Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro-val av aptamerer för att skilja infektiösa från icke-infektiösa virus

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin
* These authors contributed equally

Summary

Vi tillhandahåller ett protokoll som generellt kan tillämpas på utvalda aptamerer som endast binder till infektiösa virus och inte till virus som har gjorts icke-infektiösa genom en desinfektionsmetod eller till andra liknande virus. Detta gör det möjligt att fastställa smittsamhetsstatus i bärbara tester och snabbtester.

Abstract

Virusinfektioner har stor inverkan på samhället; De flesta detektionsmetoder har svårt att avgöra om ett upptäckt virus är smittsamt, vilket orsakar förseningar i behandlingen och ytterligare spridning av viruset. Att utveckla nya sensorer som kan informera om smittbarheten hos kliniska eller miljömässiga prover kommer att möta denna ouppfyllda utmaning. Men mycket få metoder kan få avkänningsmolekyler som kan känna igen ett intakt infektiöst virus och skilja det från samma virus som har gjorts icke-infektiöst genom desinfektionsmetoder. Här beskriver vi ett protokoll för att välja aptamerer som kan skilja infektiösa virus mot icke-infektiösa virus med hjälp av systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX). Vi drar nytta av två funktioner i SELEX. För det första kan SELEX skräddarsys för att ta bort konkurrerande mål, såsom icke-infektiösa virus eller andra liknande virus, med hjälp av räknarval. Dessutom kan hela viruset användas som mål för SELEX, istället för till exempel ett viralt ytprotein. Hela viruset SELEX möjliggör val av aptamerer som binder specifikt till virusets ursprungliga tillstånd, utan att viruset behöver störas. Denna metod gör det således möjligt att erhålla igenkänningsmedel baserat på funktionella skillnader i patogenernas yta, som inte behöver vara kända i förväg.

Introduction

Virusinfektioner har enorma ekonomiska och samhälleliga effekter runt om i världen, vilket blev alltmer uppenbart från den senaste COVID-19-pandemin. Snabb och korrekt diagnos är avgörande för att behandla virusinfektioner samtidigt som man förhindrar spridning av virus till friska människor. Medan många virusdetekteringsmetoder har utvecklats, såsom PCR-tester1,2 och inmunoassays3, kan de flesta av de för närvarande använda metoderna inte avgöra om det upptäckta viruset faktiskt är infektiöst eller inte. Detta beror på att närvaron av komponenter av viruset ensamt, såsom viral nukleinsyra eller proteiner, inte indikerar att det intakta, infektiösa viruset är närvarande, och nivåer av dessa biomarkörer har visat dålig korrelation med infektivitet 4,5,6. Till exempel har viralt RNA, som vanligtvis används för de nuvarande PCR-baserade COVID-19-testerna, mycket låga nivåer i de tidiga stadierna av infektion när patienten är smittsam, medan RNA-nivån ofta fortfarande är mycket hög när patienter har återhämtat sig från infektionen och inte längre är smittsamma 7,8. De virala protein- eller antigenbiomarkörerna följer en liknande trend, men uppträder vanligtvis ännu senare än viralt RNA och är därför ännu mindre prediktiva för infektionsförmåga 6,9. För att hantera denna begränsning har vissa metoder som kan informera om virusets infektionsstatus utvecklats, men är baserade på cellodlingsmikrobiologiska tekniker som kräver lång tid (dagar eller veckor) för att få resultat 4,10. Genom att utveckla nya sensorer som kan informera om smittbarheten hos kliniska prover eller miljöprover kan man undvika förseningar i behandlingen och ytterligare spridning av viruset. Men mycket få metoder kan få avkänningsmolekyler som kan känna igen en intakt infektiös virion och skilja den från samma virus som har gjorts icke-infektiös.

I detta sammanhang är aptamerer särskilt väl lämpade som ett unikt biomolekylärt verktyg11,12,13,14. Aptamerer är korta, enkelsträngade DNA- eller RNA-molekyler med en specifik nukleotidsekvens som gör att de kan bilda en specifik 3D-konformation för att känna igen ett mål med hög affinitet och selektivitet15,16. De erhålls genom en kombinatorisk urvalsprocess som kallas systematisk evolution av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX), även känd som in vitro-selektion, som utförs i provrör med ett stort slumpmässigt DNA-provtagningsbibliotek med 10 14-10 15 sekvenser17,18,19. I varje omgång av denna iterativa process utsätts DNA-poolen först för ett selektionstryck genom inkubation med målet under önskade förhållanden. Alla sekvenser som inte är bundna till målet tas sedan bort och lämnar bara de få sekvenser som kan binda under de givna förhållandena. Slutligen förstärks sekvenserna som har valts i föregående steg med PCR, vilket berikar poolens population med önskade funktionella sekvenser för nästa urvalsomgång och processen upprepas. När urvalspoolens aktivitet når en platå (vanligtvis efter 8-15 omgångar) analyseras biblioteket genom DNA-sekvensering för att identifiera de vinnande sekvenserna som uppvisar den högsta affiniteten.

SELEX har unika fördelar som kan utnyttjas för att få ökad selektivitet mot andra liknande mål20,21, t.ex. för virusets infektionsstatus 22. För det första kan en mängd olika typer av mål användas för urvalet, från små molekyler och proteiner till hela patogener och celler16. Således, för att erhålla en aptamer som binder till ett infektiöst virus, kan ett intakt virus användas som mål, istället för ett viralt ytprotein19. Hela viruset SELEX möjliggör val av aptamerer som binder specifikt till virusets ursprungliga tillstånd, utan behov av störning av viruset. För det andra kan SELEX skräddarsys för att avlägsna konkurrerande mål 21,23, såsom andra liknande virus eller icke-infektiösa inaktiverade virus, med hjälp av räknarurvalssteg i varje urvalsomgång22. Under räknarvalsstegen exponeras DNA-poolen för mål för vilka bindning inte önskas, och alla sekvenser som binder kasseras.

I detta arbete tillhandahåller vi ett protokoll som generellt kan tillämpas för att välja aptamerer som binder till ett infektiöst virus men inte till samma virus som har gjorts icke-infektiöst av en viss desinfektionsmetod eller till ett annat relaterat virus. Denna metod gör det möjligt att erhålla igenkänningsmedel baserat på funktionella skillnader i virusytan, som inte behöver vara kända i förväg, och erbjuder därför en ytterligare fördel för detektion av nyligen uppkomna patogener eller för understuderade sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av reagens och buffertar

  1. Förbered 10x Tris-borat EDTA (10x TBE) genom att tillsätta 0,9 M Tris-bas, 0,9 M borsyra, 20 mM EDTA (dinatriumsalt) och avjoniserat vatten till en slutlig volym på 1 liter. Blanda tills alla komponenter är upplösta.
  2. Bered en 10-procentig denaturerande polyakrylamidstamlösning enligt följande. Tillsätt 120 g urea (8 M), 25 ml 10x TBE, 62,5 ml 40% akrylamid / bisakrylamid (29: 1) lösning i en 250 ml glasflaska, och tillräckligt med destillerat vatten för att nå den slutliga volymen på 250 ml. Blanda tills alla komponenter är upplösta.
  3. Förbered 2x laddningsbuffert enligt följande. I ett 50 ml rör, tillsätt 21,636 g urea (8 M), 1,675 g EDTA (1 mM) och 4,5 ml 10x TBE. Fyll till 45 ml med destillerat vatten och blanda tills alla komponenter är upplösta.
  4. Bered extraktionsbufferten genom att tillsätta 100 mM natriumacetat och 1 mM EDTA (dinatriumsalt). Ställ in det slutliga pH-värdet på 5.
  5. Förbered etanolutfällningslösningar enligt följande. Bered 3 M natriumacetat, justera till pH 5,2 och förvara vid 4 °C. Bered 70 % etanol v/v och förvara vid -20 °C. Bered 100 % etanol och förvara vid -20 °C.
  6. Bered 500 ml SELEX-buffert innehållande 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2 och 0,5 mM CaCl2. Justera till pH 7,4. Förbered 100 ml SELEX-buffert med 8 M urea genom att tillsätta 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2 och 8 M urea. Justera till pH 7,4.
    OBS: Valet av SELEX-buffert är avgörande för att säkerställa att den valda aptameren kommer att arbeta på det slutliga provet där aptameren kommer att appliceras. Till exempel kommer aptamerer som är specifika för SARS-CoV-2 att användas i biologiska prover (t.ex. saliv eller nasofarynge-pinnar). Därför är det viktigt att välja jonkoncentrationer, pH och buffert som nära efterliknar dessa förhållanden i de avsedda biologiska proverna.
  7. Förbered bindnings- och tvättbufferten enligt följande. I ett 50 ml rör, förbered 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA (dinatriumsalt) och 2 M NaCl. Justera till pH 7,5.

2. Design och syntes av DNA-bibliotek och primers

  1. Designa det initiala ssDNA-biblioteket och primrarna med följande kriterier (se tabell 1 för ett exempel på ssDNA-bibliotek och en uppsättning primers, där N indikerar en slumpmässig nukleotidposition).
    1. Se till att biblioteket innehåller ett centralt slumpmässigt område med 35 till 60 nukleotider flankerade av två konstanta sekvenser vid 3'- och 5'-ändarna som fungerar som primerregioner för förstärkning. En typisk bibliotekslängd är 45 slumpmässiga nukleotider.
    2. Se till att den omvända primern innehåller en biotinmodifiering för att separera ssDNA från förstärkta dubbelsträngade PCR-produkter med streptavidinbelagda pärlor under in vitro-urvalsprocessen .
  2. Köp DNA-oligos från kommersiella källor med standard avsaltningsrening. Rena ssDNA-biblioteket och primrarna genom 10% denaturering av polyakrylamidgelelektrofores (dPAGE), följt av etanolutfällning enligt standardprocedurer24.
    VARNING: Acrylamide monomer och etidiumbromid är farliga kemikalier (cancerframkallande ämnen för människor), så använd lämplig personlig skyddsutrustning (labbrockar, handskar och ögonskydd) när du utför PAGE. När det är möjligt, undvik att använda etidiumbromid och ersätt det med ett säkrare färgämne.
    OBS: Det är möjligt att beställa oligos med HPLC-rening för att undvika att utföra detta reningssteg, även om detta inte kommer att ta bort korta oligonukleotider lika effektivt.
  3. Tillsätt nukleasfritt vatten för att resuspendera ssDNA efter etanolutfällning upp till önskad koncentration (100 μM). Bestäm koncentrationen av ssDNA-biblioteket och primrarna genom UV-absorption vid λ = 260 nm. Förvaras vid -20 °C.
  4. Köp en omodifierad omvänd primer som ska användas för sekvensering med hög genomströmning, biblioteksförberedelse och qPCR-kvantifiering.

3. Infektiösa och icke-infektiösa virusprover

VARNING: De infektiösa och icke-infektiösa virusproverna är prover för biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) som kräver extra försiktighet för att hantera säkert och lämpligt. Alla steg i proceduren som inkluderar dessa prover måste utföras i ett biosäkerhetsskåp, eller viruslösningen måste vara i en förseglad behållare (t.ex. täckta plaströr).

  1. Skaffa en stamlösning av infektiösa virus eller förbered dem, enligt motsvarande protokoll för varje virus. SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 och H5N1 pseudovirus som används här tillhandahölls av professor Lijun Rongs laboratorium (UIC) i PBS-buffert och bereddes enligt de rapporterade protokollen22,25,26.
    OBS: För virus som kräver biosäkerhetsnivå 3-anläggningar för att hantera det intakta infektiösa viruset är det möjligt att arbeta med pseudovirus. Ett pseudotypat virus genereras från ett lentivirus (HIV) som visar virusets ytproteiner i virushöljet och därmed nära efterliknar virusets yta och inträdesmekanism men är defekt vid kontinuerlig viral replikation.
  2. Skaffa en icke-infektiös virusstamlösning eller förbered den genom att följa desinfektionsproceduren. Det UV-inaktiverade SARS-CoV-2-pseudoviruslagret (p-SARS-CoV-2) som används här tillhandahölls av Prof. Rong lab (UIC) i PBS-buffert, och det tidigare rapporterade protokollet användes för UV-inaktivering22.
    OBS: Om möjligt, utför en analys för att testa virusets infektivitet för att säkerställa att viruset har inaktiverats helt.
  3. Kvantifiera virusbestånden
    1. Kvantifiera viruset med hjälp av en plackanalys enligt standardprocedurerna27,28,29. Denna analys möjliggör inte bara kvantifiering av viruset utan indikerar också virusets infektionsstatus, vilket bekräftar koncentrationen av infektiöst virus.
    2. För pseudovirus eller virus för vilka plackanalys inte finns tillgänglig, kvantifiera viruset med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kvantitativt ELISA-kit för lentivirus.
    3. Bered 1 x 108 kopior/ml stamlösning för p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 och p-H5N1. Separera varje stamlösning i delmängder innehållande 50 μl vardera och förvara vid -80 °C. Tina en ny alikvot före varje experiment.

4. In vitro-urval eller SELEX-process: första omgången

OBS: För alla steg med det infektiösa viruset, arbeta i ett BSL2-skåp.

  1. Denaturera ssDNA-biblioteket. Ta 10 μL 100 μM av ssDNA-biblioteket (1 nmol) och blanda med 240 μL SELEX-buffert. Värm vid 95 °C i 15 min i ett torrt bad och lägg sedan röret på is i 15 minuter.
  2. Inkubera ssDNA-biblioteket med det infektiösa viruset (positivt urvalssteg) enligt följande. Blanda 250 μL ssDNA-bibliotek i SELEX-buffert från steg 4.1 med 50 μL infektiöst virus (1 x 108 kopior/ml). Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur.
  3. Blockera de ospecifika platserna i centrifugfilter enligt följande. Medan du väntar på steg 4.2, förbered centrifugfiltren för nästa steg.
    1. Tillsätt 400 μl 1 mM T20-sekvens (tabell 1) till varje 0,5 ml centrifugfilter som ska användas – ett centrifugfilter med en cut-off på 100 kDa och ett med en cut-off på 10 kDa.
    2. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur och centrifugera vid 14 000 x g i 10 minuter för att avlägsna T20-lösningen i filtret. Tvätta 3x med SELEX-buffert för att ta bort överflödiga T20-sekvenser.
  4. Tvätta obundna sekvenser enligt följande. Tillsätt blandningen som inkuberats i steg 4.2 till det blockerade 100 kD-centrifugfiltret och centrifugera vid 14 000 x g i 10 minuter. Tvätta 3x, tillsätt 400 μL SELEX-buffert och centrifugera vid 14 000 x g i 10 minuter. Håll fraktionen i filtret och kasta genomflödet.
  5. Eluera bundna sekvenser enligt beskrivningen nedan.
    1. Byt centrifugfiltrets uppsamlingsrör och tillsätt 300 μL SELEX-buffert innehållande 8 M urea till centrifugfiltret i steg 4.4. Värm centrifugfiltret vid 95 °C i 15 minuter i torrt bad och centrifugera sedan vid 14 000 x g i 10 minuter.
    2. Samla upp fraktionen som flödade genom filtret som innehåller de eluerade sekvenserna. Upprepa ytterligare tre gånger. Arbeta i ett BSL2-skåp och tvätta allt material med 10% blekmedel för att inaktivera viruset innan du kasserar materialen.
  6. Koncentrera och avsalta enligt följande. Tillsätt lösningen som samlats upp i 4.5 till ett blockerat 10 kDa centrifugfilter. Centrifugera vid 14 000 x g i 15 minuter. Kassera fraktionen som flödade genom filtret.
    OBS: Eftersom virusen behålls och inaktiveras med 8 M urea i filtret i föregående steg, behöver detta och följande steg inte utföras i biosäkerhetsskåpet. Denna procedur måste upprepas om ett 0,5 ml centrifugrör används tills all lösning samlas upp som i steg 4,5, 1,2 ml strömmar genom filtret.
  7. Tvätta 3x med 300 μL SELEX-buffert för att avlägsna urean genom centrifugering vid 14 000 x g i 15 minuter. Kassera fraktionen som flödade genom filtret. Återvinn lösningen i filtret genom att vända den upp och ner i ett rent uppsamlingsrör och centrifugera i 5 minuter.
  8. Mät den slutliga volymen av den återvunna lösningen från 4.7 med en pipett i ett plaströr. Denna lösning heter R i a, där i motsvarar det runda talet. Typiskt erhålls volymer mellan 30 μL och 50 μL. Ta 1 μL av det eluerade ssDNA för att kvantifiera mängden DNA med qPCR.
    OBS: Detta är en möjlig pauspunkt, där R1a-provet kan hållas vid −20 °C för att fortsätta vid en annan tidpunkt.
  9. Utför PCR-amplifiering enligt beskrivningen nedan.
    1. I den första omgången, ta 90% av R1ett prov som en PCR-mall. I följande omgångar, ta 60% av den totala volymen i steg 4.8 för att utföra PCR och lagra den andra fraktionen vid -20 ° C.
    2. Ställ in en 50 μL PCR-reaktion med följande med den angivna slutkoncentrationen: 1x PCR-reaktionsbuffert, 200 μM dNTP, 10 μL DNA-mall (R 1 ett prov), 200 nM varje primer och 1,25 U-polymeras (2,5 E/μL lager).
    3. Optimera PCR-förhållandena, inklusive antal cykler och glödgningstemperatur, för varje uppsättning primers och ssDNA-bibliotek. Undvik att använda för många cykler, vilket kommer att producera oönskade PCR-delprodukter som primer-dimerer. Testa olika glödgningstemperaturer baserat på primers smälttemperatur.
    4. Kör PCR under optimerade förhållanden vid 95 °C i 5 minuter följt av 18 cykler på 1 min vid 95 °C, 30 s vid 52 °C och 1 min vid 72 °C, med ett sista förlängningssteg vid 72 °C i 10 minuter, för att erhålla dsDNA-poolen.
      OBS: Detta är en annan möjlig pauspunkt, där PCR-produkten kan hållas vid -20 ° C för att fortsätta vid en annan tidpunkt.
  10. Återställ ssDNA med hjälp av streptavidin-modifierade magnetiska pärlor.
    1. Ta 80% av PCR-produkten. Förvara den återstående fraktionen vid -20 °C.
    2. Dela PCR-produkten i alikvoter på 50 μl och tillsätt dem till mikrofugerör som innehåller 50 μL streptavidinmodifierade magnetiska pärlor (MB). Inkubera i 30 minuter med lätt omrörning (använd t.ex. roterande skakapparat) vid rumstemperatur. Placera sedan mikrofugeröret på magnetstället för att isolera MB och ta bort supernatanten genom pipettering (det måste vara en klar lösning).
    3. Tvätta genom att tillsätta 200 μL bindnings- och tvättbuffert på röret. Ta bort röret från magnetstället, knacka på röret och återsuspendera MB till en homogen lösning genom pipettering. Sätt tillbaka mikrofugeröret på magnetstället för att isolera MB och ta bort supernatanten genom pipettering. Upprepa detta tvättsteg två gånger.
    4. När tvättningen är klar suspenderas MB i totalt 100 μl SELEX-buffert och lösningen värms upp till 95 °C i 10 minuter. Placera omedelbart röret i magnetstället innan röret svalnar och ta supernatanten som innehåller ssDNA-poolen. Upprepa detta återställningssteg och tillsätt 50 μL SELEX-buffert.
  11. Mät den slutliga volymen av den återvunna fraktionen från 4.10 med pipett. Denna fraktion heter R i x,där i motsvarar det runda talet. I allmänhet erhålls volymer mellan 140 och 150 μL. Ta 1 μL R1x för att kvantifiera mängden DNA med qPCR.

5. Efterföljande urvalsomgångar

  1. Denaturera ssDNA-poolen. Ta 60 % av prov R1x och blanda med 50 μl SELEX-buffert. Värm vid 95 °C i 15 min i torrt bad. Lägg tuben på is i 15 min.
  2. Inkubera ssDNA-poolen med det icke-infektiösa viruset och andra potentiella störande virus (räknarvalssteg). Blanda den denaturerade ssDNA-poolen i SELEX-buffert från 5.1 med 50 μL av varje virus (5 x 109 kopior/ml; t.ex. icke-infektiös p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 och p-H5N1). Inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
  3. Blockera ospecifika platser i centrifugfilter. Medan du väntar på steg 5.2, förbered centrifugfiltren för nästa steg. Använd vanligtvis två centrifugfilter, ett med en avstängning på 100 kDa och ett med en avstängning på 10 kDa. Följ samma procedur som i 4.3.
  4. Tvätta bort sekvenserna bundna till icke-målvirus. Tillsätt blandningen inkuberad i steg 5.2 till ett blockerat 100 kDa centrifugfilter. Centrifugera vid 14 000 x g i 10 minuter och återvinn fraktionen som strömmar genom centrifugfiltret. Tvätta 2x, tillsätt 100 μL SELEX-buffert och centrifugera vid 14 000 x g i 10 minuter. Håll fraktionen som flödade genom filtret.
  5. Inkubera ssDNA-poolen med det infektiösa viruset (positivt urvalssteg). Ta 300 μl fraktion från steg 5.4 och blanda med 50 μl av det infektiösa viruset (1 x 108 kopior/ml). Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur. Följ steg 4.4 till 4.11.

6. Övervakning av SELEX-processen

För att övervaka poolens anrikning används qPCR på två sätt. För det första är det genom absolut kvantifiering möjligt att testa poolernas anrikning (elueringsutbyte). För det andra, genom att övervaka smältkurvan, kan poolernas mångfald (konvergens av aptamerarterna) utvärderas30.

  1. Utför alla qPCR-analyser med en reaktionsvolym på 10 μl i 96-brunnsplattor utformade för qPCR.
  2. Bered en standard qPCR-blandning innehållande 5 μL mastermix, 0,3 μL 500 nM av varje omärkt primer, 3,4 μLH2Ooch 1 μL DNA-mall.
    1. Förbered utspädningar av renat ssDNA-bibliotek (steg 2.3) för att köra standardkurvan.
    2. Späd DNA-proverna så att deras koncentration passar in i standardkurvan. För Ria-prover, tillsätt 1 μl av provet utan utspädning och 1 μl 1:10 spädning till qPCR-blandningen. För Rix prover, inkludera 1:10 eller 1:100 utspädningar.
  3. Kör qPCR genom att ange följande protokoll. Ställ först in ett första denatureringssteg vid 98 °C i 2 minuter. Ställ sedan in 40 denatureringscykler vid 98 °C i 5 s och glödgning och förlängning vid 52 °C i 10 s. Ställ slutligen in en smältkurvanalys från 65 till 95 °C. Bestäm tröskelvärden (Ct) värden genom automatiserad tröskelanalys.
  4. Använd standardkurvan för att kvantifiera mängden ssDNA i R ia och Rix prover.
  5. Beräkna elueringsutbytet som mängden bundet DNA (antal mol i R i a) dividerat med mängden initialt DNA (antal mol i Ri-1x). Plotta elueringsutbytet mot det runda talet för att se om en anrikning över rundorna observeras.
  6. Rita smältkurvorna för olika omgångar. En övergång till högre smälttemperaturer i toppen nära 75/85 °C förväntas när antalet omgångar ökar. Detta innebär att poolens mångfald minskar.

7. Sekvensering med hög genomströmning

  1. Rådgör med sekvenseringsanläggningen med hög genomströmning om vilka sekvenseringstyper och skalor som finns tillgängliga, vilket bestämmer bibliotekets förberedelsemetod.
    OBS: Detta beslut kommer att ta hänsyn till både längden på poolerna som ska sekvenseras (inklusive primers) och antalet pooler som ska lämnas in (i allmänhet sikta på minst 1 x 10 5-10 6 sekvenser per pool). Om en viss sekvenseringsskala inte kan läsa hela poolens längd kan sekvensering av parade ändar användas för att läsa från båda ändarna av sekvensen, i motsats till en ände som bara läser från ena änden.
  2. Välj ett lämpligt kommersiellt tillgängligt kit baserat på typen av sekvensering, i samråd med sekvenseringsanläggningen. Förbered flera pooler med urvalsrundor som representerar hög, medel och låg berikning, samt den slutliga poolen, med hjälp av olika indexpar i adaptrarna för varje pool som möjliggjorde provanalys av alla omgångar med en bana.
    PCR-förstärkning kan också användas för att införliva de adaptrar och index som krävs för sekvensering med hög genomströmning, men detta kostar i allmänhet liknande de kommersiella satserna och fungerar inte bättre.
    1. Utför biblioteksförberedelser genom att följa dessa steg: avsluta reparation av fragmenterat DNA, adapterligering och PCR-amplifiering för att producera de slutliga biblioteken.
    2. Rena PCR-produkten med magnetiska DNA-rengöringspärlor enligt tillverkarens instruktioner.
    3. Kvantifiera DNA med hjälp av ett fluorescensbaserat kvantifieringskit. Undvik att använda mindre noggranna metoder, till exempel UV-mätningar i små volymer.
    4. Blanda ungefär lika stora mängder (efter mängd DNA, inte volym) av varje poolbibliotek som innehåller specifika index.
    5. Kontrollera kvaliteten på det slutliga biblioteket med qPCR-kvantifiering och en DNA-fragmentanalysator. Detta steg utförs ofta av sekvenseringsanläggningen.
      OBS: Sekvenseringspersonal kan ge användbar information om hur man förbereder biblioteket och vilka kvalitetskontroller som föreslås. Att diskutera med dem krävs innan biblioteken förbereds.
  3. Skicka det förberedda slutliga biblioteket till sekvenseringsanläggningen enligt deras krav.

8. Analys av sekvensering

  1. De flesta program som är tillgängliga för sekvenseringsanalys är utformade för att köras på kommandoraden på ett Linux-operativsystem. För små datamängder, konfigurera önskat Linux-operativsystem och installera nödvändiga program på en persondator. för större datauppsättningar körs HTS-analys på högpresterande datorresurser eller superdatorer (rekommenderas).
    Åtkomst och utbildning kommer att behövas för att använda högpresterande datorresurser, vilket kan ta lite tid att få. Dessutom krävs grundläggande kunskaper om UNIX-kommandoradsanvändning. Många gratis resurser om grundläggande kommandoradsanvändning är tillgängliga online, och datorresurserna kommer sannolikt att ge ytterligare information för att använda sina system.
  2. Få åtkomst till sekvenseringsfilerna, vanligtvis i ett komprimerat FastQ-filformat, med hjälp av informationen från sekvenseringsfunktionen.
    1. Använd en FTP-klient för att överföra filerna till din egen dator och/eller den högpresterande datorresursen. Många sekvensanalysprogram kan direkt använda komprimerade filer, så håll filerna komprimerade, om möjligt, för att begränsa filstorlekarna (stora sekvensläsningar på 50 M+ sekvenser kan ta upp 100 Gb+ filutrymme när de är okomprimerade).
    2. Om sekvensfiler behöver packas upp använder du gzip-funktionen som är standard på de flesta Linux-installationer. Få ytterligare information om gzip och dess alternativ från den installerade handboken genom att skriva "man gzip" på kommandoraden.
  3. Rensa sekvenserna före analys genom att demultiplexera, ta bort sekvenseringsadaptrarna, ta bort läsningar av låg kvalitet och inkludera läsningar i både framåt- och bakåtriktning.
    1. Använd FastQC-programmet31 efter vart och ett av följande steg för att få grundläggande kvalitetskontrollinformation om sekvenserna för att bedöma effektiviteten för varje rensningssteg.
    2. Demultiplexera sekvenserna för att separera alla sekvenser från en enda läsfil till de olika poolerna baserat på indexen som ingår i sekvenseringsadaptrarna. Detta steg utförs ofta av sekvenseringsanläggningen, som bör konsulteras eftersom den exakta proceduren beror på vilken sekvenseringsmaskin som används.
    3. Ta bort sekvenseringsadaptrarna med kommandoradsprogrammet Cutadapt32. Använd urvalsprimers (i stället för sekvenseringsadaptrar) som indata i länkat adapterläge. Använd alternativet --discard-untrimmed för att ignorera sekvenser som inte innehåller urvalsprimers.
    4. Ange alternativ för den maximala felfrekvensen som matchar korten och den minsta och maximala längden på sekvenser som ska accepteras. Om du använder parkopplade slutläsningar anger du specifika parametrar som är tillgängliga och ger både sekvensfilerna Läs 1 och Läsa 2. Ställ in ytterligare parametrar efter behov genom att hänvisa till Cutadapt-manualen32.
      OBS: Ligeringen av sekvenseringsadaptrar till pooler är riktningsoberoende och kommer att innehålla cirka 50% av sekvenserna i framåtriktningen och 50% i omvänd riktning. För att undvika att förlora 50% av sekvenserna i omvänd riktning kan Cutadapt köras en andra gång med det omvända komplementet av urvalsprimers som ingångar.
    5. (Valfritt) Om ihopparad sekvensering används, slå samman Read 1- och Read 2-filerna med programmet PEAR33.
    6. Använd FASTX-Toolkit-programmet34 för att ta bort sekvenser av låg kvalitet som har en kvalitet under ett visst tröskelvärde vid vilken nukleotid som helst. En kvalitetspoäng på 30 är en bra utgångspunkt. Om den övergripande kvaliteten i allmänhet är bra kan detta steg hoppas över.
    7. Om du vill sammanfoga sekvensfilerna i omvänd riktning med dem i framåtriktningen använder du fastx_reverse_complement funktionen FASTX-Toolkit på filerna med omvänd riktning. Använd sedan det inbyggda kattprogrammet (standard på de flesta Linux-installationer) för att slå samman framåt och bakåt komplement - omvänd fil till en enda fil.
  4. Om du vill analysera berikningen av sekvenser över olika urvalspooler använder du analysverktyget FASTAptamer35.
    1. Använd FASTAptamer-Count för att räkna antalet gånger varje sekvens visas. Rangordna och sortera sedan sekvenserna efter överflöd. Räkneutdatafilen krävs som indata för alla andra FASTAptamer-program.
    2. Använd FASTAptamer-Clust för att gruppera alla sekvenser i en fil i kluster av närbesläktade sekvenser. Använd parametern "distance" för att definiera antalet enskilda nukleotidmutationer eller indels som tillåts gruppera i ett kluster.
      FASTAptamer-Clust-programmet kan vara mycket beräkningsmässigt dyrt om ett stort antal unika sekvenser är närvarande (särskilt för tidiga omgångar), vilket kan ta dagar eller till och med veckor att slutföra helt. Parametern cut-off filter kan användas för att utesluta sekvenser med låg förekomst från klustring. I allmänhet är det bra att börja med en högre cut-off, till exempel 10 eller 5 läsningar per miljon (RPM) och minska den om programmet avslutas snabbt. Om poolerna är mycket heterogena kanske det inte är möjligt att klustra sekvenserna inom en rimlig tidsram.
    3. Använd FASTAptamer-Enrich för att beräkna anrikningen av varje sekvens som finns i mer än en urvalsomgång. Jämför RPM för sekvensen från en population med RPM i en annan. Använd programmet Berika på antingen Count- eller Cluster-filerna. Utdata är en tabbavgränsad värdefil (.tsv) som kan öppnas i alla kalkylprogram för vidare analys och enkel sortering.
      OBS: FASTAptamer-Enrich-programmet kan också vara mycket beräkningsmässigt dyrt om ett stort antal unika sekvenser är närvarande. Parametern cut-off filter kan användas för att utesluta sekvenser med låg förekomst från utdata för att undvika filer som är för stora för att öppnas i kalkylprogram.
    4. (Valfritt) Om många pooler är för heterogena (många unika sekvenser och få dubblettsekvenser) kanske det inte är möjligt att använda antingen Clust- eller Enrich-programmen. I det här fallet utför du en manuell anrikningskontroll med hjälp av utdatafilen Count som sorterar sekvenser efter överflöd (vanligast överst) och byter namn på sekvensidentifieraren så att den innehåller viktig information som RPM.
      1. Använd standard Linux "head" -programmet på Count-filerna för att få en lista över de vanligaste sekvenserna. Använd sedan standard Linux "grep" -programmet för att söka i var och en av de vanligaste sekvenserna i räkningsfilerna för alla andra relevanta pooler. Om det finns några matchningar använder du den ändrade sekvensidentifieraren för att fastställa RPM i poolen för att manuellt skapa berikningsinformationen.
        OBS: Skript för alla sekvenseringsanalyssteg finns i de kompletterande kodningsfilerna 1-11.

9. Validering av Aptamerbindning och analyser

  1. Från anrikningsinformationen som erhållits genom sekvensanalys, identifiera kandidataptamersekvenser baserat på sekvenser som har mest anrikning under efterföljande urvalsomgångar och/eller de vanligaste sekvenserna i den slutliga urvalsomgången. Välj flera olika kandidatsekvenser (minst 10-20) för vidare testning eftersom de mest anrikade kanske inte nödvändigtvis är de bäst presterande aptamererna.
  2. Utför inledande screening av kandidataptamerer med hjälp av en bindningsanalys som kan utföras snabbt för flera prover. En kolonnbaserad ultrafiltreringsbindande analys36 eller enzymkopplad oligonukleotidanalys (ELONA) är bra metoder för denna initiala screening.
  3. Analysera specificiteten och affiniteten hos de sekvenser som visar den bästa bindningsaktiviteten från den initiala screeningen, med hjälp av minst två oberoende bindningsanalyser (t.ex. MicroScale Thermophoresis (MST) 37,38, Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay (ELONA)39, surface plasmon resonance 40, eller biolayer interferometry (BLI)41).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eftersom DNA-aptamerer kan erhållas med hjälp av SELEX i ett provrör15, utformades denna SELEX-strategi noggrant för att inkludera både positiva selektionssteg mot det intakta, hela infektiösa viruset (dvs. behålla DNA-molekylerna som binder till det infektiösa viruset), samt motselektionssteg för samma virus som har gjorts icke-infektiöst med en viss desinfektionsmetod, specifikt UV-behandling, genom att kassera de DNA-sekvenser som kan binda till det icke-infektiösa viruset. En schematisk representation av urvalsprocessen visas i figur 1.

Som representativa resultat av detta protokoll valde vi valet av en aptamer för infektiös SARS-CoV-2. På grund av kravet på arbetsförhållanden med biosäkerhetsnivå 3 (BSL3) för att hantera den intakta, infektiösa SARS-CoV-2 har vi istället valt att arbeta med ett pseudotypat virus. Pseudotypade virus genereras från ett relativt ofarligt ryggradsvirus, i detta fall en typ av lentivirus (HIV), som har modifierats för att visa ytproteinet hos ett annat virus av intresse inom dess virala hölje, vilket gör det möjligt att nära efterlikna ytan och inträdesmekanismen för det önskade viruset utan riskerna med att arbeta med farliga mänskliga patogener. Viktigt är att dessa pseudovirus modifieras för att vara defekta vid kontinuerlig viral replikation25,42. I detta arbete användes tre olika pseudotypade virus: p-SARS-CoV-2, där SARS-CoV-2 spik (S) proteiner införlivas i höljet; p-SARS-CoV-1, innehållande SARS-CoV-1 spik (S) protein; och p-H5N1, innehållande hemagglutinin och neuraminidas isolerat från den högpatogena stammen av aviärt influensavirus A/Goose/Qinghai/59/05 (H5N1).

I de två första urvalsomgångarna inkluderades inget motvalssteg för att minimera det ospecifika avlägsnandet av DNA-bindemedel som vanligtvis bara finns som enstaka kopior i början av omgångarna. Efter de två första omgångarna inkluderades positiva och motvalssteg i varje omgång för att nå en hög selektivitet. För motval användes p-SARS-CoV-2 som hade gjorts icke-infektiös genom UV-behandling, liksom p-SARS-CoV-1 och p-H5N1 för att få selektivitet mot andra virus.

För att övervaka selektionsförloppet användes kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR). Denna teknik representerar en enkel metod som inte kräver märkning av poolen och kan generellt tillämpas på praktiskt taget alla mål30. Den utnyttjar två funktioner i qPCR-tekniken. För det första möjligheten till absolut kvantifiering med hjälp av en standardkurva för att beräkna elueringsutbytet, definierat av ssDNA bundet till det infektiösa viruset över det totala tillsatta ssDNA. Våra resultat visade att elueringsutbytet initialt ökade med varje tidig omgång av SELEX och planade ut vid omgång 8 och 9 (R8 och R9), vilket tyder på en anrikning av poolerna i sekvenser som binder till det infektiösa viruset (figur 2A). För det andra ger smältkurvor för varje omgång av DNA-poolen ytterligare bevis på sekvensdiversiteten hos poolerna30. Genom att jämföra smältkurvorna kan en förskjutning från toppen vid hög smälttemperatur (T m) från 77 °C till 79 °C observeras, vilket tyder på att DNA-poolen har konvergerat från slumpmässiga sekvenser med låg T m till mer bevarade sekvenser med högre Tm (figur 2B). Dessutom, i de sista omgångarna (R8 och R9), visas en topp vid låg Tm (~ 70 ° C). Detta kan relateras till produktionen av primerdimerer under PCR. En möjlig lösning för att undvika detta är att minska antalet cykler under PCR (till exempel från 18 cykler till 12 eller 15 cykler).

Efter att ha bekräftat en anrikning av poolen med qPCR använde vi sekvensering med hög genomströmning (HTS) för omgångarna 3, 5, 7, 8 och 9 i SELEX för att ta reda på vilka sekvenser som är ansvariga för bindningen av virusmålet. Jämfört med traditionella kloningssekvenseringsprocedurer tillåter HTS utvecklingen av enskilda sekvenser över flera valomgångar att övervakas, för att slutligen identifiera aptamersekvenserna som berikas under efterföljande omgångar. Figur 3A visar den relativa förekomsten (i läsningar per miljon) för sekvensen SARS2-AR10, erhållen under på varandra följande urvalsomgångar. Den sekundära strukturen för SARS2-AR10 förutsägs av Mfold-programvaran, och resultaten (figur 3B) visar en strukturerad sekundär struktur som innehåller en stamslingregion som kan vara involverad i att känna igen viruset. Ytterligare karakterisering av affinitetsbindningen för denna sekvens har rapporterats tidigare22. Mikroskala termofores (MST) och en enzymkopplad oligonukleotidanalys (ELONA) visade att SARS2-AR10-aptameren binder till den infektiösa p-SARS-CoV-2 med en Kd = 79 ± 28 nM och binder inte till den icke-infektiösa p-SARS-CoV-2 eller till andra koronavirus såsom p-SARS-CoV-1 och 229E.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av SELEX-processen hos aptamerer som skiljer infektiösa från icke-infektiösa virus. Positiva och motvalssteg lades till i varje omgång efter den andra omgången för att nå hög specificitet mot det infektiösa viruset. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Övervakning av framstegen med SELEX för infektiösa SARS-CoV-2-specifika aptamerer. (A) Kvantifiering av elutionsutbytet (dvs. det bundna ssDNA över det tillsatta ssDNA) för varje omgång SELEX med qPCR. (B) Smältkurva för de olika poolerna under valet av SARS-CoV-2-aptamer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Anrikning och sekundär struktur för SARS2-AR10 aptamer. Avläsningar per miljon (RPM) erhållna genom analys av HTS-data för SARS2-AR10-sekvensen som en funktion av urvalsomgångarna, med FASTAptamer-Count. Infälld: Den förutsagda mest stabila sekundära strukturen i SARS2-AR10-sekvensen baserad på UNAFold-programvaran. Beräkningar gjordes vid 25 °C, 100 mM NaCl och 2 mM MgCl2. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Namn DNA-sekvens (5 ′ till 3 ′)
T20 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
DNA-bibliotek ACCGTCAGTTACAATGCT- N45 -GGCTGGACTATCTGTGTGTA
Främre primer (FwdP) ACCGTCAGTTACAATGCT
Omvänd primer (RevP) Biot-TACACAGATAGTCCAGCC
SARS-AR10 CCCGACCAGCCACCATCAGCAACTCTTCCGCGTCCATCCCTGCTG
N: representerar en slumpmässig nukleotid; Biot: Biotinmodifiering i 5'end.

Tabell 1: Förteckning över DNA-sekvenser.

Kompletterande kodningsfil 1: Cutadapt_script.txt identifierar alla sekvenser i en given indatafil som har de angivna framåt- och bakåtprimrarna, kasserar alla som inte har primrarna och tar bort primrarna från sekvenserna som hade dem. Se referens31 för mer information om Cutadapt. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 2: FASTAptamer_cluster_script.txt klustrar alla sekvenser från en enda räkningsfil i familjer/kluster av närbesläktade/liknande sekvenser. Detta är användbart om en kandidatsekvens identifieras, så att andra liknande sekvenser i samma kluster också kan identifieras som potentiella kandidater. Se referens34 för mer information om FASTAptamer. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 3: FASTAptamer_count_script.txt räknar antalet förekomster av varje unik sekvens från en given FASTA/FASTQ-indatafil och producerar en utdatafil för varje unik sekvens i fallande ordning (högsta överflöd till lägsta förekomst). Count-utdatafilerna krävs som indata för alla andra FASTAptamer-program. Se referens34 för mer information om FASTAptamer. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 4: FASTAptamer_enrich_script.txt jämför alla sekvenser från två eller tre indatafiler, ger överflöd av alla unika sekvenser mellan alla filer och ger alla kombinationer av parvisa anrikningsvärden (i RPM) för alla sekvenser som finns i flera filer. Se referens34 för mer information om FASTAptamer. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 5: fastqc_script.txt är ett kvalitetskontrollverktyg för FastQ-filer som ger lättläst kvalitetsinformation för sekvenseringsdata med hög genomströmning, till exempel dupliceringsnivåer, läslängder och kvalitetspoäng. Se referens30 för mer information om FastQC. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 6: FASTX_fwd_rev_merge_script.txt använder FASTX-Toolkit för att mata ut det omvända komplementet för alla sekvenser från en given omvänd fil. Den använder sedan kommandot cat (standard i de flesta UNIX-operativsystem) för att slå samman denna omvända komplementfil med en given framåtriktad sekvensfil, för att ge en enda fil med alla sekvenser. Se referens33 för mer information om FASTX-Toolkit. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 7: FASTX_quality_filter_script.txt använder FASTX-Toolkit för att kontrollera kvaliteten på sekvenser i en viss FastQ-fil och kan ignorera alla sekvenser som är av låg kvalitet. Denna metod är i allmänhet bättre än trimningsmetoder för kvalitetsfiltrering för analys av in vitro-selektionssekvenser. Trimning innebär att man tar bort baser (vanligtvis nära ändarna) av sekvenser baserat på låg kvalitet, vilket är acceptabelt för genomisk sekvensering, men eftersom hela sekvensen behövs för funktionellt DNA är trimning av ändarna inte användbar. Istället, om för många baser i en sekvens är av låg kvalitet, kasseras hela sekvensen. Se referens33 för mer information om FASTX-Toolkit. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 8: grep_searcher_script.txt används för att söka efter en specifik indatasekvens i en specifik indatafil och mata ut både ID och sekvens i en utdatafil (om den hittades i indata). Detta skript är användbart för pooler som är mycket heterogena (dvs. har många unika sekvenser), vilket gör att FASTAptamer Clust tar för lång tid att köra korrekt och resulterar i FASTAptamer Enrich-filer som är för stora för att öppna i typiska kalkylprogram för analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 9: gzip_compress_decompress_script.txt använder Gzip för att komprimera eller packa upp filer. En komprimerad fil har vanligtvis ett .gz tillägg till filnamnet. Det rekommenderas att komprimera stora filer för att spara på filutrymme. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 10: PEAR_script.txt används endast för parkopplade sekvenseringsfiler och sammanfogar Read 1-filen med motsvarande Read 2-fil. Se referens32 för mer information om PEAR. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 11: tar_extraction_creation_script.txt extraherar eller skapar Tar-arkiv, som används för att samla flera filer och / eller kataloger i en enda fil. De komprimeras också ofta för att minska filstorleken, till exempel med bz2-komprimering, som ingår i detta skript. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SELEX möjliggör inte bara identifiering av aptamerer med hög affinitet, i pM-nM-intervallet 22,43,44,45, utan också med hög och avstämbar selektivitet. Genom att dra nytta av räknarval kan aptamerer med utmanande selektivitet erhållas. Till exempel har Li-gruppen visat förmågan att erhålla sekvenser som kan skilja patogena bakteriestammar från icke-patogena stammar21. Identifierad också en aptamer som kan skilja serotyper av Streptococcus pyogenes bakterier46. Detta öppnar möjligheten att integrera aptamermolekyler med unik selektivitet i olika funktionella DNA-sensorer 12,47,48,49,50 med ny nanoteknik 22,51,52 för att konstruera sensorer för olika applikationer, till exempel för bärbara och snabba diagnostiska tester eller för miljödetektering.

Protokollet som presenteras här gör det möjligt att erhålla aptamerer med hög selektivitet för ett infektiöst virus över samma virus som har inaktiverats och därmed är icke-infektiöst. För att uppnå sådan selektivitet baseras SELEX-metoden i detta arbete på utformningen av räknarvalssteget. För det första, för ett framgångsrikt räknarvalssteg, måste ett korrekt val och karakterisering av icke-målprover utföras. Således beror denna metod på att börja med välkända infektiösa och icke-infektiösa intakta virusbestånd. För det andra införlivas ett motvalssteg i varje urvalsomgång efter den första omgången, för att tillämpa stränga villkor från början av urvalet och för att maximera sannolikheten för att identifiera aptamerer som kan skilja mellan de små skillnaderna i viruspartikelns yta från det infektiösa och icke-infektiösa tillståndet för samma virus.

I detta protokoll ligger fokus på aptamerens selektivitet. Om starkare aptameraffiniteter krävs är det möjligt att öka processens stringens efter vissa SELEX-rundor. Genom att exempelvis minska den infektiösa viruskoncentrationen och inkubationstiden under det positiva urvalet är det möjligt att erhålla aptamerer med en starkare bindningsaffinitet44.

En annan viktig faktor vid utformningen av SELEX-protokollet är det slutliga provet där aptameren kommer att appliceras. Aptamerer som är specifika för virus införlivas vanligtvis i komplexa prover (t.ex. serum-, saliv- och realvattenprover), och detta måste beaktas under aptamervalet för att öka chansen att få funktionella aptamerer i de slutliga proverna. Därför är det viktigt att utföra SELEX i en buffert som efterliknar dessa prover, särskilt med avseende på katjonkoncentration och pH. Till exempel, för SARS-CoV-2 aptamer, valde vi PBS-buffert (pH 7,4) innehållande 2 mM MgCl 2 och 0,5 mM CaCl2 för att nära efterlikna biologiska prover. Dessutom, om andra arter i proverna där aptameren kommer att appliceras potentiellt kan konkurrera med målet för att binda aptameren, är det möjligt att minimera störningar från dessa arter genom att inkludera dem i motvalssteget för att eliminera sekvenser som kan binda dessa arter.

De framgångsrika resultaten av denna SELEX-process22, som har tillämpats på olika virus (adenovirus och SARS-CoV-2) och olika inaktiveringsmetoder (UV-behandling och fritt klor) indikerar att denna metod kan tillämpas i stor utsträckning för andra virus och andra inaktiveringsmetoder, vilket öppnar ett brett spektrum av applikationer i framtiden. Aptamerer som skiljer infektiösa virus har potential inte bara i diagnostiska applikationer för att identifiera patienter som fortfarande är smittsamma, utan också i miljöapplikationer där provet definieras som förorenat om patogenerna i dessa prover fortfarande är aktiva. Således erbjuder införlivandet av aptamerer med förmågan att identifiera infektiösa virus i snabba sensorer möjligheter att övervaka desinfektionsbehandlingar.

Dessutom var det möjligt att skilja virusets infektionsstatus utan någon information om de strukturella skillnaderna mellan de två infektionstillstånden. Den enda information som krävs är att veta att skillnaderna mellan båda tillstånden är relaterade till skillnader i molekylernas struktur på ytan av intakta virala partiklar. Således är vi övertygade om att samma tillvägagångssätt kan användas för att differentiera varianter och serotyper av samma virus, där skillnaderna beror på små mutationer i proteinresterna på ytan av virala partiklar, liknande de som skiljer virusets infektionsstatus. Till exempel föreställer vi oss att det kommer att vara möjligt att få aptamerer som är specifika för varianter av oro för SARS-CoV-2 eller andra virus, såsom influensa, vilket öppnar möjligheten för snabb övervakning av varianter som är det största hotet mot samhället.

Slutligen, eftersom SELEX-strategin för att erhålla aptamerer som kan skilja infektiösa från icke-infektiösa virus inte kräver någon förkunskap om vilka specifika strukturella skillnader som finns mellan dem, kan det vara möjligt att använda aptamerer med denna selektivitet för att identifiera de specifika ytförändringar som är ansvariga för förlusten av infektivitet från olika desinfektionsmetoder genom en detaljerad karakterisering och identifiering av bindningsmålen för våra aptamerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Laura M. Cooper och Dr. Lijun Rong från University of Illinois i Chicago för att ha tillhandahållit de pseudovirusprover som används i detta protokoll (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), samt Dr. Alvaro Hernandez och Dr. Chris Wright från DNA Services-anläggningen vid Roy J. Carver Biotechnology Center vid University of Illinois i Urbana-Champaign för deras hjälp med sekvensering med hög genomströmning, och många medlemmar i Lu-gruppen som har hjälpt oss med in vitro-selektion och aptamerkarakteriseringstekniker. Detta arbete stöddes av ett RAPID-bidrag från National Science Foundation (CBET 20-29215) och ett såddbidrag från Institute for Sustainability, Energy and Environment vid University of Illinois i Urbana-Champaign och Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. tackar PEW Latin American Fellowship för ekonomiskt stöd. Vi tackar också Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) för stöd till Lu-gruppens forskningsprogram vid University of Texas i Austin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA - Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678 (2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. Babraham bioinformatics - FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2022).
  35. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230 (2015).
  36. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  37. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070 (2017).
  38. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  39. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334 (2018).
  40. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  41. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  42. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  43. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  44. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  45. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  46. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  47. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  48. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  49. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  50. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  51. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966 (2022).
  52. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Tags

Bioteknik utgåva 187 in vitro-selektion aptamer virusinfektionsstatus räknarurval intakt virus
In vitro-val av aptamerer för att skilja infektiösa från icke-infektiösa virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., … More

Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter