbakestrømning fra cellen som når pumpen. En annen ventil (13) gir tilgang til en sprøyte for å tillate direkte injeksjon av væske inn og ut av reservoaret. Væske må kanskje tilsettes reservoaret i tilfelle lekkasje og må kanskje fjernes for trinn 8 i protokollen (uoppløselig overflateaktiv adsorpsjon) eller for å fjerne bobler som er renset fra kapillæren hvis de har festet seg til det konfokale målet.

Under hvert eksperiment må flere viktige trinn utføres nøye. De fleste problemene som oppstår når instrumentet kjører, involverer kapillæren selv. Som sådan kan forsiktig kutting og belegg minimere vanskeligheter. Kutting av kapillæren til ønsket diameter er en vanskelig og lav avkastningsprosess. Enhver brikke eller ujevnhet i spissen av kapillæren vil føre til dårlige avlesninger av bobleradiusen. I tillegg, hvis det hydrofobe belegget ikke påføres riktig, eller hvis det forringes over tid og bruk, vil boblen ikke festes riktig på spissen av kapillæren. Dette kan indikeres av boblen som ser ut til å være festet inne i kapillæren eller glir langs innsiden av kapillæren under en oscillatorisk studie. En kapillær som er kuttet godt, men ikke fester riktig, kan gjenvinnes og hydrofobisk behandles.

Et annet viktig trinn og mulig feilkilde er rengjøring av cellereservoaret, slangen og kapillæren mellom forskjellige materialer eller forskjellige konsentrasjoner av samme materiale. Det er mange små sprekker i reservoaret, og overflateaktivt middel kan adsorbere og endre målinger tatt på senere tidspunkter hvis de ikke rengjøres riktig. Fullstendig demontering og bløtlegging av cellen er ofte nødvendig for å sikre fjerning av overflødig overflateaktivt materiale. Det er bedre å starte med å bruke den laveste konsentrasjonen hvis en rekke konsentrasjoner av samme overflateaktive middel skal studeres.

Til tider kan det være vanskelig å stille opp kapillærrøret med det konfiske målet. Mikrotensiometerkameraet kan brukes til å justere det konfokale målet, men for en stor arbeidsavstand fra CFM-målet kan dette ikke være nyttig. Hvis det konfokale mikroskopet er fokusert utover spissen av kapillæren, kan det kapillære tverrsnittet, en region uten fluorescerende materiale, også brukes til å orientere målet. Hvis kapillærboblen ikke løser ut, kan det være et problem med trykket som leveres til kapillæren (som skal være 150 mbar under normal drift). Dette kan kontrolleres ved å gå inn i trykkkontrollmodus og sette trykket til en høy verdi. Hvis trykket ikke når det innstilte trykket, er det sannsynligvis en lekkasje i slangen fra mikrofluidpumpen, eller pumpen mottar ikke tilstrekkelig gasstrykk. Som med mange studier som involverer overflatevitenskap, er det viktig å sikre at ingen forurensende materialer blir introdusert til løsningene på noe tidspunkt. Hvis målinger ikke er som forventet (overflatespenning som starter for lavt eller synker for raskt), er det også et godt tidlig skritt i feilsøkingen å lage en ny prøve, eller bruke en godt studert prøve eller ren væske.

Flere modifikasjoner kan gjøres på apparatet for å oppnå andre eksperimentelle mål. Olje eller vann kan tilsettes kapillæren, noe som gjør det mulig å studere olje-vann i stedet for luft-vann-grensesnitt39. Dette øker risikoen for tilbakestrømning i pumpen, slik at det må utvises ekstra forsiktighet, noe som potensielt til og med kan være nødvendig å legge til en oljefelle i slangen mellom pumpen og kapillæren.

Det er flere begrensninger i CPM/CFM. CPM har et begrenset arbeidsområde av kapillær størrelse, 20-300 μm for kapillær OD for pumpen og optikk i systemet. Selv om det er mulig å legge uoppløselig overflateaktivt middel til grensesnittet ved hjelp av løsningsmiddelutveksling41 eller metoden som er beskrevet her, kan overflatekonsentrasjonen bare utledes fra å gjøre overflatespenning vs. område isotermer og sammenligne med de som er oppnådd fra en Langmuir trough. CFM kan bare oppdage fluorescerende materialer, slik at ikke-fluorescerende eller ikke-fluorescerende merkede materialer ikke kan visualiseres. Mange overflateaktive stoffer er små molekyler, og merking av dem kan potensielt endre egenskapene sine, selv om dette bør være mindre problematisk for større overflateaktive molekyler som proteiner eller polymerer26,27.

Denne metoden har flere viktige fordeler i forhold til tidligere CPM- og CFM-analyser av overflateaktive grensesnitt. Det viktigste er at hybridinstrumentet muliggjør visualisering av grensesnittet mens ulike dynamiske og likevektsoverflateegenskaper måles. Endringer i grensesnittets morfologi kan være direkte knyttet til interfacial dynamikk og reologiske egenskaper. Tidligere CFM av overflateaktive grensesnitt ble gjort ved hjelp av en flat Langmuir gjennom 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47, mens metoden beskrevet her kan utføres på svært buede grensesnitt22 . I tillegg kan hele grensesnittet avbildes samtidig, og viser en sanntids sporbar endring av spesifikke domener, mens overflatestrømmer på Langmuir-troughen førte til at domener strømmet inn og ut av det konfokale visuelle vinduet. Overflatekompresjoner på dette apparatet er også isotrope, mens barrierene på Langmuir-troughs har spesielle kompresjonsretninger. CPM tillater mye raskere områdesvingninger enn det som ville være mulig på et Langmuir-trough.

Den nye krumningen og områdebasert kontroll i denne studien har store fordeler i forhold til tidligere versjoner av CPM30. Vanligvis ble boblestørrelsen kontrollert ved å angi et fast kapillærtrykk; For dilatasjonsmodulimålinger ble kapillærtrykket oscillert. Når kapillærtrykket holdes konstant, som overflateaktive adsorber til grensesnittet, reduseres boblens overflatespenning. For å tilfredsstille Laplace-ligningen, ΔP = 2γ/R, må krumningsradiusen reduseres etter hvert som overflatespenningen reduseres. For den halvkuleformede boblen i CPM øker reduksjonen av bobleradiusen for krumning bobleområdet 9,48:

Equation 10

der Rcer kapillærradiusen og R er bobleradiusen til krumningen. Den skiftende radiusen til boblen endrer grensesnittets område under adsorpsjon, noe som kompliserer analysen av adsorpsjonen ved hjelp av Ward-Tordai-ligningene 10,38 I tillegg, hvis overflatespenningen til boblen senkes nok, vil bobleradiusen bli mindre enn kapillærradiusen og boblen vil bli kastet ut. Tilbakemeldingssløyfen i denne nyere CPM / CFM holder bobleområdet konstant gjennom adsorpsjon, noe som betyr at den opprinnelige Ward-Tordai-ligningen kan brukes, det er ingen risiko for bobleutkast, og adsorpsjon skjer raskere ettersom overflaten ikke øker i området. For oscillatoriske studier produserer ikke en sinusbølge i trykket en sinusbølge i overflatearealet48. Tidligere CPM-metoder var avhengige av å holde svingningene små for at områdeendringen forårsaket av den trykkdrevne svingningen skulle tilnærme seg en sinusbølge48. Den beskrevne metoden styrer direkte bobleområdet og kan brukes til å skape sanne sinusbølgeoscillasjoner i det interfaciale området. Det er mulig å direkte relatere stresset (endring i overflatespenning) til den interfaciale stammen (endring i overflateareal) for å beregne dilatasjonsmodulen.

For å hjelpe til med implementeringen av denne protokollen, er en kort beskrivelse av koden som kontrollerer mikrotensiometeret beskrevet her. Koden består av tre segmenter i en løkke: en som utsteder kommandoer til den mikrofluidiske pumpen, en som styrer boblens tilbakestillingsmekanisme, og en som måler boblens radius og lagrer de beregnede verdiene. Pumpekontrolleren har tre hoveddriftsmoduser: trykkkontroll, krumningskontroll og områdekontroll. I trykkkontroll legger brukeren direkte inn et settpunkt for trykket som er opprettet av pumpen. Denne modusen er viktig fordi den ikke krever en tilbakemeldingssløyfe, og som sådan er den mest stabile av modusene. Krumningskontrollen bruker det tidligere målte overflatetrykket og Laplace-ligningen til å beregne hvilket trykk som kreves for å skape et grensesnitt av en gitt krumning. Overflatekontrollmodusen bygger på dette ved å beregne hvilken krumning som kreves for å skape et gitt overflateareal basert på geometrien til den sfæriske hetten, som også krever en presis måling av kapillærradiusen. Disse to modusene er spesielt nyttige for adsorpsjons- og oscillasjonsstudier, men krever en jevn strøm av konsistente overflatetrykkdata. Som sådan kan det hende at fôret til disse to kontrollerne må glattes ut fra rådataene for bedre funksjon. Når løsningen ikke er klar nok, ofte på grunn av en svært uklar prøve, vil denne modusen ikke fungere ordentlig, da det ikke er mulig å få et godt bilde av boblegrensesnittet. Kontrollene for svingningene er også inkludert i denne delen av koden. Det midterste segmentet av koden gjør at boblen kan fjernes fra kapillæren. Her er kapillærens innstilte trykk satt til en høy verdi og holdes der i en bestemt tid slik at boblen kan poppe og et nytt grensesnitt kan opprettes. Den siste delen av koden bruker programvare for synsanskaffelse til å spore kanten av boblen og måle radiusen. Denne radiusen brukes deretter med Laplace-ligningen for å beregne overflatespenningen, som deretter mates til den første delen av løkken.

Denne hybrid CPM / CFM-teknikken har vist seg å være svært gunstig for våre studier av modell- og kliniske lungeoveraktive stoffer ved luftvannsgrensesnitt. Bobledimensjonene omtrentlig de i alveolene i den menneskelige lungen og effekten av interfacial krumning på morfologien og dynamikken i lungeoveraktive monolayers kan observeres 9,10,22. Hybridinstrumentet vil også være viktig for studier av andre overflateaktive materialer som er allestedsnærværende med bruksområder som spenner fra petrokjemiske til husholdningskjemikalier, fra tårefilmer til antistoffstabilisering. Den kombinerte CPM/CFM gjør det mulig for oss å granske dynamiske interfaciale egenskaper på skalaen av faseseparerte domener og visualisere morfologiene på overflaten etter hvert som eksterne forhold endres. Denne metoden er spesielt nyttig i applikasjoner der dyre materialer krever bruk av minimal størrelsesprøver. Samtidig observasjon av interfacial dynamikk og monolayer morfologi er nesten umulig med noen annen teknikk, noe som gjør det bredt anvendelig for feltet interfacial vitenskap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Alle de konfokale mikroskopibildene ble oppnådd ved hjelp av Nikon A1RHD Multiphoton oppreist konfokalt mikroskop. Vi anerkjenner veiledning og hjelp fra støttepersonellet, spesielt Guillermo Marques, ved University Imaging Center ved University of Minnesota. Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant HL51177. SI ble støttet av Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 O.D. Tygon tubing Fischer Scientific Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope Nikon Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix Alconox 2510 Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter Sutter Instruments
Chloroform Sigma-Aldrich 650471 HPLC Plus
Curosurf Chiesi  Lung Surfactant
Di Water 18.5 MΩ - cm
Ethanol any 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator Dolan-Jenner Industries Inc. 281900100 Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module Fluigent LU-FEZ-0069 Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs Fluigent Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter Norgren F07-100-A3TG Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator Norgren 10R0400R Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary Sutter Instruments B150-86-10 Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide any 75 mm x 25 mm
Glass Syringe Hamilton 84878 25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent Sigma-Aldrich 667420 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant Avanti 850355C-200mg 16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software National Instruments 2017
Longpass Filter ThorLabs FEL0650 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC Avanti 855675P 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head Masterflex HV-77916-20 Peristaltic Pump
MATLAB Mathworks R2019
Micropipette Puller P-1000 Sutter Instruments Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective Nikon Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module National Instruments Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings IDEX F-120x 10-32 Coned Ports
PEEK plug IDEX P-551 10-31 Coned Ports
pippette tips Eppendorf 22492225 100 μL - 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps Thermo Scientific 6320-0010
Plastic Syringe Fischer Scientific 14-955-459 10 mL
Plumbing parts Fischer Scientific 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL Eppendorf 3123000063 Micro pipetter
Sulfuric Acid any Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm Nikon Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt Thermo Fischer Scientific 1395MP Fluorophore
Vaccum Pump Gast DOA-P704-AA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Interfacial rheology of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface: Comparison of shear and dilatation deformation. Journal of Physical Chemistry B. 108 (12), 3835-3844 (2004).
  2. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Shear and dilatational relaxation mechanisms of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface. Langmuir. 20 (23), 10159-10167 (2004).
  3. Kannan, A., Shieh, I. C., Fuller, G. G. Linking aggregation and interfacial properties in monoclonal antibody-surfactant formulations. Journal of Colloid and Interface Science. 550, 128-138 (2019).
  4. Kannan, A., Shieh, I. C., Leiske, D. L., Fuller, G. G. Monoclonal antibody interfaces: Dilatation mechanics and bubble coalescence. Langmuir. 34 (2), 630-638 (2018).
  5. Li, J. J., et al. Interfacial stress in the development of biologics: Fundamental understanding, current practice, and future perspective. The AAPS Journal. 21 (3), 44 (2019).
  6. Bhamla, M. S., Giacomin, C. E., Balemans, C., Fuller, G. G. Influence of interfacial rheology on drainage from curved surfaces. Soft Matter. 10 (36), 6917-6925 (2014).
  7. Fuller, G. G., Vermant, J. Complex fluid-fluid interfaces: Rheology and structure. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 3, 519-543 (2012).
  8. Rosenfeld, L., et al. Structural and rheological properties of meibomian lipid. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 2720-2732 (2013).
  9. Barman, S., Davidson, M. L., Walker, L. M., Anna, S. L., Zasadzinski, J. A. Inflammation product effects on dilatational mechanics can trigger the Laplace instability and acute respiratory distress syndrome. Soft Matter. 16 (29), 6890-6901 (2020).
  10. Barman, S., et al. Recent Advances in Rheology: Theory, Biorheology, Suspension and Interfacial Rheology. Ramachadran, A., et al. , chap. 7 (2022).
  11. Alonso, C., Zasadzinski, J. A. A brief review of the relationship between monolayer viscosity, phase behavior, surface pressure and temperature using a simple monolayer viscometer. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (44), 22185-22191 (2006).
  12. Alonso, C., et al. More than a monolayer: Relating lung surfactant structure and mechanics to composition. Biophysical Journal. 87 (6), 4188-4202 (2004).
  13. Alonso, C., Bringezu, F., Brezesinski, G., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Modifying calf lung surfactant by hexadecanol. Langmuir. 21 (3), 1028-1035 (2005).
  14. Alonso, C., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: Protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophysical Journal. 89 (1), 266-273 (2005).
  15. Zasadzinski, J. A., et al. Inhibition of pulmonary surfactant adsorption by serum and the mechanisms of reversal by hydrophilic polymers: Theory. Biophysical Journal. 89 (3), 1621-1629 (2005).
  16. McConnell, H. M. Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water-interface. Annual Reviews of Physical Chemistry. 42, 171-195 (1991).
  17. McConnell, H. M., Moy, V. T. Shapes of finite two-dimensional lipid domains. Journal of Physical Chemistry. 92 (15), 4520-4525 (1988).
  18. Zasadzinski, J. A., Stenger, P., Shieh, I., Dhar, P. Overcoming rapid inactivation of lung surfactant: analogies between competitive adsorption and colloid stability. Biochemica et Biophysica Acta. 1798 (4), 801-828 (2010).
  19. Zasadzinski, J. A., et al. Surfactant Progress. Nag, K. , New York. (2008).
  20. Valtierrez-Gaytan, C., et al. Spontaneous evolution of equilibrium morphology in phospholipid-cholesterol monolayers. Science Advances. 8 (14), (2022).
  21. Williams, I., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial rheology and direct imaging reveal domain-templated network formation in phospholipid monolayers penetrated by fibrinogen. Soft Matter. 15 (44), 9076-9084 (2019).
  22. Sachan, A. K., Zasadzinski, J. A. Interfacial curvature effects on the monolayer morphology and dynamics of a clinical lung surfactant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 134-143 (2018).
  23. Alvarez, N. J., Anna, S. L., Saigal, T., Tilton, R. D., Walker, L. M. Intefacial dynamics and rheology of polymer grafter nanoparticles at air-water and xylene-water interfaces. Langmuir. 28 (21), 8052-8063 (2012).
  24. Alvarez, N. J., Vogus, D. R., Walker, L. M., Anna, S. L. Using bulk convection in a microtensiometer to approach kinetic-limited surfactant dynamics at fluid-fluid interfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 372 (1), 183-191 (2012).
  25. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. Diffusion-limited adsorption to a spherical geometry: The impact of curvature and competitive time scales. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82, 011604 (2010).
  26. Shieh, I., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Visualizing the analogy between competitive adsorption and colloid stability to restore lung surfactant function. Biophysical Journal. 102 (4), 777-786 (2012).
  27. Shieh, I., Zasadzinski, J. A. Visualizing monolayers with a water-soluble fluorophore to quantify adsorption, desorption and the double-layer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 826-835 (2015).
  28. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Takamoto, D. Y., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Coexistence of buckled and flat monolayers. Physical Review Letters. 81, 1650-1653 (1998).
  29. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Fluorescence, polarized fluorescence, and Brewster angle microscopy of palmitic acid and lung surfactant protein B monolayers. Biophysical Journal. 72 (6), 2783-2804 (1997).
  30. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. A microtensiometer to probe the effect of radius of curvature on surfactant transport to a spherical interface. Langmuir. 26 (16), 13310-13319 (2010).
  31. Ward, A. F. H., Tordai, L. Time dependents of boundary tensions of solutions. 1. The role of diffusion in time-effects. Journal of Chemical Physics. 14, 453-461 (1946).
  32. Lucassen, J., Vanden Tempel, M. Dynamic measurements of dilatational properties of a liquid interface. Chemical Engineering Science. 27 (6), 1283-1291 (1972).
  33. Lin, G. L., et al. Interfacial dilatational deformation accelerates particle formation in monoclonal antibody solutions. Soft Matter. 12 (14), 3293-3302 (2016).
  34. Bastacky, J., et al. Alveolar lining layer is thin and continuous: low temperature scanning electron microscopy of rat lung. Journal of Applied Physiology. 79 (5), 1615-1628 (1995).
  35. Adamson, A. W., Gast, A. P. Physical Chemistry of Surfaces, Sixth ed. , Wiley-Interscience. New York. 784 (1997).
  36. del Rio, O. I., Kwok, D. Y., Wu, R., Alvarez, J. M., Neumann, A. W. Contact angle measurements by axisymmetric drop shape analysis and an automated polynomial fit program. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects. 143 (2-3), 197-210 (1998).
  37. Kanthe, A., et al. No ordinary proteins: Adsorption and molecular orientation of monoclonal antibodies. Science Advances. 7 (5), 14 (2021).
  38. Manikantan, H., Squires, T. M. Surfactant dynamics: hidden variables controlling fluid flows. Journal of Fluid Mechanics. 892, 115 (2020).
  39. Narayan, S., et al. Dilatational rheology of water-in-diesel fuel interfaces: effect of surfactant concentration and bulk-to-interface exchange. Soft Matter. 17 (18), 4751-4765 (2021).
  40. Meng, G. N., Paulose, J., Nelson, D. R., Manoharan, V. N. Elastic instability of a crystal growing on a curved surface. Science. 343 (6171), 634-637 (2014).
  41. Kotula, A. P., Anna, S. L. Insoluble layer deposition and dilatational rheology at a microscale spherical cap interface. Soft Matter. 12 (33), 7038-7055 (2016).
  42. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Phase and morphology changes in lipid monolayers induced by SP-B protein and its amino-terminal peptide. Science. 273 (5279), 1196-1199 (1996).
  43. Pocivavsek, L., et al. Stress and fold localization in thin elastic membranes. Science. 320 (5878), 912-916 (2008).
  44. Pocivavsek, L., et al. Lateral stress relaxation and collapse in lipid monolayers. Soft Matter. 4 (10), 2019-2029 (2008).
  45. Kim, K., Choi, S. Q., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Cholesterol nanodomains: their effect on monolayer morphology and dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 3054-3060 (2013).
  46. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  47. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Nonlinear chiral rheology of phospholipid monolayers. Soft Matter. 14 (13), 2476-2483 (2018).
  48. Kotula, A. P., Anna, S. L. Regular perturbation analysis of small amplitude oscillatory dilatation of an interface in a capillary pressure tensiometer. Journal of Rheology. 59, 85-117 (2015).

Tags

Engineering Utgave 187 kapillærtrykkmikrotensiometer interfacial reologi lungeoveraktivt middel konfokal mikroskopi overflatemorfologi mikrofluidikk
Mikrotensiometer for konfektmikroskopivisualisering av dynamiske grensesnitt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, … More

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, C., Huang, B., Davidson, M. L., Zasadzinski, J. A. Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces. J. Vis. Exp. (187), e64110, doi:10.3791/64110 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter