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Bioengineering

In-vitro-Selektion von Aptameren zur Unterscheidung von infektiösen und nicht-infektiösen Viren

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin
* These authors contributed equally

Summary

Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, das im Allgemeinen auf die Auswahl von Aptameren angewendet werden kann, die nur an infektiöse Viren binden und nicht an Viren, die durch eine Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurden, oder an andere ähnliche Viren. Dies eröffnet die Möglichkeit, den Infektiositätsstatus in tragbaren und Schnelltests zu bestimmen.

Abstract

Virusinfektionen haben große Auswirkungen auf die Gesellschaft; Die meisten Nachweismethoden haben Schwierigkeiten bei der Feststellung, ob ein nachgewiesenes Virus infektiös ist, was zu Verzögerungen bei der Behandlung und einer weiteren Ausbreitung des Virus führt. Die Entwicklung neuer Sensoren, die Aufschluss über die Infektierbarkeit von klinischen oder Umweltproben geben können, wird diese ungelöste Herausforderung meistern. Es gibt jedoch nur sehr wenige Methoden, die Sensormoleküle erhalten, die ein intaktes infektiöses Virus erkennen und es von demselben Virus unterscheiden können, das durch Desinfektionsmethoden nicht infektiös gemacht wurde. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Auswahl von Aptameren, das infektiöse Viren von nicht-infektiösen Viren unterscheiden kann, indem wir systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) verwenden. Wir machen uns zwei Funktionen von SELEX zunutze. Erstens kann SELEX maßgeschneidert werden, um konkurrierende Ziele, wie z. B. nicht-infektiöse Viren oder andere ähnliche Viren, durch Counter-Selektion zu entfernen. Darüber hinaus kann das gesamte Virus als Ziel für SELEX verwendet werden, anstatt beispielsweise ein virales Oberflächenprotein. SELEX ermöglicht die Auswahl von Aptameren, die spezifisch an den nativen Zustand des Virus binden, ohne dass das Virus gestört werden muss. Diese Methode ermöglicht es somit, Erkennungsmittel auf der Grundlage funktioneller Unterschiede in der Oberfläche von Krankheitserregern zu erhalten, die nicht im Voraus bekannt sein müssen.

Introduction

Virusinfektionen haben weltweit enorme wirtschaftliche und gesellschaftliche Auswirkungen, wie die jüngste COVID-19-Pandemie immer deutlicher wurde. Eine rechtzeitige und genaue Diagnose ist von größter Bedeutung, um Virusinfektionen zu behandeln und gleichzeitig die Ausbreitung von Viren auf gesunde Menschen zu verhindern. Obwohl viele Virusnachweismethoden entwickelt wurden, wie z. B. PCR-Tests1,2 und Inmunoassays3, sind die meisten der derzeit verwendeten Methoden nicht in der Lage, festzustellen, ob das nachgewiesene Virus tatsächlich infektiös ist oder nicht. Dies liegt daran, dass das Vorhandensein von Bestandteilen des Virus allein, wie z. B. virale Nukleinsäure oder Proteine, nicht darauf hinweist, dass das intakte, infektiöse Virus vorhanden ist, und die Konzentrationen dieser Biomarker eine schlechte Korrelation mit der Infektiosität gezeigt haben 4,5,6. So weist beispielsweise die virale RNA, die üblicherweise für die aktuellen PCR-basierten COVID-19-Tests verwendet wird, in den frühen Stadien der Infektion sehr niedrige Werte auf, wenn der Patient ansteckend ist, während der RNA-Spiegel oft noch sehr hoch ist, wenn sich die Patienten von der Infektion erholt haben und nicht mehr ansteckend sind 7,8. Die viralen Protein- oder Antigen-Biomarker folgen einem ähnlichen Trend, treten aber in der Regel noch später als die virale RNA auf und sind daher noch weniger prädiktiv für die Infektiosität 6,9. Um dieser Einschränkung entgegenzuwirken, wurden einige Methoden entwickelt, die Aufschluss über den Infektiositätsstatus des Virus geben können, aber auf mikrobiologischen Techniken der Zellkultur basieren, die eine lange Zeit (Tage oder Wochen) benötigen, um Ergebnisse zu erhalten 4,10. So kann die Entwicklung neuer Sensoren, die Aufschluss über die Infektierbarkeit von klinischen oder Umweltproben geben können, Verzögerungen bei der Behandlung und eine weitere Ausbreitung des Virus vermeiden. Es gibt jedoch nur sehr wenige Methoden, die Sensormoleküle erhalten, die ein intaktes infektiöses Virion erkennen und es von demselben Virus unterscheiden können, das nicht infektiös geworden ist.

In diesem Zusammenhang eignen sich Aptamere besonders gut als einzigartiges biomolekulares Werkzeug 11,12,13,14. Aptamere sind kurze, einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle mit einer spezifischen Nukleotidsequenz, die es ihnen ermöglicht, eine spezifische 3D-Konformation zu bilden, um ein Ziel mit hoher Affinität und Selektivität zu erkennen15,16. Sie werden durch einen kombinatorischen Selektionsprozess erhalten, der als systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) bezeichnet wird, auch bekannt als In-vitro-Selektion, der in Reagenzgläsern mit einer großen zufälligen DNA-Probenbibliothek von 10 14-10 15 Sequenzen durchgeführt wird17,18,19. In jeder Runde dieses iterativen Prozesses wird der DNA-Pool zunächst durch Inkubation mit dem Target unter den gewünschten Bedingungen einem Selektionsdruck ausgesetzt. Alle Sequenzen, die nicht an das Ziel gebunden sind, werden dann entfernt, so dass nur die wenigen Sequenzen übrig bleiben, die unter den gegebenen Bedingungen binden können. Schließlich werden die im vorherigen Schritt ausgewählten Sequenzen durch PCR amplifiziert, wodurch die Population des Pools mit den gewünschten funktionellen Sequenzen für die nächste Selektionsrunde angereichert wird, und der Vorgang wird wiederholt. Wenn die Aktivität des Selektionspools ein Plateau erreicht (in der Regel nach 8-15 Runden), wird die Bibliothek durch DNA-Sequenzierung analysiert, um die Gewinnsequenzen mit der höchsten Affinität zu identifizieren.

SELEX hat einzigartige Vorteile, die genutzt werden können, um eine erhöhte Selektivität gegen andere ähnliche Zielmoleküle 20,21 zu erreichen, z. B. für den Infektiositätsstatus des Virus22. Erstens kann eine Vielzahl unterschiedlicher Arten von Targets für die Selektion verwendet werden, von kleinen Molekülen und Proteinen bis hin zu ganzen Krankheitserregern und Zellen16. Um ein Aptamer zu erhalten, das an ein infektiöses Virus bindet, kann daher ein intaktes Virus anstelle eines viralen Oberflächenproteins als Ziel verwendet werden19. SELEX ermöglicht die Auswahl von Aptameren, die spezifisch an den nativen Zustand des Virus binden, ohne dass das Virus gestört werden muss. Zweitens kann SELEX so maßgeschneidert werden, dass konkurrierende Zielmoleküle 21,23, wie z. B. andere ähnliche Viren oder nicht-infektiöse inaktivierte Viren, unter Verwendung von Gegenauswahlschritten in jeder Auswahlrunde22 entfernt werden. Während der Zählerauswahlschritte wird der DNA-Pool Zielen ausgesetzt, für die eine Bindung nicht erwünscht ist, und alle Sequenzen, die binden, werden verworfen.

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das allgemein für die Auswahl von Aptameren verwendet werden kann, die an ein infektiöses Virus binden, aber nicht an dasselbe Virus, das durch eine bestimmte Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurde, oder an andere verwandte Viren. Diese Methode ermöglicht es, Erkennungsmittel auf der Grundlage funktioneller Unterschiede der Virusoberfläche zu erhalten, die nicht im Voraus bekannt sein müssen, und bietet so einen zusätzlichen Vorteil für den Nachweis neu aufgetretener Erreger oder für wenig erforschte Krankheiten.

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Protocol

1. Herstellung von Reagenzien und Puffern

  1. Bereiten Sie 10x Trisborat-EDTA (10x TBE) zu, indem Sie 0,9 M Tris-Base, 0,9 M Borsäure, 20 mM EDTA (Dinatriumsalz) und deionisiertes Wasser zu einem Endvolumen von 1 l hinzufügen. Mischen, bis sich alle Komponenten aufgelöst haben.
  2. Bereiten Sie eine 10%ige denaturierende Polyacrylamid-Stammlösung wie folgt vor. In eine 250-ml-Glasflasche werden 120 g Harnstoff (8 m), 25 ml 10-facher FSME, 62,5 ml 40%ige Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (29:1) und genügend destilliertes Wasser gegeben, um das Endvolumen von 250 ml zu erreichen. Mischen, bis sich alle Komponenten aufgelöst haben.
  3. Bereiten Sie 2x Ladepuffer wie folgt vor. In ein 50-ml-Röhrchen werden 21,636 g Harnstoff (8 m), 1,675 g EDTA (1 m) und 4,5 ml 10-fache FSME gegeben. Auf 45 ml mit destilliertem Wasser auffüllen und mischen, bis sich alle Bestandteile aufgelöst haben.
  4. Bereiten Sie den Extraktionspuffer durch Zugabe von 100 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA (Dinatriumsalz) vor. Stellen Sie den endgültigen pH-Wert auf 5 ein.
  5. Bereiten Sie Ethanol-Fällungslösungen wie folgt vor. 3 M Natriumacetat vorbereiten, auf pH 5,2 einstellen und bei 4 °C lagern. 70% Ethanol v/v zubereiten und bei -20 °C lagern. 100% Ethanol zubereiten und bei -20 °C lagern.
  6. Bereiten Sie 500 ml SELEX-Puffer vor, der 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2 und 0,5 mM CaCl2 enthält. Auf pH 7,4 einstellen. 100 ml SELEX-Puffer mit 8 M Harnstoff werden durch Zugabe von 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2 und 8 M Harnstoff hergestellt. Auf pH 7,4 einstellen.
    HINWEIS: Die Wahl des SELEX-Puffers ist entscheidend, um sicherzustellen, dass das ausgewählte Aptamer in der endgültigen Probe, in der das Aptamer aufgetragen wird, funktioniert. So werden beispielsweise SARS-CoV-2-spezifische Aptamere in biologischen Proben (z. B. Speichel- oder Nasopharynge-Abstrichen) verwendet. Daher ist es wichtig, Ionenkonzentrationen, pH-Wert und Puffer zu wählen, die diese Bedingungen in den vorgesehenen biologischen Proben genau nachahmen.
  7. Bereiten Sie den Binde- und Waschpuffer wie folgt vor. In einem 50-ml-Röhrchen werden 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA (Dinatriumsalz) und 2 M NaCl hergestellt. Auf pH 7,5 einstellen.

2. Design und Synthese von DNA-Bibliotheken und Primern

  1. Entwerfen Sie die anfängliche ssDNA-Bibliothek und die Primer mit den folgenden Kriterien (siehe Tabelle 1 für ein Beispiel für eine ssDNA-Bibliothek und einen Satz von Primern, wobei N eine zufällige Nukleotidposition angibt).
    1. Stellen Sie sicher, dass die Bibliothek eine zentrale zufällige Region von 35 bis 60 Nukleotiden enthält, die von zwei konstanten Sequenzen an den 3'- und 5'-Enden flankiert werden, die als Primerregionen für die Amplifikation dienen. Eine typische Bibliothekslänge beträgt 45 zufällige Nukleotide.
    2. Stellen Sie sicher, dass der Reverse-Primer eine Biotin-Modifikation enthält, um ssDNA aus amplifizierten doppelsträngigen PCR-Produkten unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Beads während des In-vitro-Auswahlprozesses zu trennen.
  2. Kaufen Sie die DNA-Oligos aus kommerziellen Quellen mit Standard-Entsalzungsreinigung. Reinigen Sie die ssDNA-Bibliothek und die Primer durch 10%ige denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (dPAGE), gefolgt von Ethanolfällung gemäß den Standardverfahren24.
    VORSICHT: Acrylamidmonomer und Ethidiumbromid sind gefährliche Chemikalien (Karzinogene für den Menschen), daher verwenden Sie während der Durchführung von PAGE geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz). Vermeiden Sie nach Möglichkeit die Verwendung von Ethidiumbromid und ersetzen Sie es durch einen sichereren Farbstoff.
    HINWEIS: Es ist möglich, die Oligos mit HPLC-Aufreinigung zu bestellen, um die Durchführung dieses Aufreinigungsschritts zu vermeiden, obwohl dadurch kurze Oligonukleotide nicht so effektiv entfernt werden.
  3. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um die ssDNA nach der Ethanolfällung bis zur gewünschten Konzentration (100 μM) zu resuspendieren. Bestimmung der Konzentration der ssDNA-Bibliothek und der Primer durch UV-Absorption bei λ = 260 nm. Bei -20 °C lagern.
  4. Kaufen Sie einen unmodifizierten Reverse-Primer für die Hochdurchsatz-Sequenzierung, die Bibliotheksvorbereitung und die qPCR-Quantifizierung.

3. Infektiöse und nicht-infektiöse Virusproben

VORSICHT: Bei den infektiösen und nicht-infektiösen Virusproben handelt es sich um Proben der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2), die besondere Sorgfalt erfordern, um sie sicher und angemessen zu handhaben. Alle Verfahrensschritte, die diese Proben umfassen, müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden, oder die Viruslösung muss sich in einem versiegelten Behälter (z. B. verschlossene Kunststoffröhrchen) befinden.

  1. Besorgen Sie sich eine Stammlösung infektiöser Viren oder bereiten Sie sie zu, indem Sie das entsprechende Protokoll für jedes Virus befolgen. Die hier verwendeten SARS-CoV-2-, SARS-CoV-1- und H5N1-Pseudoviren wurden vom Labor von Prof. Lijun Rong (UIC) in PBS-Puffer bereitgestellt und nach den berichteten Protokollen22,25,26 hergestellt.
    HINWEIS: Bei Viren, die Einrichtungen der Biosicherheitsstufe 3 benötigen, um mit dem intakten infektiösen Virus umgehen zu können, ist es möglich, mit Pseudoviren zu arbeiten. Ein pseudotypisiertes Virus wird aus einem Lentivirus (HIV) erzeugt, das die Oberflächenproteine des Virus innerhalb der Virushülle aufweist und somit die Oberfläche und den Eintrittsmechanismus des Virus genau nachahmt, aber bei der kontinuierlichen Virusreplikation defekt ist.
  2. Besorgen Sie sich eine nicht-infektiöse Virusstammlösung oder bereiten Sie sie zu, indem Sie das Desinfektionsverfahren befolgen. Der hier verwendete UV-inaktivierte SARS-CoV-2-Pseudovirus-Bestand (p-SARS-CoV-2) wurde vom Labor Prof. Rong (UIC) in PBS-Puffer bereitgestellt, und das zuvor beschriebene Protokoll wurde für die UV-Inaktivierungverwendet 22.
    Anmerkungen: Führen Sie nach Möglichkeit einen Test durch, um die Infektiosität des Virus zu testen, um sicherzustellen, dass das Virus vollständig inaktiviert wurde.
  3. Quantifizieren Sie die Virusbestände
    1. Quantifizieren Sie das Virus mit einem Plaque-Assay gemäß den Standardverfahren27,28,29. Dieser Assay ermöglicht nicht nur die Quantifizierung des Virus, sondern zeigt auch den Infektiositätsstatus des Virus an und bestätigt die Konzentration des infektiösen Virus.
    2. Bei Pseudoviren oder Viren, für die kein Plaque-Assay verfügbar ist, quantifizieren Sie das Virus mit einem kommerziell erhältlichen quantitativen Lentivirus-ELISA-Kit.
    3. Bereiten Sie 1 x 108 Kopien /ml Stammlösung für p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 und p-H5N1 vor. Jede Stammlösung in Aliquoten mit je 50 μl trennen und bei -80 °C aufbewahren. Tauen Sie vor jedem Experiment ein neues Aliquot auf.

4. In-vitro-Selektion oder SELEX-Verfahren: erste Runde

Anmerkungen: Arbeiten Sie für alle Schritte mit dem infektiösen Virus in einem BSL2-Schrank.

  1. Denaturieren Sie die ssDNA-Bibliothek. Man nehme 10 μl von 100 μM der ssDNA-Bibliothek (1 nmol) und mische sie mit 240 μl SELEX-Puffer. 15 Minuten im Trockenbad bei 95 °C erhitzen und dann 15 Minuten auf Eis legen.
  2. Inkubieren Sie die ssDNA-Bibliothek mit dem infektiösen Virus (positiver Selektionsschritt) wie folgt. Mischen Sie 250 μl ssDNA-Bibliothek in SELEX-Puffer aus Schritt 4.1 mit 50 μl infektiösem Virus (1 x 108 Kopien/ml). 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Blockieren Sie die unspezifischen Stellen in Zentrifugenfiltern wie folgt. Während Sie auf Schritt 4.2 warten, bereiten Sie die Zentrifugenfilter für die nächsten Schritte vor.
    1. Fügen Sie 400 μl der T20-Sequenz von 1 mM (Tabelle 1) zu jedem zu verwendenden 0,5-ml-Zentrifugenfilter hinzu - einen Zentrifugenfilter mit einem Cut-off von 100 kDa und einen mit einem Cut-off von 10 kDa.
    2. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren und 10 min bei 14.000 x g zentrifugieren, um die T20-Lösung aus dem Filter zu entfernen. 3x mit SELEX-Puffer waschen, um überschüssige T20-Sequenzen zu entfernen.
  4. Waschen Sie ungebundene Sequenzen wie folgt. Das in Schritt 4.2 inkubierte Gemisch in den verstopften 100 kDa Zentrifugenfilter geben und bei 14.000 x g 10 min zentrifugieren. 3x waschen, 400 μl SELEX-Puffer zugeben und 10 min bei 14.000 x g zentrifugieren. Lassen Sie die Fraktion im Filter und verwerfen Sie den Durchfluss.
  5. Elute gebundene Sequenzen wie unten beschrieben.
    1. Wechseln Sie das Auffangröhrchen des Zentrifugenfilters und geben Sie in Schritt 4.4 300 μl SELEX-Puffer mit 8 M Harnstoff in den Zentrifugenfilter. Erhitzen Sie den Zentrifugenfilter bei 95 °C für 15 min in einem Trockenbad und zentrifugieren Sie dann bei 14.000 x g für 10 min.
    2. Sammeln Sie die Fraktion, die durch den Filter mit den eluierten Sequenzen geflossen ist. Wiederholen Sie den Vorgang noch dreimal. Arbeiten Sie in einem BSL2-Schrank und waschen Sie alle Materialien mit 10% Bleichmittel, um das Virus zu inaktivieren, bevor Sie die Materialien entsorgen.
  6. Konzentrieren und entsalzen Sie wie folgt. Geben Sie die in 4,5 aufgefangene Lösung in einen verstopften 10 kDa Zentrifugenfilter. Zentrifugieren bei 14.000 x g für 15 min. Verwerfen Sie die Fraktion, die durch den Filter geflossen ist.
    HINWEIS: Da die Viren im vorherigen Schritt mit 8 M Harnstoff im Filter zurückgehalten und inaktiviert werden, müssen diese und die folgenden Schritte nicht in der Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Dieser Vorgang muss wiederholt werden, wenn ein 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen verwendet wird, bis die gesamte Lösung aufgefangen ist, wie in Schritt 4.5, 1,2 ml durch den Filter fließen.
  7. Waschen Sie 3x mit 300 μl SELEX-Puffer, um den Harnstoff zu entfernen, indem Sie ihn 15 Minuten lang bei 14.000 x g zentrifugieren. Verwerfen Sie die Fraktion, die durch den Filter geflossen ist. Gewinnen Sie die Lösung im Filter zurück, indem Sie sie in einem sauberen Auffangröhrchen auf den Kopf stellen und 5 Minuten lang zentrifugieren.
  8. Messen Sie das Endvolumen der gewonnenen Lösung aus 4.7 mit einer Pipette in einem Kunststoffröhrchen. Diese Lösung heißt R ia, wobei i der runden Zahl entspricht. Typischerweise werden Volumina zwischen 30 μl und 50 μl erhalten. Nehmen Sie 1 μl der eluierten ssDNA, um die DNA-Menge mittels qPCR zu quantifizieren.
    HINWEIS: Dies ist ein möglicher Pausenpunkt, an dem die R1a-Probe bei −20 °C gehalten werden kann, um zu einem anderen Zeitpunkt fortzufahren.
  9. Führen Sie die PCR-Amplifikation wie unten beschrieben durch.
    1. Entnehmen Sie in der ersten Runde 90 % der R1a-Probe als PCR-Template. In den folgenden Runden werden 60 % des Gesamtvolumens in Schritt 4.8 zur Durchführung der PCR entnommen und die andere Fraktion bei -20 °C gelagert.
    2. Richten Sie eine 50-μl-PCR-Reaktion mit den folgenden Elementen mit der angegebenen Endkonzentration ein: 1x PCR-Reaktionspuffer, 200 μM dNTPs, 10 μl DNA-Template (R1a-Probe), 200 nM pro Primer und 1,25 U-Polymerase (2,5 U/μl Material).
    3. Optimieren Sie die PCR-Bedingungen, einschließlich der Anzahl der Zyklen und der Annealing-Temperatur für jeden Satz von Primern und ssDNA-Bibliotheken. Vermeiden Sie es, zu viele Zyklen zu verwenden, da dadurch unerwünschte PCR-Unterprodukte wie Primer-Dimere entstehen. Testen Sie verschiedene Glühtemperaturen basierend auf der Schmelztemperatur der Primer.
    4. Führen Sie die PCR unter optimierten Bedingungen bei 95 °C für 5 min durch, gefolgt von 18 Zyklen von 1 min bei 95 °C, 30 s bei 52 °C und 1 min bei 72 °C, mit einem letzten Erweiterungsschritt bei 72 °C für 10 min, um den dsDNA-Pool zu erhalten.
      HINWEIS: Dies ist ein weiterer möglicher Pausenpunkt, an dem das PCR-Produkt bei −20 °C aufbewahrt werden kann, um zu einem anderen Zeitpunkt fortzufahren.
  10. Gewinnung von ssDNA mit Hilfe von Streptavidin-modifizierten magnetischen Beads.
    1. Nehmen Sie 80% des PCR-Produkts. Die restliche Fraktion bei -20 °C lagern.
    2. Das PCR-Produkt wird in Aliquoten von 50 μl aufgeteilt und in Mikrofugenröhrchen gegeben, die 50 μl Streptavidin-modifizierte magnetische Beads (MB) enthalten. 30 Minuten bei leichtem Rühren (z. B. rotierendes Schüttelgerät) bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie dann das Mikrofugenröhrchen auf das magnetische Gestell, um das MB zu isolieren, und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren (es muss eine klare Lösung sein).
    3. Waschen Sie, indem Sie 200 μl Binde- und Waschpuffer in die Tube geben. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetgestell, klopfen Sie auf das Röhrchen und resuspendieren Sie das MB durch Pipettieren zu einer homogenen Lösung. Setzen Sie das Mikrofugenröhrchen wieder auf das magnetische Gestell, um das MB zu isolieren und den Überstand durch Pipettieren zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
    4. Nach dem Waschen resuspendieren Sie den MB in insgesamt 100 μl SELEX-Puffer und erhitzen Sie die Lösung 10 Minuten lang auf 95 °C. Legen Sie das Röhrchen sofort in das Magnetgestell, bevor das Röhrchen abkühlt, und nehmen Sie den Überstand mit dem ssDNA-Pool. Wiederholen Sie diesen Wiederherstellungsschritt und fügen Sie 50 μl SELEX-Puffer hinzu.
  11. Messen Sie das Endvolumen der zurückgewonnenen Fraktion ab 4.10 mit einer Pipette. Dieser Bruch wird R i xgenannt, wobei i der runden Zahl entspricht. In der Regel werden Volumina zwischen 140 und 150 μL erhalten. Nehmen Sie 1 μl R1x ein, um die DNA-Menge durch qPCR zu quantifizieren.

5. Nachfolgende Auswahlrunden

  1. Denaturieren Sie den ssDNA-Pool. 60 % der Probe R1x entnehmen und mit 50 μl SELEX-Puffer mischen. Bei 95 °C 15 min im Trockenbad erhitzen. Legen Sie das Röhrchen für 15 Minuten auf Eis.
  2. Inkubation des ssDNA-Pools mit dem nicht-infektiösen Virus und anderen potentiell störenden Viren (Schritt der Gegenauswahl). Mischen Sie den denaturierten ssDNA-Pool in SELEX-Puffer ab 5.1 mit 50 μL jedes Virus (5 x 109 Kopien/ml; z. B. nicht-infektiöses p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 und p-H5N1). 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Blockieren Sie unspezifische Stellen in Zentrifugenfiltern. Während Sie auf Schritt 5.2 warten, bereiten Sie die Zentrifugenfilter für die nächsten Schritte vor. Verwenden Sie in der Regel zwei Zentrifugenfilter, einen mit einer Abschaltung von 100 kDa und einen mit einer Abschaltung von 10 kDa. Gehen Sie wie in 4.3 vor.
  4. Waschen Sie die Sequenzen ab, die an Nicht-Zielviren gebunden sind. Das in Schritt 5.2 inkubierte Gemisch in einen verstopften 100 kDa Zentrifugenfilter geben. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 14.000 x g und gewinnen Sie die Fraktion zurück, die durch den Zentrifugenfilter fließt. 2x waschen, 100 μl SELEX-Puffer zugeben und bei 14.000 x g 10 min zentrifugieren. Bewahren Sie die Fraktion auf, die durch den Filter geflossen ist.
  5. Inkubation des ssDNA-Pools mit dem infektiösen Virus (positiver Selektionsschritt). Nehmen Sie die 300 μl der Fraktion aus Schritt 5.4 und mischen Sie sie mit 50 μl des infektiösen Virus (1 x 10,8 Kopien/ml). 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Führen Sie die Schritte 4.4 bis 4.11 aus.

6. Überwachung des SELEX-Prozesses

HINWEIS: Um die Anreicherung des Pools zu überwachen, wird die qPCR auf zwei Arten verwendet. Zunächst ist es durch absolute Quantifizierung möglich, die Anreicherung der Pools (Elutionsausbeute) zu testen. Zweitens kann durch die Beobachtung der Schmelzkurve die Diversität der Pools (Konvergenz der Aptamer-Spezies) bewertet werden30.

  1. Führen Sie alle qPCR-Assays mit einem Reaktionsvolumen von 10 μl in 96-Well-Platten durch, die für die qPCR entwickelt wurden.
  2. Bereiten Sie eine Standard-qPCR-Mischung vor, die 5 μl Mastermix, 0,3 μl 500 nM jedes unmarkierten Primers, 3,4 μlH2O und 1 μl DNA-Template enthält.
    1. Bereiten Sie Verdünnungen der gereinigten ssDNA-Bibliothek vor (Schritt 2.3), um die Standardkurve zu durchlaufen.
    2. Verdünnen Sie die DNA-Proben, damit ihre Konzentration in die Standardkurve passt. Bei Ria-Proben wird 1 μl der Probe ohne Verdünnung und 1 μl 1:10 Verdünnung in die qPCR-Mischung gegeben. Bei Rix-Proben sind Verdünnungen von 1:10 oder 1:100 einzuschließen.
  3. Führen Sie qPCR aus, indem Sie das folgende Protokoll festlegen. Stellen Sie zunächst einen ersten Denaturierungsschritt auf 98 °C für 2 min ein. Stellen Sie dann 40 Zyklen der Denaturierung bei 98 °C für 5 s und des Glühens und Dehnens bei 52 °C für 10 s ein. Stellen Sie abschließend eine Schmelzkurvenanalyse von 65 bis 95 °C ein. Bestimmen Sie Schwellenzykluswerte (Ct) durch automatisierte Schwellenwertanalyse.
  4. Quantifizieren Sie anhand der Standardkurve die Menge an ssDNA in R ia- und Rix-Proben.
  5. Berechnen Sie die Elutionsausbeute als die Menge der gebundenen DNA (Anzahl der Mole in R i a) geteilt durch die Menge der ursprünglichen DNA (Anzahl der Mole in Ri 1x). Tragen Sie die Elutionsausbeute im Vergleich zur runden Zahl auf, um zu sehen, ob eine Anreicherung über die Runden beobachtet wird.
  6. Zeichnen Sie die Schmelzkurven für verschiedene Runden. Mit zunehmender Anzahl der Runden wird eine Verschiebung zu höheren Schmelztemperaturen in der Spitze bei 75/85 °C erwartet. Das bedeutet, dass die Vielfalt des Pools abnimmt.

7. Hochdurchsatz-Sequenzierung

  1. Wenden Sie sich an die Hochdurchsatz-Sequenzierungseinrichtung, um zu erfahren, welche Sequenzierungstypen und -skalen verfügbar sind, die die Vorbereitungsmethode der Bibliothek bestimmen.
    HINWEIS: Bei dieser Entscheidung werden sowohl die Länge der zu sequenzierenden Pools (einschließlich der Primer) als auch die Anzahl der einzureichenden Pools berücksichtigt (im Allgemeinen sollten mindestens 1 x 105-10 6 Sequenzen pro Pool angestrebt werden). Wenn eine bestimmte Sequenzierungsskala nicht die gesamte Länge des Pools lesen kann, kann die Paarendsequenz verwendet werden, um von beiden Enden der Sequenz zu lesen, im Gegensatz zu einer Single-End-Sequenz, die nur von einem Ende liest.
  2. Wählen Sie in Absprache mit der Sequenziereinrichtung ein geeignetes, kommerziell erhältliches Kit basierend auf der Art der Sequenzierung aus. Bereiten Sie mehrere Pools von Auswahlrunden vor, die eine hohe, mittlere und niedrige Anreicherung darstellen, sowie den endgültigen Pool, indem Sie für jeden Pool ein anderes Indexpaar in den Adaptern verwenden, das die Stichprobenanalyse aller Runden mit einer Lane ermöglicht.
    HINWEIS: Die PCR-Amplifikation kann auch verwendet werden, um die für die Hochdurchsatzsequenzierung erforderlichen Adapter und Indizes einzubinden, aber dies kostet in der Regel ähnlich wie die kommerziellen Kits und ist nicht besser.
    1. Führen Sie die Bibliotheksvorbereitung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen: Endreparatur der fragmentierten DNA, Adaptorligatur und PCR-Amplifikation, um die endgültigen Bibliotheken herzustellen.
    2. Reinigen Sie das PCR-Produkt gemäß den Anweisungen des Herstellers mit magnetischen DNA-Reinigungskügelchen.
    3. Quantifizieren Sie die DNA mit einem fluoreszenzbasierten Quantifizierungskit. Vermeiden Sie die Verwendung weniger genauer Methoden, wie z. B. UV-Messungen in kleinen Mengen.
    4. Mischen Sie ungefähr gleiche Mengen (nach DNA-Menge, nicht nach Volumen) jeder Poolbibliothek, die bestimmte Indizes enthält.
    5. Überprüfen Sie die Qualität der endgültigen Bibliothek mit qPCR-Quantifizierung und einem DNA-Fragmentanalysator. Dieser Schritt wird häufig von der Sequenziereinrichtung durchgeführt.
      HINWEIS: Das Personal der Sequenzierungseinrichtung kann nützliche Informationen darüber geben, wie die Bibliothek vorzubereiten ist und welche Qualitätskontrollen vorgeschlagen werden. Vor der Vorbereitung der Bibliotheken ist eine Diskussion mit ihnen erforderlich.
  3. Senden Sie die vorbereitete endgültige Bibliothek entsprechend den Anforderungen an die Sequenzierungseinrichtung.

8. Sequenzierungsanalyse

  1. Die meiste Software, die für die Sequenzanalyse verfügbar ist, ist für die Ausführung über die Befehlszeile unter einem Linux-Betriebssystem konzipiert. Richten Sie bei kleinen Datensätzen das gewünschte Linux-Betriebssystem ein und installieren Sie die erforderlichen Programme auf einem PC. Bei größeren Datensätzen wird die HTS-Analyse auf High-Performance-Computing-Ressourcen oder Supercomputern (empfohlen) ausgeführt.
    HINWEIS: Für die Nutzung von High-Performance-Computing-Ressourcen sind Zugriff und Schulung erforderlich, was einige Zeit dauern kann. Darüber hinaus sind Grundkenntnisse in der Verwendung der UNIX-Befehlszeile erforderlich. Viele kostenlose Ressourcen zur grundlegenden Verwendung der Befehlszeile sind online verfügbar, und die Computerressourcen werden wahrscheinlich zusätzliche Informationen für die Verwendung ihrer Systeme bereitstellen.
  2. Greifen Sie auf die Sequenzierungsdateien zu, in der Regel in einem komprimierten FastQ-Dateiformat, indem Sie die von der Sequenzierungseinrichtung bereitgestellten Informationen verwenden.
    1. Verwenden Sie einen FTP-Client, um die Dateien auf Ihren eigenen Computer und/oder die High-Performance-Computing-Ressource zu übertragen. Viele Sequenzanalyseprogramme können komprimierte Dateien direkt verwenden, halten Sie die Dateien also nach Möglichkeit komprimiert, um ihre Dateigröße zu begrenzen (große Sequenzlesevorgänge von 50 M+ Sequenzen können 100 Gb+ Speicherplatz beanspruchen, wenn sie unkomprimiert sind).
    2. Wenn Sequenzdateien dekomprimiert werden müssen, verwenden Sie die gzip-Funktion, die bei den meisten Linux-Installationen Standard ist. Zusätzliche Informationen über gzip und seine Optionen erhalten Sie aus dem installierten Handbuch, indem Sie "man gzip" in die Befehlszeile eingeben.
  3. Bereinigen Sie die Sequenzen vor der Analyse durch Demultiplexing, Entfernen der Sequenzierungsadapter, Entfernen von Lesevorgängen mit geringer Qualität und Einschließen von Lesevorgängen in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung.
    1. Verwenden Sie das FastQC-Programm31 nach jedem der folgenden Schritte, um grundlegende Informationen zur Qualitätskontrolle über die Sequenzen zu erhalten, um die Wirksamkeit der einzelnen Bereinigungsschritte zu bewerten.
    2. Demultiplexen Sie die Sequenzen, um alle Sequenzen aus einer einzelnen Lesedatei in die verschiedenen Pools zu trennen, basierend auf den Indizes, die in den Sequenzierungsadaptern enthalten sind. Dieser Schritt wird häufig von der Sequenziereinrichtung durchgeführt, die konsultiert werden sollte, da das genaue Verfahren von der verwendeten Sequenziermaschine abhängt.
    3. Entfernen Sie die Sequenzierungsadapter mit dem Befehlszeilenprogramm Cutadapt32. Verwenden Sie die Auswahlprimer (anstelle von Sequenzierungsadaptern) als Eingabe im Modus "Verknüpfter Adapter". Verwenden Sie die Option --discard-untrimmed, um alle Sequenzen zu verwerfen, die die Auswahlprimer nicht enthalten.
    4. Legen Sie Optionen für die maximale Fehlerrate fest, die den Adaptern entspricht, sowie für die minimale und maximale Länge der zu akzeptierenden Sequenzen. Wenn Sie gekoppelte Endlesevorgänge verwenden, geben Sie bestimmte verfügbare Parameter ein und geben Sie sowohl die Sequenzdateien Read 1 als auch Read 2 an. Stellen Sie bei Bedarf zusätzliche Parameter ein, indem Sie sich auf das Cutadapt-Handbuch32 beziehen.
      HINWEIS: Die Ligatur von Sequenzierungsadaptern an Pools ist richtungsunabhängig und umfasst etwa 50 % der Sequenzen in Vorwärtsrichtung und 50 % in Rückwärtsrichtung. Um zu vermeiden, dass die 50 % der Sequenzen in umgekehrter Richtung verloren gehen, kann Cutadapt ein zweites Mal ausgeführt werden, wobei das umgekehrte Komplement der Auswahlprimer als Eingaben verwendet wird.
    5. (Optional) Wenn Paired-End-Sequenzierung verwendet wird, führen Sie die Dateien Read 1 und Read 2 mit dem Programm PEAR33 zusammen.
    6. Verwenden Sie das FASTX-Toolkit-Programm34 , um Sequenzen von geringer Qualität zu entfernen, die bei jedem Nukleotid eine Qualität unterhalb eines bestimmten Schwellenwerts aufweisen. Ein Qualitäts-Cut-off-Score von 30 ist ein guter Ausgangspunkt. Wenn die Gesamtqualität im Allgemeinen gut ist, kann dieser Schritt übersprungen werden.
    7. Um die Sequenzdateien in umgekehrter Richtung mit denen in Vorwärtsrichtung zusammenzuführen, verwenden Sie das FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement Funktion für die Dateien in umgekehrter Richtung. Verwenden Sie dann das eingebaute cat-Programm (Standard bei den meisten Linux-Installationen), um die Vorwärts- und Rückwärtskomplement-Rückwärtsdateien in einer einzigen Datei zusammenzuführen.
  4. Um die Anreicherung von Sequenzen über verschiedene Selektionspools hinweg zu analysieren, verwenden Sie das Analyse-Toolkit FASTAptamer35.
    1. Verwenden Sie FASTAptamer-Count, um zu zählen, wie oft jede Sequenz angezeigt wird. Ordnen und sortieren Sie dann die Sequenzen nach Häufigkeit. Die count-Ausgabedatei wird als Eingabe für alle anderen FASTAptamer-Programme benötigt.
    2. Verwenden Sie FASTAptamer-Clust, um alle Sequenzen in einer Datei in Clustern eng verwandter Sequenzen zu gruppieren. Verwenden Sie den Parameter "distance", um die Anzahl der Einzelnukleotidmutationen oder Indels zu definieren, die sich zu einem Cluster gruppieren dürfen.
      HINWEIS: Das FASTAptamer-Clust-Programm kann sehr rechenintensiv sein, wenn eine große Anzahl eindeutiger Sequenzen vorhanden ist (insbesondere für frühe Runden), was Tage oder sogar Wochen dauern kann, bis es vollständig abgeschlossen ist. Der Parameter Cut-Off-Filter kann verwendet werden, um Sequenzen mit geringer Häufigkeit von der Clusterbildung auszuschließen. Im Allgemeinen ist es gut, mit einem höheren Grenzwert zu beginnen, z. B. 10 oder 5 Lesevorgänge pro Million (RPM), und ihn zu verringern, wenn das Programm schnell beendet wird. Wenn die Pools sehr heterogen sind, ist es möglicherweise nicht möglich, die Sequenzen in einem angemessenen Zeitrahmen zu clustern.
    3. Verwenden Sie FASTAptamer-Enrich, um die Anreicherung jeder Sequenz zu berechnen, die in mehr als einer Runde der Auswahl vorhanden ist. Vergleichen Sie die Drehzahl der Sequenz aus einer Grundgesamtheit mit der Drehzahl in einer anderen. Verwenden Sie das Programm "Anreichern" entweder für die Count- oder die Cluster-Datei. Die Ausgabe ist eine tabulatorgetrennte Datei (.tsv), die zur weiteren Analyse und einfachen Sortierung in jeder Tabellenkalkulationssoftware geöffnet werden kann.
      HINWEIS: Das Programm FASTAptamer-Enrich kann auch sehr rechenintensiv sein, wenn eine große Anzahl eindeutiger Sequenzen vorhanden ist. Der Parameter Cut-Off-Filter kann verwendet werden, um Sequenzen mit geringer Häufigkeit von der Ausgabe auszuschließen, um Dateien zu vermeiden, die zu groß sind, um sie in einer Tabellenkalkulationssoftware zu öffnen.
    4. (Optional) Wenn viele Pools zu heterogen sind (viele eindeutige Sequenzen und wenige doppelte Sequenzen), ist es möglicherweise nicht möglich, die Programme Clust oder Enrich zu verwenden. Führen Sie in diesem Fall eine manuelle Anreicherungsprüfung mit der Count-Ausgabedatei durch, die Sequenzen nach Häufigkeit sortiert (am häufigsten oben genannt) und den Sequenzbezeichner umbenennt, um wichtige Informationen wie RPM einzuschließen.
      1. Verwenden Sie das Standard-Linux-Programm "head" für die Count-Dateien, um eine Liste der am häufigsten vorkommenden Sequenzen zu erhalten. Verwenden Sie dann das Standard-Linux-Programm "grep", um jede der am häufigsten vorkommenden Sequenzen in den Count-Dateien aller anderen relevanten Pools zu durchsuchen. Wenn Übereinstimmungen vorhanden sind, verwenden Sie den geänderten Sequenzbezeichner, um die RPM in diesem Pool zu bestimmen und die Anreicherungsinformationen manuell zu erstellen.
        HINWEIS: Skripte für alle Schritte der Sequenzierungsanalyse finden Sie in den ergänzenden Kodierungsdateien 1-11.

9. Validierung der Aptamer-Bindung und Assays

  1. Identifizieren Sie anhand der durch die Sequenzanalyse erhaltenen Anreicherungsinformationen Aptamer-Kandidatensequenzen auf der Grundlage von Sequenzen, die in den nachfolgenden Auswahlrunden die größte Anreicherung und/oder die am häufigsten vorkommenden Sequenzen in der letzten Auswahlrunde aufweisen. Wählen Sie mehrere verschiedene Kandidatensequenzen (mindestens 10-20) für weitere Tests aus, da die am stärksten angereicherten Aptamere nicht unbedingt die leistungsstärksten Aptamere sind.
  2. Führen Sie ein erstes Screening von Aptamerkandidaten mit einem Bindungsassay durch, der schnell für mehrere Proben durchgeführt werden kann. Ein säulenbasierter Ultrafiltrations-Bindungsassay36 oder ein Enzyme-linked Oligonukleotid-Assay (ELONA) sind gute Methoden für dieses erste Screening.
  3. Analysieren Sie die Spezifität und Affinität der Sequenzen, die die beste Bindungsaktivität aus dem ersten Screening zeigen, unter Verwendung von mindestens zwei unabhängigen Bindungsassays (z. B. MicroScale Thermophorese (MST)37,38, Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay (ELONA)39, Oberflächenplasmonenresonanz 40 oder Bioschichtinterferometrie (BLI)41).

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Representative Results

Da DNA-Aptamere unter Verwendung von SELEX in einem Reagenzglas15 gewonnen werden können, wurde diese SELEX-Strategie sorgfältig entwickelt, um sowohl positive Selektionsschritte in Richtung des intakten, vollständigen infektiösen Virus (d. h. die Beibehaltung der DNA-Moleküle, die an das infektiöse Virus binden) als auch Gegenauswahlschritte für dasselbe Virus zu umfassen, das durch eine bestimmte Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurde. insbesondere UV-Behandlung, indem die DNA-Sequenzen, die an das nicht-infektiöse Virus binden können, verworfen werden. Eine schematische Darstellung des Auswahlprozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.

Als repräsentative Ergebnisse dieses Protokolls wählten wir die Auswahl eines Aptamers für infektiöses SARS-CoV-2. Aufgrund der Anforderung der Arbeitsbedingungen der Biosicherheitsstufe 3 (BSL3) für den Umgang mit dem intakten, infektiösen SARS-CoV-2 haben wir uns stattdessen für die Arbeit mit einem pseudotypisierten Virus entschieden. Pseudotypisierte Viren werden aus einem relativ harmlosen Rückgratvirus, in diesem Fall einer Art von Lentivirus (HIV), erzeugt, das so modifiziert wurde, dass es das Oberflächenprotein eines anderen Virus von Interesse in seiner Virushülle zeigt, so dass es die Oberfläche und den Eintrittsmechanismus des gewünschten Virus genau nachahmen kann, ohne die Risiken, die mit der Arbeit mit gefährlichen menschlichen Krankheitserregern verbunden sind. Wichtig ist, dass diese Pseudoviren so modifiziert werden, dass sie bei kontinuierlicher Virusreplikation defekt sind25,42. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene pseudotypisierte Viren verwendet: p-SARS-CoV-2, bei dem SARS-CoV-2 Spike (S)-Proteine in die Hülle eingebaut werden; p-SARS-CoV-1, das das SARS-CoV-1-Spike-(S)-Protein enthält; und p-H5N1, das Hämagglutinin und Neuraminidase enthält, die aus dem hochpathogenen Stamm des aviären Influenzavirus A/Goose/Qinghai/59/05 (H5N1) isoliert wurden.

In den ersten beiden Selektionsrunden wurde kein Gegenselektionsschritt durchgeführt, um die unspezifische Entfernung von DNA-Bindern zu minimieren, die typischerweise nur als Einzelkopien in den ersten Runden vorhanden sind. Nach den ersten beiden Runden wurden in jeder Runde Positiv- und Gegenselektionsschritte aufgenommen, um eine hohe Selektivität zu erreichen. Für die Gegenselektion wurden p-SARS-CoV-2, das durch UV-Behandlung nicht infektiös gemacht worden war, sowie p-SARS-CoV-1 und p-H5N1 verwendet, um Selektivität gegen andere Viren zu erreichen.

Um den Selektionsfortschritt zu überwachen, wurde die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) eingesetzt. Diese Technik stellt ein einfaches Verfahren dar, das keine Beschriftung des Pools erfordert und im Allgemeinen auf praktisch jedes Ziel30 angewendet werden kann. Es macht sich zwei Merkmale der qPCR-Technik zunutze. Erstens die Möglichkeit der absoluten Quantifizierung unter Verwendung einer Standardkurve zur Berechnung der Elutionsausbeute, definiert durch die an das infektiöse Virus gebundene ssDNA über die gesamte zugesetzte ssDNA. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Elutionsausbeute zunächst mit jeder frühen Runde von SELEX zunahm und sich in den Runden 8 und 9 (R8 und R9) einpendelte, was auf eine Anreicherung der Pools in Sequenzen hindeutet, die an das infektiöse Virus binden (Abbildung 2A). Zweitens liefern Schmelzkurven jeder Runde des DNA-Pools einen weiteren Beweis für die Sequenzvielfalt der Pools30. Durch den Vergleich der Schmelzkurven kann eine Verschiebung vom Peak bei hoher Schmelztemperatur (T m) von 77 °C auf 79 °C beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass der DNA-Pool von zufälligen Sequenzen mit niedrigem T m zu konservierteren Sequenzen mit höherem T m konvergiert ist (Abbildung 2B). Darüber hinaus tritt in den letzten Runden (R8 und R9) ein Peak bei niedrigem Tm (~70 °C) auf. Dies könnte mit der Produktion von Primer-Dimeren während der PCR zusammenhängen. Eine mögliche Lösung, um dies zu vermeiden, besteht darin, die Anzahl der Zyklen während der PCR zu reduzieren (z. B. von 18 Zyklen auf 12 oder 15 Zyklen).

Nachdem wir eine Anreicherung des Pools durch qPCR bestätigt hatten, verwendeten wir Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS) für die Runden 3, 5, 7, 8 und 9 der SELEX, um herauszufinden, welche Sequenzen für die Bindung des Virusziels verantwortlich sind. Im Vergleich zu herkömmlichen Klonierungs-Sequenzierungsverfahren ermöglicht HTS die Überwachung der Entwicklung einzelner Sequenzen über mehrere Selektionsrunden, um schließlich die Aptamersequenzen zu identifizieren, die in den folgenden Runden angereichert werden. Abbildung 3A zeigt die relative Häufigkeit (in Reads per Million) für die Sequenz SARS2-AR10, die über aufeinanderfolgende Auswahlrunden ermittelt wurde. Die Sekundärstruktur von SARS2-AR10 wird von der Mfold-Software vorhergesagt, und die Ergebnisse (Abbildung 3B) zeigen eine strukturierte Sekundärstruktur, die eine Stammschleifenregion enthält, die möglicherweise an der Erkennung des Virus beteiligt ist. Eine weitere Charakterisierung der Affinitätsbindung dieser Sequenz wurde bereits berichtet22. Die mikroskalige Thermophorese (MST) und ein enzymverknüpfter Oligonukleotid-Assay (ELONA) zeigten, dass das SARS2-AR10-Aptamer mit einem Kd = 79 ± 28 nM an das infektiöse p-SARS-CoV-2 bindet und nicht an das nicht-infektiöse p-SARS-CoV-2 oder an andere Coronaviren wie p-SARS-CoV-1 und 229E.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des SELEX-Prozesses von Aptameren zur Unterscheidung von infektiösen und nicht-infektiösen Viren. Nach der zweiten Runde wurden in jeder Runde Positiv- und Gegenauswahlschritte hinzugefügt, um eine hohe Spezifität gegenüber dem infektiösen Virus zu erreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Überwachung des SELEX-Verlaufs infektiöser SARS-CoV-2-spezifischer Aptamere. (A) Quantifizierung der Elutionsausbeute (d.h. der gebundenen ssDNA über der hinzugefügten ssDNA) für jede Runde von SELEX mittels qPCR. (B) Schmelzkurve für die verschiedenen Becken während der SARS-CoV-2-Aptamerauswahl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Anreicherung und Sekundärstruktur des SARS2-AR10-Aptamers. Lesevorgänge pro Million (RPM), die durch die Analyse der HTS-Daten für die SARS2-AR10-Sequenz in Abhängigkeit von den Auswahlrunden unter Verwendung von FASTAptamer-Count ermittelt wurden. Einschub: Die prognostizierte stabilste Sekundärstruktur der SARS2-AR10-Sequenz basierend auf der UNAFold-Software. Die Berechnungen wurden bei 25 °C, 100 mM NaCl und 2 mM MgCl2durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Name DNA-Sequenz (5′ bis 3′)
T20 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
DNA-Bibliothek ACCGTCAGTTACAATGCT- N45 -GGCTGGACTATCTGTGTA
Vorwärts-Primer (FwdP) ACCGTCAGTTACAATGCT
Reverse Primer (RevP) Biot-TACACAGATAGTCCAGCC
SARS-AR10 CCCGACCAGCCACCATCAACTCTTCCGCGTCCATCCCTGCTG
N: ein zufälliges Nukleotid darstellen; Biot: Biotin-Modifikation im 5'-Ende.

Tabelle 1: Liste der DNA-Sequenzen.

Ergänzende Kodierungsdatei 1: Cutadapt_script.txt identifiziert alle Sequenzen in einer bestimmten Eingabedatei, die die angegebenen Vorwärts- und Rückwärtsprimer enthalten, verwirft alle Primer, die nicht über die Primer verfügen, und entfernt die Primer aus den Sequenzen, die sie enthielten. Siehe Referenz31 für weitere Informationen zu Cutadapt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 2: FASTAptamer_cluster_script.txt gruppieren alle Sequenzen aus einer einzelnen Zähldatei in Familien/Cluster eng verwandter/ähnlicher Sequenzen. Dies ist nützlich, wenn eine Kandidatensequenz identifiziert wird, so dass auch andere ähnliche Sequenzen im selben Cluster als potenzielle Kandidaten identifiziert werden können. Weitere Informationen zu FASTAptamer finden Sie in Referenz34 . Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 3: FASTAptamer_count_script.txt zählen die Anzahl der Vorkommen jeder eindeutigen Sequenz aus einer gegebenen FASTA/FASTQ-Eingabedatei und erzeugen eine Ausgabedatei jeder eindeutigen Sequenz in absteigender Reihenfolge (höchste Häufigkeit bis niedrigste Häufigkeit). Die Count-Ausgabedateien werden als Eingaben für alle anderen FASTAptamer-Programme benötigt. Weitere Informationen zu FASTAptamer finden Sie in Referenz34 . Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 4: FASTAptamer_enrich_script.txt vergleicht alle Sequenzen aus zwei oder drei beliebigen Eingabedateien, gibt die Fülle aller eindeutigen Sequenzen zwischen allen Dateien an und gibt alle Kombinationen von paarweisen Anreicherungswerten (in RPM) aller Sequenzen an, die in mehreren Dateien gefunden wurden. Weitere Informationen zu FASTAptamer finden Sie in Referenz34 . Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 5: fastqc_script.txt ist ein Qualitätskontrolltool für FastQ-Dateien, das leicht lesbare Qualitätsinformationen für Sequenzierungsdaten mit hohem Durchsatz bereitstellt, z. B. Duplizierungsstufen, Leselängen und Qualitätsbewertungen. Siehe Referenz30 für weitere Informationen zu FastQC. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 6: FASTX_fwd_rev_merge_script.txt verwendet das FASTX-Toolkit, um das Reverse-Komplement aller Sequenzen aus einer gegebenen Reverse-Datei auszugeben. Es verwendet dann den Befehl cat (Standard in den meisten UNIX-Betriebssystemen), um diese umgekehrte Reverse-Komplement-Datei mit einer gegebenen Vorwärtsdatei von Sequenzen zusammenzuführen, um eine einzige Datei mit allen Sequenzen zu erhalten. Siehe Referenz33 für weitere Informationen zum FASTX-Toolkit. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 7: FASTX_quality_filter_script.txt verwendet das FASTX-Toolkit, um die Qualität von Sequenzen in einer bestimmten FastQ-Datei zu überprüfen, und kann alle Sequenzen verwerfen, die von geringer Qualität sind. Diese Methode ist im Allgemeinen besser als Trimmmethoden der Qualitätsfilterung für die Analyse von In-vitro-Selektionssequenzen . Beim Trimmen werden Basen (in der Regel in der Nähe der Enden) von Sequenzen entfernt, die auf geringer Qualität basieren, was für die genomische Sequenzierung akzeptabel ist, aber da die gesamte Sequenz für funktionelle DNA benötigt wird, ist das Trimmen der Enden nicht sinnvoll. Wenn stattdessen zu viele Basen einer Sequenz von geringer Qualität sind, wird die gesamte Sequenz verworfen. Siehe Referenz33 für weitere Informationen zum FASTX-Toolkit. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 8: grep_searcher_script.txt wird verwendet, um nach einer bestimmten Eingabesequenz in einer bestimmten Eingabedatei zu suchen und sowohl die ID als auch die Sequenz in einer Ausgabedatei auszugeben (falls sie in der Eingabe gefunden wurde). Dieses Skript ist nützlich für Pools, die sehr heterogen sind (d. h. viele eindeutige Sequenzen haben), die dazu führen, dass FASTAptamer Clust zu lange braucht, um ordnungsgemäß ausgeführt zu werden, und dazu führen, dass FASTAptamer Enrich-Dateien zu groß sind, um sie in typischen Tabellenkalkulationsprogrammen zur Analyse zu öffnen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 9: gzip_compress_decompress_script.txt verwendet Gzip, um Dateien zu komprimieren oder zu dekomprimieren. An eine komprimierte Datei wird in der Regel eine .gz Erweiterung an den Dateinamen angehängt. Es wird empfohlen, große Dateien zu komprimieren, um Speicherplatz zu sparen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 10: PEAR_script.txt wird nur für Paired-End-Sequenzierungsdateien verwendet und führt die Read 1-Datei mit der entsprechenden Read 2-Datei zusammen. Siehe Referenz32 für weitere Informationen zu PEAR. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 11: tar_extraction_creation_script.txt extrahiert oder erstellt Tar-Archive, die verwendet werden, um mehrere Dateien und/oder Verzeichnisse in einer einzigen Datei zusammenzustellen. Sie werden auch oft komprimiert, um die Dateigröße zu reduzieren, wie z. B. bei der bz2-Komprimierung, wie in diesem Skript enthalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

SELEX ermöglicht nicht nur die Identifizierung von Aptameren mit hoher Affinität, im pM-nM-Bereich 22,43,44,45, sondern auch mit hoher und abstimmbarer Selektivität. Durch die Ausnutzung der Counter-Selektion können Aptamere mit anspruchsvoller Selektivität erhalten werden. So hat die Li-Gruppe beispielsweise gezeigt, dass sie in der Lage ist, Sequenzen zu erhalten, mit denen pathogene Bakterienstämme von nicht-pathogenen Stämmen unterschieden werden können21. Außerdem identifizierten Le et al. ein Aptamer, das in der Lage ist, Serotypen von Streptococcus pyogenes-Bakterien zu differenzieren46. Dies eröffnet die Möglichkeit, Aptamer-Moleküle mit einzigartiger Selektivität in verschiedene funktionelle DNA-Sensoren 12,47,48,49,50 mit neuen Nanotechnologien22,51,52 zu integrieren, um Sensoren für verschiedene Anwendungen zu konstruieren, z. B. für tragbare und schnelle diagnostische Tests oder für die Umweltdetektion.

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht es, Aptamere mit hoher Selektivität für ein infektiöses Virus gegenüber demselben Virus zu erhalten, das inaktiviert wurde und somit nicht infektiös ist. Um eine solche Selektivität zu erreichen, basiert der SELEX-Ansatz in dieser Arbeit auf dem Design des Zählerauswahlschritts. Zunächst muss für einen erfolgreichen Zählerauswahlschritt eine korrekte Auswahl und Charakterisierung von Nicht-Zielproben durchgeführt werden. Diese Methode hängt also davon ab, mit bekannten infektiösen und nicht-infektiösen intakten Virusbeständen zu beginnen. Zweitens wird in jeder Runde der Selektion nach der ersten Runde ein Gegenselektionsschritt eingebaut, um von Beginn der Selektion an strenge Bedingungen anzuwenden und die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, Aptamere zu identifizieren, die zwischen den geringfügigen Unterschieden in der Oberfläche des Viruspartikels und dem infektiösen und nicht-infektiösen Zustand desselben Virus unterscheiden können.

In diesem Protokoll liegt der Fokus auf der Selektivität des Aptamers. Wenn stärkere Aptameraffinitäten erforderlich sind, ist es möglich, die Stringenz des Prozesses nach bestimmten SELEX-Runden zu erhöhen. Durch die Verringerung der infektiösen Viruskonzentration und der Inkubationszeit während der positiven Selektion ist es beispielsweise möglich, Aptamere mit einer stärkeren Bindungsaffinität zu erhalten44.

Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Entwicklung des SELEX-Protokolls ist die endgültige Probe, in der das Aptamer appliziert wird. Virenspezifische Aptamere werden in der Regel in komplexe Proben (z. B. Serum-, Speichel- und Echtwasserproben) eingebaut, und dies muss bei der Aptamerauswahl berücksichtigt werden, um die Chance zu erhöhen, funktionelle Aptamere in den endgültigen Proben zu erhalten. Daher ist es wichtig, SELEX in einem Puffer durchzuführen, der diese Proben genau nachahmt, insbesondere im Hinblick auf Kationenkonzentration und pH-Wert. Für das SARS-CoV-2-Aptamer haben wir beispielsweise PBS-Puffer (pH 7,4) mit 2 mM MgCl 2 und 0,5 mM CaCl2 gewählt, um biologische Proben genau nachzuahmen. Wenn andere Spezies in den Proben, in denen das Aptamer appliziert wird, potenziell mit dem Ziel konkurrieren können, um das Aptamer zu binden, ist es außerdem möglich, die Interferenz durch diese Spezies zu minimieren, indem sie in den Gegenselektionsschritt einbezogen werden, um Sequenzen zu eliminieren, die diese Spezies binden könnten.

Die erfolgreichen Ergebnisse dieses SELEX-Verfahrens22, das auf verschiedene Viren (Adenovirus und SARS-CoV-2) und verschiedene Inaktivierungsmethoden (UV-Behandlung und freies Chlor) angewendet wurde, deuten darauf hin, dass diese Methode auf andere Viren und andere Inaktivierungsmethoden angewendet werden kann, was in Zukunft ein breites Anwendungsspektrum eröffnet. Aptamere, die infektiöse Viren unterscheiden, haben nicht nur Potenzial für diagnostische Anwendungen zur Identifizierung von Patienten, die noch ansteckend sind, sondern auch für Umweltanwendungen, bei denen die Probe als kontaminiert definiert wird, wenn die Erreger in diesen Proben noch aktiv sind. Die Integration von Aptameren mit der Fähigkeit, infektiöse Viren in schnelle Sensoren zu identifizieren, bietet daher Möglichkeiten zur Überwachung von Desinfektionsbehandlungen.

Darüber hinaus war es möglich, den Infektiositätsstatus des Virus zu differenzieren, ohne Informationen über die strukturellen Unterschiede zwischen den beiden Infektiositätszuständen zu erhalten. Die einzige Information, die benötigt wird, ist zu wissen, dass die Unterschiede zwischen beiden Zuständen mit Unterschieden in der Struktur von Molekülen auf der Oberfläche intakter Viruspartikel zusammenhängen. Daher sind wir zuversichtlich, dass derselbe Ansatz zur Unterscheidung von Varianten und Serotypen desselben Virus verwendet werden kann, wobei die Unterschiede auf kleine Mutationen in den Resten von Proteinen auf der Oberfläche von Viruspartikeln zurückzuführen sind, ähnlich denen, die den Infektiositätsstatus des Virus unterscheiden. Wir stellen uns zum Beispiel vor, dass es möglich sein wird, Aptamere zu erhalten, die spezifisch für besorgniserregende Varianten von SARS-CoV-2 oder anderen Viren wie Influenza sind, was die Möglichkeit einer schnellen Überwachung von Varianten eröffnet, die die größte Bedrohung für die Gesellschaft darstellen.

Da die SELEX-Strategie zur Gewinnung von Aptameren, die infektiöse von nicht-infektiösen Viren unterscheiden können, kein Vorwissen darüber erfordert, welche spezifischen strukturellen Unterschiede zwischen ihnen vorhanden sind, könnte es möglich sein, Aptamere mit dieser Selektivität zu verwenden, um die spezifischen Oberflächenveränderungen zu identifizieren, die für den Verlust der Infektiosität durch verschiedene Desinfektionsmethoden verantwortlich sind, indem die Bindungsziele unserer Aptamere detailliert charakterisiert und identifiziert werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Frau Laura M. Cooper und Dr. Lijun Rong von der University of Illinois in Chicago für die Bereitstellung der in diesem Protokoll verwendeten Pseudovirusproben (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1) sowie Dr. Alvaro Hernandez und Dr. Chris Wright von der DNA Services Facility des Roy J. Carver Biotechnology Center an der University of Illinois at Urbana-Champaign für ihre Unterstützung bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung. und viele Mitglieder der Lu-Gruppe, die uns bei der In-vitro-Selektion und Aptamer-Charakterisierungstechniken geholfen haben. Diese Arbeit wurde durch einen RAPID-Zuschuss der National Science Foundation (CBET 20-29215) und einen Seed-Zuschuss des Institute for Sustainability, Energy, and Environment an der University of Illinois at Urbana-Champaign und des Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965) unterstützt. A.S.P. dankt dem PEW Latin American Fellowship für die finanzielle Unterstützung. Wir danken auch der Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) für die Unterstützung des Forschungsprogramms der Lu-Gruppe an der University of Texas in Austin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioengineering Heft 187 In-vitro-Selektion Aptamer viraler Infektiositätsstatus Counter-Selektion intaktes Virus
In-vitro-Selektion von Aptameren zur Unterscheidung von infektiösen und nicht-infektiösen Viren
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Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., … More

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).

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