Summary
本プロトコルは、ゲノミクス、プロテオミクス、マイクロバイオーム、または他のアッセイにおける入力のために、成虫の カエノラブディティス・エレガンス 線虫から腸を手作業で単離するための手順を記載している。
Abstract
わずか20個の細胞で構成される カエノラブディティスエレガンス 腸は、消化、代謝、老化、免疫、環境反応など、多くの生命維持機能のつながりです。 C.エレガンスの 宿主とその環境との間の重要な相互作用は、腸内細菌叢が集中する腸内に収束します。したがって、腸組織を他のワームから分離する能力は、腸特異的プロセスを評価するために必要です。このプロトコルは、成人 のC.エレガンスの 腸を手で解剖する方法を説明しています。この手順は、容易さまたはトレーニングの目的で蛍光標識された株で実行できます。技術が完成すると、腸はあらゆる遺伝子型のラベルのないワームから収集できます。このマイクロダイセクションアプローチは、宿主の腸組織と腸内細菌叢を同時に捕捉することを可能にし、多くのマイクロバイオーム研究に利益をもたらします。そのため、このプロトコルによって生成される腸管製剤の下流用途には、腸細胞からのRNA単離および捕捉された微生物叢からのDNA単離が含まれますが、これらに限定されません。全体として、 C.エレガンスの 腸の手の解剖は、腸生物学の重要な側面を調査するための簡単で堅牢な方法を提供します。
Introduction
Caenorhabditis elegans linetude Wormは、わずか959個の細胞と4日間の卵から卵へのライフサイクルを持ち、多くの遺伝学、ゲノミクス、および発生研究に理想的なモデルシステムです1,2。順方向および逆方向の遺伝子スクリーニングの容易さ、操作された蛍光マーカーの普及率、ヌクレオチド特異的ゲノム編集を実行する能力、および多数のコミュニティ全体のリソースはすべて、C.エレガンスシステムの主要な発見と洞察に貢献しています。しかしながら、重大な欠点は、小さく、壊れやすく、相互接続することができる細胞、組織、または器官の純粋な集団を得ることの困難である。RNA-seq、ChIP-seq、ATAC-seqなどのゲノミクスアッセイでは純粋な細胞集団が重要であるため、C.エレガンスの細胞、組織、および臓器の純粋な調製物を得るためのいくつかのアプローチが登場しています。ここでは、成虫のC.エレガンス虫から腸を大部分で手で解剖する方法について説明する。得られた調製物は、下流のゲノミクスアッセイに適しています(図1)。
ここで説明する微細組織解剖法(図2)は、1つのアプローチにすぎません。分子タグ付け、ワームの分解、蛍光活性化セルソーティング(FACS)および事後解析による目的の細胞タイプの精製などの他の代替技術も、C.エレガンス分子生物学の組織特異的特徴を調査するために成功裏に使用されています。しかし、これらの他のアプローチに対する手の解剖の利点は、C.エレガンスの腸の特徴とその細菌含有量を同時に探索するために使用できることです3,4,5。これにより、16S rRNA遺伝子シーケンシングが可能になり、C.エレガンスシステム内のマイクロバイオーム研究が容易になります。ただし、重要な制限は、腸細胞が個別に分離されないことです。
分子タグ付けは、指定された組織または目的の細胞内の分子にのみ細胞種固有のタグを付与する。これらのタグは、ワームの準備全体から分離できます。このようにして、タグ付きポリA結合タンパク質またはスプライシングリーダーを駆動する組織特異的プロモーターは、組織特異的トランスクリプトームプロファイリング6、7、8、9、10および3'UTRマッピングを可能にしました11、12。同様に、組織特異的転写因子プロファイルは、ChIP-seqおよびDamIDを用いて実施されており、そこではプロモーター特異的転写因子変異体にタグまたは酵素融合が付加されている13,14。
FACSは、その固有の細胞特性および蛍光特性に基づいて、解離した線虫から目的の細胞タイプを単離することを可能にする。このアプローチは、多様な器官8、15、16および個々の神経細胞タイプ8、9、15、16、17、18から組織特異的トランスクリプトームを生成し、C.エレガンス神経系全体の発現マップを作成するために使用されています19,20.FACS、およびそのいとこである蛍光活性化核ソーティング(FANS)も、細胞特異的クロマチンプロファイルを生成するために使用されています21,22。
最後に、ポストホック解析はシングルセル分解能アッセイで実行できます。この方法では、すべての個々の細胞を調査し、それぞれの細胞タイプを分析段階で帰属させ、関心のある細胞タイプを選択的にフィルタリングしてさらに研究します。事後解析は、C. elegans胚23,24,25,26,27およびL1 28ステージワームにおいて、高い空間分解能と時間分解能の両方で発生中の細胞のトランスクリプトームを取得することに成功しています。クロマチンアクセシビリティも、同様の戦略を用いてRNA-seqの代わりにATAC-seqを用いて特徴付けられている29。
それぞれのアプローチには利点と制限があります。C. elegans腸では、腸細胞の線虫分離とFACS分離は、胚および幼虫のステージ30で達成可能ですが、成体では困難です。これは、腸の大きく、内部複製され、強く接着する細胞が、損傷を受けずに解離することが困難であるためであると考えられています。ここで説明する手の解剖方法は、これらの課題を回避し、成虫の腸の大部分を分離することを可能にします。この同じ段階から生殖腺を手で解剖する習慣は広くそして簡単です。腸管解離は生殖腺解離に似ていますが、あまり一般的ではありません32。ここで紹介するプロトコルは、James McGhee博士とBarb Goszczynskiによって開発された、より長い未発表のプロトコルから適応されています。この合理化されたプロトコルは、初期段階の胚23、33、34、35から割球を単離するための技術を借用しています。手の解剖は、C. elegansのほとんどの細胞または組織タイプを分離するのには適していませんが、成虫から腸を分離するのに理想的です。したがって、手剖は、腸特異的細胞製剤を得るための他の手段を補完する。
Protocol
CL2122ワームを本研究に用いた。ワームは、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されたCaenorhabditis遺伝学センター(CGC、 資料表を参照)を通じて入手されました。
1.解剖のためのワームの成長
- 標準的な培養手順(すなわち、大腸菌OP50を播種したNGMプレート)に従って同期させるために、混合段階CL2122ワームの1つの大きなプレートを成長させます36,37。
注:通常、最大の産卵能力に達するには~96時間かかります。- 胚は72-96時間以内にワームを準備します。胚の準備後、胚をM9( 表1を参照)で48時間孵化させます。これにより、L1段階のワームの同期集団が生成されます。
注:CL2122線虫は、腸特異的MTL-2(MeTaLlothionein 2)プロモーター38から駆り立てられる統合された導入遺伝子GFP(緑色蛍光タンパク質)を持っています。このプロモーターは腸細胞質に特異的であり、蛍光解剖顕微鏡で腸を可視化することができます。トレーニングが完了すると、ユーザーは蛍光ガイダンスが必要ない場合があります。
- 胚は72-96時間以内にワームを準備します。胚の準備後、胚をM9( 表1を参照)で48時間孵化させます。これにより、L1段階のワームの同期集団が生成されます。
- プレートは、少なくとも2つの小さなプレートでL1ワームを同期させます。成虫期に達するまで(産卵可能な胚の存在によって識別される)十分な食物と共にNGMプレート上でワームを成長させる。これには、20°Cで38〜46時間かかります。
- 同じ発生段階が反復および比較株間で確実に収穫されるように注意してください。
注:ワームを成長させる時間の長さは、対象となる株、温度、食料源、および発生段階によって異なります39。L4および高齢者の段階など、成人段階に近い他の段階も使用できます。マイクロバイオーム実験を計画するために、従来の食料源(大腸菌 OP50)を超えたさまざまな細菌の食物源を使用して、CeMbio株4 や目的の病原体40などのワームを増殖させることができます。
- 同じ発生段階が反復および比較株間で確実に収穫されるように注意してください。
2.原液およびマイクロキャピラリーピペットの調製
注: 表1 は、本研究に使用されたすべてのバッファーと溶液の詳細を示しています。
- ヌクレアーゼフリーのコニカルチューブで50 mLの卵塩(別名、卵バッファー)を準備します( 材料の表を参照)。作ったら、室温で保存してください。
- 10 mLの100 mMレバミゾールストック溶液をヌクレアーゼフリーのコニカルチューブに調製します。調製したら、500 μLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。 アリコートは解凍して、一度に1週間4°Cで保存できます。
- ヌクレアーゼフリーの微量遠心チューブで1 mLの20 mg/mLストックアセチル化ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を調製します。調製したら、50 μLのシングルユースアリコートを作り、-20°Cで保存します。
注:アセチル化バージョンのBSAはヌクレアーゼを含まない唯一の形態であるため、BSAを使用することが重要です。非アセチル化BSAはヌクレアーゼの重要な供給源となり得、したがって、サンプルの分解をもたらす可能性がある。 - 以下の手順に従って、少なくとも5つの50 μmおよび100 μmマイクロキャピラリーピペットを準備します。
- まず、標準的なガラス毛細血管(長さ4本、外径1.2mm)をニードルプラー(材料表参照)とSutter Instruments Pipette Cookbook41の「接着細胞、C.エレガンス、ショウジョウバエ」の条件(条件:熱=ランプ+5;プル= 100;ベル= 75;遅延 = 90;圧力= 500;2.5ミリメートル×2.5ミリメートルボックス)。
- 次に、マイクロフォージを使用して、マイクロキャピラリーピペットを50 μm(M5/0.1対物レンズのマイクロフォージ接眼定規で示されている3つの目盛り)または100 μm(同じ条件下で5つの目盛り)のサイズに鍛造します( 材料の表を参照)。これらのサイズは、マイクロキャピラリーピペットの推定開口直径を表しています(図3)。
- 次に、口腔アスピレーターチューブをマイクロキャピラリーピペットに貼り付けます。
注:アスピレーターピペットは伝統的に口ピペッティングによって制御されますが、多くの最新の安全プロトコルではこの方法が許可されていません。そのため、ユーザーは指と親指の間でチューブをつまむことで、口内吸引器チューブで吸引を制御できます。さらに、安全性を高めるために、シリンジフィルターを口内アスピレーターチューブシステム内に設置することができます。
3. 実験準備
- ヌクレアーゼフリーのコニカルチューブに5 mLの解剖バッファーを調製します。室温で保管してください。
- ヌクレアーゼフリーのマイクロ遠心チューブで1 mLの実用的なアセチル化BSA溶液を調製します。氷の上に保管してください。
- 350 μLの作業用レバミゾール溶液をヌクレアーゼフリーのマイクロ遠心チューブに入れます。三重に準備します(約20ワーム用の1本のチューブ)。氷の上に保管してください。
- ヌクレアーゼフリーの微量遠心チューブでキレートバッファーを調製します(表1)。複製します(約10個の解剖されたワーム用の1本のチューブ)。氷の上に保管してください。手の解剖中にキレートバッファーを使用すると、RNAの質と量が向上します(図4)。
- ヌクレアーゼフリーチューブに500 μLの核酸分離試薬またはキット指定の単離試薬( 材料の表を参照)を含む、実験グループごとに1本の微量遠心チューブを準備します。氷の上に保管してください。このチューブは、保管または後で使用するために最終的な分離された腸を収集するために使用されます。
- M9浴1槽と解剖緩衝槽1槽を用意する。これを行うには、直径35 mmの滅菌ペトリ皿を2枚入手します。次に、一方の皿に2 mLのM9を加え、もう一方の皿に2 mLの解剖バッファーを追加します。最後に、100 μLの作業用BSA溶液を各浴に加えます。渦巻いて混ぜます。BSAをバスに追加すると、ワームがプラスチックに付着するのを防ぐことができます。
- 解剖配列を準備します。2ウェル凹型スライド( 材料表を参照)を入手し、150 μLの作業用レバミゾール溶液を最初のウェルに追加します。次に、150 μLの解剖バッファーを2番目のウェルに追加します。最後に、20 μLの作業用BSA溶液を各ウェルに加えます。各ウェルにBSAを追加すると、ワームがスライドに付着するのを防ぐことができます。
4.C.エレガンス腸の手剖
- ワームピックを使用して、20匹の成虫をNGMプレートからM9バスに移動します(ステップ3.6)。これはワームから外部のバクテリアを洗い流します。
- 次に、20匹すべてのワームをM9バスから解剖バッファーバスに移動します(ステップ3.6)。これにより、外部の細菌がさらに洗い流され、解剖バッファー内のワームが平衡化されます。
- 次に、ワームのバッチ(すなわち、10個セット)を解剖バッファーバスからレバミゾール溶液を含むウェルに移動する(ステップ3.7)。
注:レバミゾールは一時的にワームを麻痺させます。- ワームの動きが遅くなったら、レバミゾールウェルから解剖バッファーを含むウェルにすばやく移動します(ステップ3.7)。ワームを過度に麻痺させないように注意してください。
注:レバミゾールソリューションにバッチで移動されるワームの数は、ユーザーの快適さによって異なります。これは、最初にM9バスにピッキングされ、次に解剖バッファーバスに移動したワームの数にも当てはまります。ユーザーがプロトコルを学習して慣れるにつれて、特にトレーニング中に、解剖に使用できる追加のワームを用意することをお勧めします。
- ワームの動きが遅くなったら、レバミゾールウェルから解剖バッファーを含むウェルにすばやく移動します(ステップ3.7)。ワームを過度に麻痺させないように注意してください。
- 次に、解剖を開始する前に、ワームが解剖バッファー内で少し動き始めるのを待ちます。
注:腸は、過度に麻痺したワーム(つまり、まったく動いていないワーム)からうまく押し出されません。 - 準備ができたら、皮下注射針(つまり、27 G x 1/2インチ)を使用して蛍光解剖スコープの下でワームを解剖します(材料 表を参照)咽頭のすぐ後ろ(図5Aa)または直腸のすぐ前(図5Ab)。これにより、腸の2つの大きなセクション、前中半分と中後半分Iが生成されます。残りのワームについてもこのパターンを継続し、腸の所望の総数が取得されるまで、前中部および中後部から得られた腸切片の数を同等に保ちます。
注意: 皮下注射針を空の1mLシリンジバレルに取り付けると、手の解剖中の操作に役立ちます。ユーザーの快適さと経験に応じて、腸の断片を生じない解剖カットを行うことは珍しくありません。しかし、練習すれば、これははるかに一般的ではなくなります。 - 腸が体から最大限に押し出されるまで約1分待ちます。それらは通常ループ形状を取り、生殖腺の一部に付着している可能性があります(図5A)。待機中に、50 μLのキレートバッファーをウェルに加えると、RNAの分解が減少します(図4)。
- 待っている間、腸の押し出しをさらに促進するために、マウスアスピレーターに取り付けられた100μmのマイクロキャピラリーピペットを使用して、腸/ワームをピペットに出し入れします(図5B)。これは生殖腺から腸を解放するのにも役立ちます。誤って腸をマイクロキャピラリーピペットに完全に吸い上げて失わないように注意してください。
注:ユーザーは、100μmと50μmのマイクロキャピラリーピペットを交互に使用して、腸を体の他の部分や生殖腺から解放することができます。50 μmマイクロキャピラリーピペットの直径が小さい開口部は、腸から粘着性のある部分を除去するための利点をもたらす可能性があります。アスピレーターピペットは伝統的に口ピペッティングによって制御されていますが、多くの最新の安全プロトコルではこの方法が許可されていません。そのため、ユーザーは指と親指の間でチューブをつまむことで、口内吸引器チューブで吸引を制御できます。さらに、安全性を高めるために、シリンジフィルターを口内アスピレーターチューブシステム内に設置することができます。 - 腸が十分に押し出されたら、27 Gの皮下注射針を使用して、体の他の部分と残っている生殖腺から腸を切り取ります。単離された腸切片の大きさは、収穫機の経験、切断の質、およびワームの麻痺のレベルによって大きく異なります。
注:腸および腸の断片の完全性は、GFP蛍光 を介して プロトコル全体で簡単に監視できます。 - 次に、マイクロキャピラリーピペットを使用して腸切片を吸引し、ウェルから核酸分離試薬またはキット指定の分離試薬を含むマイクロ遠心チューブに移動します。単離した腸を氷上の試薬に保ち、残りの腸についても繰り返します。
注:核酸分離試薬または別のキット指定の単離試薬を含むマイクロ遠心チューブに複数の腸を一日中追加できます。氷の上に保管してください。1日ですべての腸を分離できない場合、すでに分離され、核酸分離試薬(核酸を保存する)に保存されている腸は、分離が再開されるか完了するまで-80°Cに保つことができます。ここで、試料は、長期間(すなわち、数ヶ月〜1年)安定であり、核酸を単離する準備ができるまで残存することができる。腸は、水またはキット固有の溶解バッファーに回収できます。ただし、下流のアプリケーションに移る前に、腸が氷上の特定のバッファー(または他の望ましい温度)にどれだけ長く留まることができるかを決定する際には、考慮する必要があります。
5.解剖腸からのRNA単離
- 核酸分離試薬に保存されている取得した組織を、凍結/解凍/渦サイクルを3回実行して均質化します。これを行うには、37°Cのビーズバスと液体窒素(または他の同等の手段)を使用します。
- 次に、0.2容量のフェノール:クロロホルム:IAA試薬( 材料表を参照)をサンプルとボルテックスに短時間加えます。例えば、開始サンプル量が500 μLの場合、0.2容量のクロロホルムは100 μLになります。
- チューブを手で20秒間振とうした後、室温で3分間インキュベートします。
- 遠心分離(10,000 x g、18分、4°C)でサンプル相を分離します。
- 水相を除去し、新しいヌクレアーゼフリーのマイクロ遠心チューブに移します。
注意: インターフェイスを吸引したり乱したりしないように注意してください。 - 次に、等量の100%エタノールを水相に加え、サンプルを手で20秒間振とうします。
- 700 μLのサンプルをスピンカラムに移します( 材料表を参照)。その後、遠心分離(≥8,000 x g、30秒、室温)でRNAをカラムに接着させます。フロースルーを破棄します。残りのサンプルについても繰り返します。
- 350 μLのRW1バッファー( 材料表を参照)をカラムに加え、サンプルを洗浄します。その後、遠心分離(≥8,000 x g、30秒、RT)し、フロースルーを廃棄します。
- オンカラムDNA消化を実行します。80 μLのDNase IをRDDバッファー( 材料表を参照)でサンプルカラムに加えます。その後、RTで15分間インキュベートします。
- 次に、350 μLのRW1バッファーをカラムに加え、サンプルを洗浄します。遠心分離(≥8,000 x g、30秒、RT)し、カラムを新しい収集チューブに移します。フロースルーチューブと古い収集チューブを廃棄します。この洗浄により、DNaseが除去されます。
- 500 μLのRPE( 材料表を参照)をサンプルカラムに加えます。その後、遠心分離(≥8,000 x g、30秒、RT)し、フロースルーを廃棄します。2回目の洗浄を繰り返します。
- その後、さらに1分間遠心分離し、カラムメンブレンをさらに乾燥させます(≥8,000 x g、1分、RT)。次に、サンプルカラムを蓋付きの新しいヌクレアーゼフリーのマイクロ遠心回収チューブに移します。フロースルーチューブと古い収集チューブを廃棄します。
- 14 μLのヌクレアーゼフリー水をサンプルカラムのメンブレンに直接加えます。次に、サンプルをRTで2分間インキュベートします。次に、遠心分離機(≥8,000 x g、1分、RT)を行い、RNAを溶出させた。
- サンプルを氷上に保存します。次に、市販のアッセイキットを使用してサンプルのRNAの質と量を評価します( 材料表を参照)。完了したら、サンプルを-80°Cの冷凍庫に保管します。
注:RNAは一般に-80°Cで最大1年間安定であり、分解されません。
Representative Results
本プロトコルは、腸の大部分を成人の C.エレガンス から手作業で単離するために使用されました(図2)。示されている各実験群の最終的な腸サンプルは、前中部および中後部腸切片の等しいコレクションで構成されています。ただし、実験の質問によっては、前部、中部、または後部の腸セクションのみのコレクションを構成することもできます。まとめると、このプロトコルについて3つの代表的な結果が提示されます。1つ目は、腸の解剖と分離の成功を示しています(図6)。2つ目は、単離された腸からのRNA単離の結果を報告します(図7)。3つ目は、単離された腸からの微生物サーベイランスの結果を示しています(図8)。
最初の結果について、図6Aは、成虫CL2122ワーム内の図5Aの部位「a」で一次切開を行った後の押し出された腸がどのように見えるかを示しています。CL2122線虫はGFPに融合した腸特異的mtl-2プロモーター(mtl-2 p::GFP)を保有しているため、単離された腸は蛍光解剖スコープの下で緑色に光ります。腸セグメントの解剖の成功を図6Bに示します。この腸のセクションには、生殖腺や死体からの破片などの目に見える汚染物質がありません。対照的に、図6Cは、生殖腺と死骸がまだ腸のセグメントに目に見えて付着しているため、うまく解剖されていない腸を示しています。
2番目の結果については、腸を核酸分離試薬に回収し、翌日、低インプットトータルRNA抽出プロトコルを使用して処理しました( 材料の表を参照)。前部中部および中部後部からの60個の全腸切片の最終腸サンプルでは、約15 ngの高品質のトータルRNAが得られます(図7A)。この量の総腸は1日で簡単に入手できますが、必要に応じて数日間に分けることもできます。手の解剖によるRNA収量は、腸細胞の線虫分離やFACS単離よりも効率的であり、それに見合った量のトータルRNAを得るために数十万の腸細胞が必要です(図7B)。重要なことに、手解剖によって生成されたRNA収量は、市販のRNA-seqライブラリキット(すなわち、NEBNext Ultra IIおよびNEBNextシングルセル/低入力)の入力として十分すぎるほどであり、わずか2pgのRNAしか摂取できません。
第3の結果については、腸を滅菌ddH20に回収し、市販の微生物DNA単離キットを用いて同日に処理した( 材料の表を参照)。前部-中部および中部後部からの40個の全腸切片の最終腸サンプルは、汎細菌検出アッセイを使用して約0.009 pgの総微生物DNAを生成します( 材料の表を参照)(図8)。これらの量は従来の定量法では低すぎるため、qPCR標準曲線から外挿する必要があります。理想的には、試薬汚染レベルに関する信号対雑音の検出限界と境界を増加させるため、ユーザーは腸の最終的な総量を>40にする必要があります。
実験計画を検討する際には、常に適切な対照サンプルを収集する必要があります。トランスクリプトミクス実験の場合、適切な実験対照は、腸と同じ方法で収集されたワーム全体の調製物を含むことができる。しかし、 C.エレガンスからの腸の解剖と分離の間に、死骸と生殖腺の断片が腸の部分に付着しているのを見るのが一般的です。理想的には、これらの汚染組織は下流で使用するために保管する前に腸から除去されますが、追加の実験的コントロールには、腸解剖後の残りの虫の死骸の収集および/または解剖された生殖腺の収集を含めることができます。マイクロバイオーム実験の場合、コントロールには、従来のポジティブ(細菌培養)およびネガティブ(水)コントロールに加えて、腸と同じ方法で収集されたワーム全体の調製物を含めることもできます。
図1:成体からの腸の手解剖 C.エレガンス さまざまなダウンストリームオミクスアッセイで使用するための組織特異的調製物を生成するために使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:手の解剖プロトコルのスキーム。 このプロトコルは、腸の大部分を成人の C.エレガンス から手で分離するために使用されました。腸は、さまざまなダウンストリームアッセイのために単離できます。ここに示されているのは、RNA単離と微生物DNA単離のための腸の使用です。BioRender.com で作成された画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マイクロキャピラリーピペットの製造。(A)引きたての鍛造されていないマイクロキャピラリーピペットを、マイクロフォージの接眼部を通して示します。眼定規を使用して、50μmサイズのマイクロキャピラリーピペットを3つの目盛りの推定内径まで測定します(図は矢印で示されています)。(B)鍛造されていない50μmおよび100μmのマイクロキャピラリーピペットは、1 div = 0.1 mmの校正定規と一緒に解剖スコープの下に示されています。 (C)(B)の50μmおよび100μmマイクロキャピラリーピペットは、別の視点から再び示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:RNA収率を改善するための手の解剖中のキレートバッファー(CB)の使用。 低入力総RNA抽出プロトコルは、指定された組織からRNA調製物を生成しました。単離されたトータルRNAの品質(RIN、RNA完全性番号)および量を特徴付ける代表的なゲル電気泳動ランが示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:手の解剖手順 。 (A)プロトコルに記載されている解剖手順は、ここで概説されています。(1)では、GFP蛍光により線虫の腸を可視化する。一次切開部位は、腸の全長にわたって均一なカバレッジを確保するために、ワーム間で均等に分散させることができます。あるいは、「a」または「b」のいずれかの一次切開部位を選択して、前中部または中後部腸断片特異的調製物を得ることができる。(2)では、腸が押し出され、ループ状になっています。(3)では、まず腸を虫の体から切り離し、死骸や生殖腺から解放しようとします。次に、腸は、除去できない残りの死体または生殖腺から除去されます。(4)では、腸の洗浄された部分が隔離され、保管の準備が整います。(B)重要なステップは、口内吸引器の端に作られたマイクロキャピラリーピペットに出し入れすることにより、腸から付着した破片(すなわち、生殖腺、死骸)を取り除くことです。スケールバー= 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:手の解剖ステップの代表的な結果。 (A)ワームからの腸の押し出しを示す代表的な画像である。これらはCL2122遺伝子型のワームであり、腸細胞特異的 mtl-2 プロモーターの下でGFPを発現する。2つの代表的な画像は、(B)腸の洗浄された完全に隔離された切片、および(C)汚染された生殖腺および死体組織を有する単離された腸を示す。スケールバー= 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:単離された腸からのトータルRNA抽出の代表的な結果 。 (A)アガロースゲル電気泳動によって分離されたRNA調製物の代表的な画像を示し、単離された全RNAの品質(RIN、RNA完全性数)と量を特徴付けます。(B)蛍光活性化セルソーティング(FACS) を介して L1期ワームから採取された腸細胞から単離された全RNAの代表的なゲルを比較のために示す。腸あたり20細胞では、手剖法はFACS精製された腸細胞よりも腸あたりの総RNAを多く生成することが推測できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:単離された腸からの全微生物DNA抽出の代表的な結果。 市販の微生物DNA分離キットは、腸、全線虫、および対照からDNA調製物を生成しました。汎細菌遺伝子アッセイを使用して、サンプル中の細菌数を定量化しました。(A)生成されたqPCR増幅曲線、(B)サンプルの定量に用いた 大腸菌 OP50標準曲線、および(C)サンプルの代表的な画像を示す。(B)では、 大腸菌 標準物質の対数開始濃度をそれらのCT 値に対してグラフ化している。(C)では、40匹の全身ワームの2回の反復(reps)を内側に切断し、40個の単離された腸切片を微生物gDNA単離のために処理した。qPCR実行からのテンプレートコントロールなし(NTC)も表示されます。Y軸はサンプルCT 値を表す。PCRから定量されたDNAの量は、サンプルバーの上に総ピコグラム(pg)値として表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:本研究で使用した緩衝液および溶液の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
この記事では、成体の C.エレガンスから腸を手で解剖し、ダウンストリームアッセイ用の純粋な調製物を生成するためのステップバイステップのプロトコルについて説明します。このプロトコルの重要なステップには、(1)ワームを過剰に麻痺させないようにすること、(2)正確な解剖カットを行うこと、(3)解剖用に適切なサイズのマイクロピペットを鍛造すること、および(4)最終収穫中の健康な腸の迅速な回復を確保することが含まれます。これらの理由から、ワームをレバミゾール溶液にさらすときは注意が必要であり、皮下注射針は最大の鋭さを確保するために頻繁にリフレッシュする必要があります。マイクロキャピラリーピペットと口内吸引器を使用して腸を扱うことは、練習が必要な別のステップです。適切なサイズの適切に鍛造されたマイクロピペットは、マイクロピペット内の腸を失うリスクを減らすことに加えて、解剖中に腸の大部分を分離することに大きな違いをもたらします。新しいプロトコルユーザーは、通常、単離試薬に排出される前に、マイクロキャピラリーピペットの内側の端にある腸を失います。この問題は、練習と適切に鍛造されたマイクロキャピラリーピペットで修正できます。
本明細書に記載のプロトコルは、成虫で使用するために設計された。予備試験では、このプロトコルがL4ワームおよび高齢成虫での使用にも有効であることが裏付けられています。ただし、このプロトコルの有効性は、初期の幼虫期のワームではまだ評価されていません。このアプローチの制限は、それが産出する少量の材料です。RNA-seqおよびPCRには十分な量ですが、他のアッセイには不十分な場合があります。そのため、ユーザーは、アッセイに必要な最小限の入力をこのプロトコルで実現可能に収集できるかどうかを判断する必要があります。
私たちの研究室では、分離後の腸細胞の精製にFACSを日常的に利用しており30、腸細胞識別のための事後分析法、およびこの手解剖法30,42を利用しています。手剖には、虫の分離と細胞分離があまり成功しない場合に、成虫での使用に適しているという利点があります。さらに、手解剖製剤から抽出されたトータルRNAの効率と品質は高く、おそらく組織がワームから急速に摘み取られ、核酸分離試薬に迅速に沈着し、RNA分解が減少します。手の解剖法のもう一つの利点は、低コストで習得が容易で、特殊な機器を必要としないことです。最後に、このアプローチにより、ワームの腸からの腸内細菌の収穫と分離が可能になり、下流の微生物叢研究が可能になります。
成体から腸を単離するためにここで説明する手の解剖プロトコル C.エレガンス 生物学のさまざまな側面を研究するための強力なツールを表しています。たとえば、腸の純粋な準備により、研究者は免疫、老化、代謝、および微生物叢の間の交差点を調査できます。
Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
私たちは、このプロトコルが適応される腸郭清法を最初に開発したジェームズ・マクギーとバーブ・ゴシュチンスキーの先駆的な研究に感謝しています。私たちの仕事は、国立総合医学研究所(国立衛生研究所、R35GM124877からEON)が監督するMIRA(R35)賞と、NSF MCB分子細胞生物科学部門が監督するNSF-CAREER賞(賞#2143849からEONまで)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-420 | Nuclease free BSA |
| CL2122 worm strain | CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | CL2122 | dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher | C79 | needed for making Egg Salts |
| 50 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-108 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
| 15 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-103 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
| Concavity slide (2-well) | Electron Microscopy Sciences | 71878-08 | 12-pk of 2-well concavity slides |
| Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Millipore Sigma | E3889 | needed for making chelation buffer |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica | M205 FCA | This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Millipore Sigma | H4034 | needed for making dissection buffer |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | for assesment of total RNA quality and quantity |
| High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | for assesment of total RNA quality and quantity |
| High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | for assesment of total RNA quality and quantity |
| HostZERO Microbial DNA Kit | Zymo Research | D4310 | Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms |
| Hypodermic Needle (27G x 1/2") | BD Scientific | 305109 | needed for hand dissection of intestines |
| Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) | Millipore Sigma | L9756 | used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines. |
| Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) | BD Scientific | 309628 | Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger. |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher | M33 | needed for making Egg Salts |
| Magnesium Sulfate Hpetahydrate | Sigma-Aldrich | 230391-500G | needed for making M9 buffer |
| MF-900 Microforge | Narishige | MF-900 | Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research. |
| 1.7 mL Microtubes, Clear | Olympus Plastics | 22-282 | Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage. |
| Mouth Aspirator Tube | Millipore Sigma | A5177 | Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines. |
| 16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay | Thermo Fisher | A50137 | Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR. |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging. |
| Petri Dish (35 x 10 mm) | Genesee Scientific - Olympus Plastics | 32-103 | Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection. |
| Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9730 | Used in the isolation of total RNA |
| Potassium Chloride | Millipore Sigma | 529552 | needed for making Egg Salts |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500G | needed for making M9 buffer |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32852 | Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol. |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection |
| Sodium Chloride | Fisher | S271 | needed for making Egg Salts |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | needed for making M9 buffer |
| Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) | Thermo Fisher | 72302520 | Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting. |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity |
| TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix | Applied Biosystems | A52699 | master mix used for qPCR |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred. |
| Worm Pick | NA | NA | Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details. |
References
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