Summary
Immunhistokjemiske metoder er nyttige i honningbieforskning for å oppdage og vurdere nivået av apoptose og nekrose i midgut og hypopharyngeal kjertler av voksne bier.
Abstract
Honningbier (Apis mellifera L.) inne i bikuben (sykepleierarbeidere og andre bikube) og utenfor bikuben (foragere) er utsatt for klima- og værendringer, ulike plantevernmidler, patogener og underernæring, som hovedsakelig kommer inn gjennom munnen og primært påvirker fordøyelseskanalene til voksne bier. For å forstå og forhindre effekten av slike eksterne og interne stressorer på honningbier, er en nyttig forskningsmetode den immunhistokjemiske metoden. En grunnleggende protokoll er beskrevet for å forberede midgut (ventriculus) og hypopharyngeal kjertler (HPGs) av voksne bier for histologisk analyse. En detaljert metodikk er beskrevet for å vurdere nivået av celleskade og skille nekrose fra programmert celledød (apoptose) som en naturlig prosess for vevregenerering. Resultatene av voksen honningbiebehandling med oksalsyre og plantevernmidler (insektmiddel og akaricid) og bestemmelse av celledød i ventriculus og HPG presenteres. Fordeler og ulemper med metodikken diskuteres også.
Introduction
Honningbier (Apis mellifera L.) er blant annet ville pollinatorer de viktigste pollinatorene av landbruksplanter. Gjennom tusenvis av år har det skiftende miljøet påvirket bier til å tilpasse sin morfologi, fysiologi, oppførsel og toleranse til flere patogener og parasitter. Derfor har honningbier utviklet et svært variert utvalg av arter og underarter over hele verden1. Disse resultatene er i samsvar med tidligere funn, at det er genetisk variasjon i honningbiens fordøyelseskanalstruktur, men antyder også at endringer i midttarmen skyldes miljøfaktorer 2,3.
Fordøyelseskanalen til honningbien har tre hoveddeler: foregut, midgut (ventriculus) og hindgut4. Ventriculus er et viktig organ for fordøyelsen av pollen og nektar / honning; I hindgut foregår osmotisk kontroll gjennom absorpsjon av vann og ioner2. Hypopharyngeal kjertler (HPGs) av honningbiearbeidere er plassert i hodet og syntetiserer og utskiller kongelige gelékomponenter for å mate brystet, dronningen og medlemmene av kolonien. Deres størrelse endres med alder og oppgaver og avhenger av riktig ernæring (kvalitetspollen). Sykepleierarbeidere i alderen 6 til 18 dager utfører oppdrett, og størrelsen på HPG øker 5,6. I foragerbier degenererer HPG-ene og utskiller bare enzymer som er viktige for å konvertere de komplekse sukkerene til enkle (α-glukosidaser, leucin arylamidase, invertase) i honning7.
Honningbier er utsatt for flere biotiske og abiotiske stressorer8, og fordøyelseskanalen kan påvirkes av flere negative stimulanter. Den første barrieren som beskytter organismen mot patogener er den peritrofiske membranen i midttarmen, som består av tarmslimhinnen for å beskytte mot patogener4. Utviklingen og funksjonen til HPG avhenger av kosthold, alder og kolonitilstand9, og påvirkes av insektmidler, akaricider 10 og patogener11,12,13. Akaricidrester i bikuben på grunn av varroa-kontrollbehandling og plantevernmidler fra miljøet påvirker foragerbier og sykepleierbier14,15. Den største trusselen mot honningbiekolonier er midden Varroa destructor, både som en vektor av virus som bidrar til kolonitap16 og som forbruker av vertens fete kropp (et viktig vitalt organ i honningbier), som følgelig påvirker individets kropp og kolonifunksjoner17.
Imidlertid kan intensive jordbrukshabitater gi en kortsiktig matforsyning for honningbier. Derfor bør miljøordninger for landbruket øke tilgjengeligheten av honningblomster i jordbrukslandskap18. For å vurdere morfologien til forskjellige underarter 6,19,20,21 eller subletale effekter av disse faktorene på celle- eller vevsnivå, spesielt midgut og HPG, er histologiske og immunhistokjemiske metoder praktiske og tilstrekkelig nøyaktige til å brukes i histologiforskning hos honningbier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Grunnleggende histologi for honningbieforskning
- Disseksjon av honningbievev
MERK: For disseksjon av arbeiderbier, bruk et dissekeringsmikroskop med en LED-lyskilde. Den mest nyttige forstørrelsen er ~ 20x.- Manipulering og disseksjon
- Ta forsiktig en arbeiderbie med tang og legg den på is (eller i fryseren ved -20 ° C) i 2 minutter for å immobilisere den22. Fest bien på petriskålen diagonalt gjennom den øverste bakre delen av thoraxen to ganger, fra venstre til høyre og fra høyre til venstre.
- Hell insekt saltvann for å dekke kroppen. Plasser petriskålen under mikroskopet, fokuser og juster.
- Forbered instrumentene (se materialtabellen).
- Disseksjon av midgut
- Start med buken ved å sette inn ett punkt på saksen under tergite A5 (figur 1) i midten av høyre side av biekroppen. Klipp til tergite A2.
- Hold saksens indre blad parallelt med siden av kroppen for å unngå å skade de indre organene. Vri saksen til venstre og lag ett kutt; ta til høyre og gjør et nytt kutt. Åpne forsiktig venstre del av magen og fest den. Gjenta på den andre siden.
- Bruk tang med den ene hånden, trekk forsiktig honningbiemagen oppover, og med saks i den andre hånden, kutt helt i enden av spiserøret. Trekk magen og midgut vekk fra magen og kutt i endetarmen. Bruk en pipette med insekt saltoppløsning og fjern avføring eller deler av vevet.
- Disseksjon av HPG-er
- Immobiliser en arbeiderbie på is som beskrevet i trinn 1.1.1. Klipp hodet av og legg det på den mindre platen med antennene vendt opp. Fest hodet med to pinner: en gjennom venstre sammensatte øye og den andre gjennom høyre sammensatte øye.
- Lag et kutt over det første sammensatte øyet på innsiden av pinnene, fortsett til labrum, og gjør deretter et nytt kutt på den andre siden over det andre sammensatte øyet (figur 2).
- Klipp av antennene. Løft av masken og kutt der den fortsatt er festet. Ta tangen og fjern kjertlene forsiktig sammen med hjernen og en del av de sammensatte øynene.
- Manipulering og disseksjon
- Fiksering, dehydrering og parafininnbygging
MERK: Bruk vernehansker.- Plasser vevet i penicillinflasker, fylt 3/4 med 10% formalin. Oppbevares i kjøleskap ved 4 °C.
- Etter 24 timer dehydrerer vevet i en serie alkoholer: 70%, 80%, 90%, 100%, i 1 time hver, 100% 2-propanol i 1 time, 100% 2-propanol i 12 timer og til slutt 100% 2-propanol i 1 time.
- Plasser vevet i histocassettes; Merk og plasser dem i glasskamrene med 2-propanol og parafin (1:1) i en inkubator ved 60 °C i 24 timer.
- Flytt histokassettene til et annet kammer med parafin (I.) i ytterligere 24 timer. Gjenta prosedyren med fersk parafin to ganger til (II. og III.), begge i 24 timer.
- Til slutt, klargjør monteringsstasjonen og begynn å legge inn vevet i voks.
- Åpne hver histocassette og fjern dekselet. Fyll formen med voks og legg forsiktig vevet med varme tang i midten av formen.
- Plasser histokassetten på formen og dekk den litt med voks. Plasser formen umiddelbart på den kalde overflaten av monteringsstasjonen i noen sekunder, og legg den deretter på kjøleplaten i noen minutter til voksen stivner og skiller seg fra formen sammen og histokassetten.
- Oppbevar de ferdige prøvene i en eske, borte fra støv og varme.
- Klipp 4 μm tynne seksjoner på en mikrotom: først to seksjoner festet til hverandre og deretter en separat. Overfør seksjonene med tang og la dem flyte på destillert vann (42 ° C), og samle dem deretter på rene lysbilder ved å plassere to seksjoner sammen på venstre side av objektivglasset og den tredje på høyre side, og forbli tydelig atskilt. La de merkede lysbildene stå over natten på varmeapparatet og lagre dem til slutt i en boks dedikert til histologiprøver.
- Devoksing og rehydrering
MERK: Bruk vernehansker.- Forbered ni Coplin-krukker og legg seksjonene i en serie clearingagenter (I., II., III.) i 5 minutter hver.
- Sett i 2-propanol, etanol 96% (I., II.), alkohol 90% og 80%, og destillert vann i 3 minutter hver.
- Farging med hematoksylin og eosin
MERK: Bruk vernehansker.- Forbered seks Coplin-krukker.
- For farging av hematoksylin og eosin (H&E), legg de devoksede, rehydrerte seksjonene i hematoksylin i 5 minutter, og legg dem deretter forsiktig under rennende vann fra springen i 2 minutter. Legg dem deretter i destillert vann i 1 min og eosin i 4 minutter (for eosin er Coplin-krukken ikke nødvendig).
- Plasser lysbildene i etanol 96% i 1 min, deretter 2-propanol i 2 minutter, og til slutt i ryddemiddelet i 2 minutter.
- Legg til monteringsmedium og et dekselglass og la dem tørke. Vær oppmerksom under et lysmikroskop.
Figur 1: Dorsal utsikt over honningbiekroppen. A1-A7 tergites. De detaljerte instruksjonene om honningbiedisseksjon finner du i Carreck et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Dorsal visning av HPG, deler av sammensatte øyne festet til hjernen (ikke synlig). En ung arbeiderbie i alderen 5 til 6 dager har klumpete og kremete hvite HPG-er. Acini ligger på hjernen og fyller hodeområdet med grener som når baksiden av hjernen. I foraging bier, er disse kjertlene sterkt krympet og forlater bare tynne trådlignende rester. Av denne grunn er det bedre å fjerne kjertler sammen med hjernen for å gjøre det lettere i videre prosedyrer for å unngå å miste vevet. Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Celledødsdeteksjon i vevsseksjoner
- Deteksjonssett for apoptose (analyse A)
MERK: Følg produsentens protokoll (se materialtabellen).- Forbered Coplin-krukkene.
- Etter avvoksing og rehydrering (se trinn 1.3), senk lysbildene i 0,85% NaCl-løsning, og deretter i fosfatbufret saltvann (PBS) (5 min).
- Sett lysbildene i 4% paraformaldehyd 2 x 15 min.
- Plasser lysbildene flatt i beholderen og tilsett 100 μL av en Proteinase K (20 μg / ml) løsning, og la dem stå i 10-30 minutter.
- Plasser lysbildene i PBS (5 min).
- Plasser lysbildene i 4% paraformaldehyd i PBS (5 min).
- Senk lysbildene i PBS (2 x 5 min).
- Plasser lysbildene flatt i beholderen, legg til 100 μL likevektsbuffer, og la dem stå i 5-10 minutter.
- Tilsett 100 μL TdT-reaksjonsblanding. Legg papirhåndklær inne i beholderen, rundt lysbildene, fukt håndklærne med vann, og dekk deretter med plastfolie. Inkuber lysbilder i 60 minutter ved 37 °C.
- Plasser lysbildene tilbake i fargestativet og senk i 2x saltvann-natriumcitrat (SSC) i 15 minutter.
- Senk lysbildene 3 x 5 min i PBS, deretter i 0,3% hydrogenperoksid i 3-5 minutter, og deretter i PBS igjen, 3 x 5 min.
- Legg igjen lysbildene flatt i beholderen, tilsett 100 μL Streptavidin HRP (pepperrotperoksidase), og la stå i 30 minutter (deksel med plastfolie).
- Senk lysbildene 3 x 5 min i PBS.
- Plasser lysbildene flatt i beholderen og tilsett 100 μL 3,3'-diaminobenzidin (DAB) løsning. Se etter en lysebrun bakgrunn.
- Sett lysbildene tilbake til stativet og vask dem flere ganger i vann (dobbeltdestillert).
- Monter lysbildene under glassduker i monteringsmedium og la det være flatt å tørke.
- Vær oppmerksom under et lysmikroskop.
- Deteksjonssett for apoptose (analyse B)
MERK: Følg produsentens protokoll (se materialtabellen).- Forbered Coplin krukker.
- Forbered proteinase K (20 μg / ml fortynnet i PBS).
- Etter avvoksing og rehydrering av seksjonene (trinn 1.3), plasser lysbildene i PBS i 5 min.
- Plasser lysbildene flatt i beholderen og tilsett proteinase K (20 μg/ml, 60 μL per 5 cm² prøve).
- Vask lysbildene 2 x 2 min i destillert vann.
- Slukk i endogen peroksidase (i 3% hydrogenperoksidase) ved romtemperatur.
- Skyll lysbildene 2 x 5 min med PBS eller vann.
- Plasser lysbildene flatt i beholderen og bruk likevektsbuffer (75 μL / 5 cm2) i 10 s ved romtemperatur.
- Tørk forsiktig rundt vevet.
- Tilsett TdT-enzymet (terminal deoksynukleotidyltransferase) til hver seksjon og inkuber i et fuktet kammer i 1 time ved 37 °C. Legg papirhåndklær inne i brettet, rundt lysbildene, fukt håndklærne med vann og dekk dem med plastfolie.
- Etter inkubasjon, legg prøvene i stativet og la dem stå i stopp/vask-buffer (10 min).
- Varm anti-digoxigenin-konjugatet til romtemperatur.
- Vask lysbildene i PBS (3 x 1 min).
- Tørk forsiktig av rundt vevet.
- Tilsett to dråper Anti-Digoxigenin-Peroxidase-konjugat (65 μL / 5 cm²) til seksjonene og inkuber i 30 minutter i en fuktet beholder.
- Etter vask i PBS 4 x 2 min, klargjør peroksidasesubstratet med arbeidsstyrke, og bank forsiktig av overflødig væske og aspirer rundt seksjonen.
- Dekk seksjonene med peroksidasesubstrat (75 μL / 5 cm²) og flekk i 5 min. Plasser et lysbilde under mikroskopet og bestem den optimale fargetiden.
- Vask lysbildene i et fargestativ i destillert vann (3 x 1 min).
- Inkuber lysbildene i destillert vann i 5 min.
- Counterstain bruker hematoxylin i 2 min.
- Plasser lysbildet under rennende vann fra springen i 3 min.
- Vask lysbildet i destillert vann.
- Monter lysbildene under glassduker i monteringsmedium og la det være flatt å tørke.
- Vær oppmerksom under et lysmikroskop.
- Apoptose deteksjon kit (analyse C)
MERK: Følg produsentens protokoll (se materialtabellen).- Forbered Coplin-krukkene.
- Devoks og rehydrer vevsseksjonene (se trinn 1.3).
- Inkuber vevet med proteinase K (15-30 min ved 37 °C).
- Plasser lysbildene tilbake på stativet og skyll 2x i PBS.
- Dekk med 50 μL 'TUNEL reaksjonsblanding'. Legg våte papirhåndklær inne i beholderen, dekk dem med plastfolie, og la dem stå i 60 minutter ved 37 °C.
- Skyll 3x med PBS.
- Plasser lysbildene i beholderen og tørk området rundt vevsprøven.
- Tilsett 50 μL omformer-AP til prøven og inkuber i en fuktet beholder i 30 minutter ved 37 °C.
- Skyll 3x i PBS.
- Tilsett 50-100 μL substratoppløsning og la stå i 10 minutter i mørket.
MERK: Vær oppmerksom på fargingen under et lysmikroskop. - Skyll lysbildene 3x med PBS.
- Motvirke ved å overføre seksjoner til hematoksylin i 2 minutter og skyll deretter forsiktig i rennende vann fra springen i 5 minutter.
- Monter lysbildene under glassdeksler i et vandig monteringsmedium og la dem tørke flatt.
- Vær oppmerksom under et lysmikroskop. Vurder de berørte (positive) cellene ved å telle 70 til 100 celler i hver prøve av midgut eller HPGs under et lysmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celledød deteksjon i midgut
Nylig oppståtte arbeiderbier (Apis mellifera carnica) fra den eksperimentelle bigården ved Agricultural Institute of Slovenia i Ljubljana ble individuelt behandlet med 3% oksalsyre (OA)23. OA brukes ofte i birøkt for Varroa destructor kontroll. Etter behandlingen ble arbeiderbiene (tre fra hver gruppe) immobilisert på is. Midgut ble dissekert og fikset den i 10% formalin. Vevet ble deretter dehydrert i en rekke alkoholløsninger og til slutt innebygd i parafinvoks. Etter å ha blitt kuttet med en mikrotom i 7 μm tynne seksjoner, ble vevsprøvene forberedt for analyse. Ved hjelp av et lysmikroskop ble prosentandelen av berørte celler (70-100 celler fra hver av tre midgutprøver) beregnet. Resultatene med Assay B indikerte at behandling med OA signifikant påvirket cellene i midttarmen (figur 3). Analyse A viste ingen forskjell mellom behandlede og kontrollbier; frekvensen av celledød var under 10%. I kontrollbier, bare matet sukker sirup, var morfologien til midgut upåvirket og godt bevart.
Figur 3: Midgut. (A) Hematoxylin og eosin farging; (B) immunostaining (Assay C) av midgut. Intens rød farging er lokalisert i kjernene i midgutcellene. Skala barer = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Registrering av celledød i HPG-er
I neste forsøk ble eksperimentet utført, og valgte tre sykdomsfrie kolonier (Apis mellifera L.). Kammer med dekket brød ble plassert i en inkubator (34,5 °C), og de nyoppståtte arbeiderbiene ble merket med en flekk på thoraxen for å definere alder. Denne prosedyren ble gjentatt tre ganger for å oppnå forskjellige eldre bier. Biene ble merket og returnert til kolonien. Biene ble prøvetatt etter 30 dager fra begynnelsen av forsøket. Til slutt ble de satt inn i et 7,5 cm x 4 cm x 4 cm hamstringsbur, med netting på den ene siden og oppbevart i en kuvøse ved 28 °C.
Arbeidere ble behandlet med insektmiddel (imidakloprid) eller akaricid (coumaphos), begge løsninger i subletale doser, eller sukker sirup som en kontrollgruppe10. Biene i forskjellige grupper ble immobilisert og HPG-ene dissekert. En prøve besto av tre til fem arbeidere fra samme gruppe for å få så mange celler som mulig. De berørte cellene ble evaluert ved hjelp av immunohistologimetoder. Røde (Assay C) og brune (Assay B) reaksjonsprodukter ble påvist i de apoptotiske kjernene til HPG. Positive røde kjerner etter imidakloprid- eller coumaphosbehandling ble bestemt i de fleste kjertelceller (figur 4), og bare sporadiske cellekjerner viste brunt reaksjonsprodukt fra de samme behandlede gruppene. Kontrollgruppen hadde ingen skadede HPG-celler.
Figur 4: Hypofaryngeale kjertler. (A) Hematoxylin og eosin farging; (B) immunostaining (analyse C). Rød farging er lokalisert i cellekjernene. (C) Immunostaining (analyse B). Brunt reaksjonsprodukt indikerer de positive cellekjernene. Skalastenger = 50 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I levende organismer er celledød definert som apoptose eller nekrose25 og kan ledsages av autofagi26. Forskjellen mellom apoptotiske og nekrotiske celler er at apoptose er en form for programmert celledød og vises i normale celler, mens nekrose oppstår på grunn av dødelige forhold (f.eks. Ulykke, sykdom)27,28. Apoptose kan detekteres ved hjelp av analysesett basert på TUNEL-teknikken (påvisning avDNA-fragmentering ved merking av 3′-hydroksyl-termini i dobbeltstrengede DNA-pauser generert under apoptose). Ulike sett gir flere nivåer av følsomhet for å oppdage celle sletting.
En av analysene (Assay C) er svært følsom og oppdager både apoptose og nekrose29; den andre analysen (B) viser høyere sensitivitet for påvisning av apoptotisk celledød30. Prinsippet med analyse C er å oppdage DNA-brudd i de tidlige stadiene av apoptose. Etter å ha festet og permeabilisert de apoptotiske cellene, inkuberes vevet med en TUNEL-reaksjonsblanding. I mellomtiden er TdTs rolle å katalysere tilsetningen av fluorescein-dUTP ved frie 3′-OH-grupper i DNA. Etter at vevet er vasket, markerer antifluoresceinantistoffet etiketten i de skadede delene av DNA. Prinsippet for antistoffet er å feste seg til enzymet alkalisk fosfatase som fungerer som reporter. Til slutt kan AP ses som et resultat av denne spesifikke reaksjonen31.
Hematoksylin og eosinfarging av organer er en enkel og nyttig metode for morfologisk analyse ved hjelp av lysmikroskopi. Det anbefales å inkludere dette trinnet først for å observere eventuelle morfologiske endringer i celler. For påvisning av tidlige stadier av apoptose i de tynne delene av honningbievev, er minst to sett tilgjengelig for immunhistokjemisk analyse (se materialtabellen). Begge gjør de apoptotiske cellekjernene mørkebrune og visualiseres ved hjelp av lysmikroskopi. Ved hjelp av Assay A (TUNEL-teknikk) konjugerer Streptavidin HRP (pepperrotperoksidase) til biotinylerte nukleotider, og apoptotiske kjerner blir brune etter reaksjonen av DAB (diaminobenzidin, et stabilt kromogen). Analyse B skiller celleskader ved påvisning av DNA-spaltning og kondensert kromatin, som er et tegn på tidlig apoptose.
I en sunn organisme kan nivået av cellefornyelse vanligvis vurderes i små prosenter32,33. Celledød i midttarmen økte etter OA-behandlingen, noe som indikerer at bruken av OA har en skadelig effekt på arbeiderbienes midguts i laboratorieeksperimenter. Gruppen av bier behandlet med imidakloprid og coumaphos viste økt celledød (røde kjerner) i matkjertlene10, noe som indikerer celleskade eller nekrose; Programmert celledød ble funnet på et lavt nivå (brune kjerner)10. Imidlertid ble nekrotisk og apoptotisk celledød funnet på høye nivåer, spesielt etter imidakloprid behandling. I gruppen av ubehandlede bier var nivået av programmert celledød i HPG ikke mer enn 10%, noe som er i samsvar med normal vevsomsetning32.
Celledød, både på grunn av skade eller programmert celledød, ble påvist ved både analyser (B og C) og resulterte i forskjellig følsomhet; den første oppdager både nekrotisk og programmert celledød11. Som bekreftet hos de friske arbeiderne (kontrollgruppen), oppdaget begge analysene sporadiske positive celler bare10. Apoptose- og nekrosedeteksjonsanalysene som ble brukt i immunhistokjemisk analyse av honningbievev, viste seg å være en kraftig metode for å utforske de subletale effektene av forskjellige stoffer på honningbier.
Kritiske trinn i protokollen:
Etter å ha blitt kuttet med en mikrotom, må vevsseksjoner plasseres på objektivglasset på en varm tallerken (flattningsbord, se materialtabell) over natten. Det er viktig at prøvene er godt tørket for fremtidige trinn i protokollene. Når vevet ikke er godt festet til glasset, kan det løsne fra overflaten i prosedyren for celledødsdeteksjon. Det anbefales å bruke lysmikroskopet for å verifisere tilstedeværelsen av ønsket vev. Deretter er det nyttig å farge det første lysbildet med H &E for å se etter riktig seksjon med mange celler (spesielt kjertelvevet) og forberede nye i tilfelle midttarmseksjonen ikke er hensiktsmessig. HPG-er kan være ganske utfordrende å finne, så det må tas hensyn til ikke å kutte for mange seksjoner; Ellers vil kjertlene gå tapt.
Å legge til positiv kontroll for å oppdage DNA-fragmentering er nyttig, men valgfritt. Det er viktig å behandle lysbildene separat for å unngå høy bakgrunnsfarging i de eksperimentelle lysbildene. I Assay B er de positive kontrollene inkludert i noen av settene (se materialtabell); andre bør kjøpes separat.
Metoden har en begrensning i lengde og presisjon. Bevaring av vev i et vandig monteringsmedium er bare kortsiktig (under 3 måneder). Hvis lengre bevaring er ønsket (anbefales ikke på grunn av mulige fargeendringer), finnes det andre medier, men resultatene er ikke like pålitelige.
Bruk av disse to metodene (apoptose og nekrosedeteksjon) samtidig er svært nyttig for å sammenligne de forskjellige effektene av plantevernmidler på honningbievev, spesielt for subletale effekter. Den alternative metoden ville være observasjon av foraging aktivitet og dens innvirkning på den kognitive oppfatningen av arbeiderbier påvirket av plantevernmidler. En slik metode ville være raskere i å oppdage subletale effekter på voksne biers aktiviteter, men ville ikke svare på noen spørsmål om omfanget av den indre skaden som kan endre atferd i tidlig stadium, som hos unge (sykepleier) bier.
Histologisk analyse av honningbievevets enkle morfologi er et solid grunnlag for å nærme seg ulike forskningsperspektiver i celleskade, apoptose eller misdannelser. Årsakene til bruk av plantevernmidler i miljøet eller kolonibehandling på grunn av parasitter og kan være skadelige og påvirke honningbiens levetid og kolonioverlevelse betydelig. Midgut og HPGs er essensielle organer i honningbier og har evne og formål til raskt å reagere på noen form for negative eksterne faktorer som påvirker biernes aldersrelaterte aktiviteter. HPG-ene reduseres i størrelse og sekresjonsevne, og epitelceller i midttarmen reagerer med økt celledød. Immunhistokjemiske metoder, som in situ-studier , er nyttige verktøy for apoptosedeteksjon i bievev. De viser også potensialet for å bli implementert i studier av mulige bivirkninger på honningbier og andre gunstige insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Jeg takker for støtten fra det slovenske forskningsbyrået, bevilgning nr. P4-133.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R.
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , Dadant and Sons. 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. , Cornell University Press. (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , Taylor & Francis Group. 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M.
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, Ö Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , Chapman & Hall. London. (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D'Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
