Summary
Immunhistochemische Methoden sind in der Honigbienenforschung nützlich, um den Grad der Apoptose und Nekrose in den Mitteldarm- und Hypopharynxdrüsen erwachsener Bienen zu erkennen und zu beurteilen.
Abstract
Honigbienen (Apis mellifera L.) innerhalb des Bienenstocks (Ammenarbeiter und andere Bienenstöcke) und außerhalb des Bienenstocks (Sammler) sind Klima- und Wetteränderungen, verschiedenen Pestiziden, Krankheitserregern und Unterernährung ausgesetzt, die hauptsächlich durch den Mund gelangen und hauptsächlich den Verdauungstrakt erwachsener Bienen betreffen. Um die Auswirkungen solcher externen und inneren Stressoren auf Honigbienen zu verstehen und zu verhindern, ist eine nützliche Forschungsmethode die immunhistochemische Methode. Es wird ein grundlegendes Protokoll beschrieben, um den Mitteldarm (Ventriculus) und die hypopharyngealen Drüsen (HPGs) erwachsener Bienen für die histologische Analyse vorzubereiten. Eine detaillierte Methodik wird beschrieben, um den Grad der Zellschädigung zu beurteilen und die Nekrose vom programmierten Zelltod (Apoptose) als natürlichen Prozess der Geweberegeneration zu unterscheiden. Die Ergebnisse der adulten Honigbienenbehandlung mit Oxalsäure und Pestiziden (Insektizid und Akarizid) und die Bestimmung des Zelltods im Ventriculus und HPGs werden vorgestellt. Die Vor- und Nachteile der Methodik werden ebenfalls diskutiert.
Introduction
Honigbienen (Apis mellifera L.) sind neben anderen Wildbestäubern die wichtigsten Bestäuber landwirtschaftlicher Pflanzen. Über Tausende von Jahren hat die sich verändernde Umwelt Bienen beeinflusst, ihre Morphologie, Physiologie, ihr Verhalten und ihre Toleranz an verschiedene Krankheitserreger und Parasiten anzupassen. Daher haben Honigbienen rund um den Globus ein sehr vielfältiges Arten- und Unterartenspektrum entwickelt1. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Befunden überein, dass es genetische Variationen in der Verdauungstraktstruktur der Honigbiene gibt, deuten aber auch darauf hin, dass Veränderungen des Mitteldarms auf Umweltfaktoren zurückzuführen sind 2,3.
Der Verdauungstrakt der Honigbiene besteht aus drei Hauptteilen: Vorderdarm, Mitteldarm (Ventriculus) und Hinterdarm4. Der Ventriculus ist ein essentielles Organ für die Verdauung von Pollen und Nektar/Honig; Im Hinterdarm erfolgt die osmotische Kontrolle durch Aufnahme von Wasser und Ionen2. Die hypopharyngealen Drüsen (HPGs) von Honigbienenarbeitern befinden sich im Kopf und synthetisieren und sezernieren Gelée Royale-Komponenten, um die Brut, die Königin und Mitglieder der Kolonie zu füttern. Ihre Größe ändert sich mit Alter und Aufgaben und hängt von der richtigen Ernährung (Qualitätspollen) ab. Krankenschwestern im Alter von 6 bis 18 Tagen führen Brutaufzucht durch, und die Größe der HPGs nimmtum 5,6 zu. Bei Sammelbienen degenerieren die HPGs und sezernieren nur Enzyme, die wichtig sind, um die komplexen Zucker in einfache umzuwandeln (α-Glucosidasen, Leucin-Arylamidase, Invertase) in Honig7.
Honigbienen sind mehreren biotischen und abiotischen Stressoren ausgesetzt8, und der Verdauungstrakt kann durch mehrere negative Stimulanzien beeinträchtigt werden. Die erste Barriere, die den Organismus vor Krankheitserregern schützt, ist die peritrophe Membran im Mitteldarm, die zum Schutz vor Krankheitserregern aus Darmschleimhaut besteht4. Die Entwicklung und Funktion von HPGs hängen von Ernährung, Alter und Koloniezustandab 9 und werden durch Insektizide, Akarizide 10 und Krankheitserreger11,12,13 beeinflusst. Akarizidrückstände im Bienenstock aufgrund der Varroabekämpfung und Pestizide aus der Umwelt beeinträchtigen Sammlerbienen und Ammenbienen14,15. Die größte Bedrohung für Honigbienenvölker ist die Milbe Varroa destructor, sowohl als Vektor von Viren, die zu Völkerverlusten beitragen16 als auch als Konsument des Fettkörpers des Wirts (ein wichtiges lebenswichtiges Organ bei Honigbienen), der folglich den Körper und die Koloniefunktionen des Individuums beeinträchtigt17.
Intensive landwirtschaftliche Lebensräume können jedoch eine kurzfristige Nahrungsversorgung für Honigbienen darstellen. Daher sollten Agrarumweltmaßnahmen die Verfügbarkeit von Honigblumen in Agrarlandschaften verbessern18. Um die Morphologie verschiedener Unterarten 6,19,20,21 oder subletale Effekte dieser Faktoren auf Zell- oder Gewebeebene, insbesondere Mitteldarm und HPGs, zu beurteilen, sind histologische und immunhistochemische Methoden praktisch und ausreichend genau, um in der histologischen Forschung an Honigbienen eingesetzt zu werden.
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Protocol
1. Grundlagenhistologie für die Honigbienenforschung
- Dissektion von Honigbienengewebe
HINWEIS: Verwenden Sie für die Sektion von Arbeiterbienen ein Seziermikroskop mit einer LED-Lichtquelle. Die nützlichste Vergrößerung ist ~ 20x.- Manipulation und Sezieren
- Eine Arbeitsbiene vorsichtig mit einer Pinzette nehmen und für 2 min auf Eis (oder in den Gefrierschrank bei -20 °C) legen, um sie zu immobilisieren22. Stecken Sie die Biene auf die Petrischale schräg durch den obersten hinteren Teil des Thorax zweimal, von links nach rechts und von rechts nach links.
- Gießen Sie Insektenkochsalzlösung, um den Körper zu bedecken. Legen Sie die Petrischale unter das Mikroskop, fokussieren Sie und stellen Sie sie ein.
- Bereiten Sie die Instrumente vor (siehe Materialtabelle).
- Dissektion des Mitteldarms
- Beginnen Sie mit dem Bauch, indem Sie einen Punkt der Schere unter dem Tergit A5 (Abbildung 1) in der Mitte der rechten Seite des Bienenkörpers einführen. Auf den Tergit A2 schneiden.
- Halten Sie die innere Klinge der Schere parallel zur Körperseite, um eine Beschädigung der inneren Organe zu vermeiden. Drehen Sie die Schere nach links und machen Sie einen Schnitt; Biegen Sie rechts ab und machen Sie einen weiteren Schnitt. Öffnen Sie vorsichtig den linken Teil des Bauches und stecken Sie ihn fest. Wiederholen auf der anderen Seite.
- Ziehen Sie mit einer Hand die Honigbiene vorsichtig nach oben und schneiden Sie mit einer Schere in der anderen Hand ganz am Ende der Speiseröhre. Ziehen Sie den Magen und den Mitteldarm vom Bauch weg und schneiden Sie am Rektum ab. Verwenden Sie eine Pipette mit Insektenkochsalzlösung und entfernen Sie Kot oder Teile des Gewebes.
- Dissektion von HPGs
- Immobilisieren Sie eine Arbeitsbiene auf Eis, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben. Schneiden Sie den Kopf ab und legen Sie ihn mit den Antennen nach oben auf die kleinere Platte. Sichern Sie den Kopf mit zwei Stiften: einen durch das linke Facettenauge und den zweiten durch das rechte Facettenauge.
- Machen Sie einen Schnitt über das erste Facettenauge auf der Innenseite der Stifte, fahren Sie weiter zum Labrum und machen Sie dann einen weiteren Schnitt auf der anderen Seite über das zweite Facettenauge (Abbildung 2).
- Schneiden Sie die Antennen ab. Heben Sie die Maske ab und schneiden Sie sie dort ab, wo sie noch befestigt ist. Nehmen Sie die Pinzette und entfernen Sie vorsichtig die Drüsen zusammen mit dem Gehirn und einem Teil der Facettenaugen.
- Manipulation und Sezieren
- Fixierung, Dehydratation und Paraffineinbettung
HINWEIS: Tragen Sie Schutzhandschuhe.- Legen Sie das Gewebe in Penicillinflaschen, gefüllt zu 3/4 mit 10% Formalin. Im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahren.
- Nach 24 h dehydrieren Sie das Gewebe in einer Reihe von Alkoholen: 70%, 80%, 90%, 100%, für jeweils 1 h, 100% 2-Propanol für 1 h, 100% 2-Propanol für 12 h und schließlich 100% 2-Propanol für 1 h.
- Legen Sie das Gewebe in Histokassetten; markieren und in die Glaskammern mit 2-Propanol und Paraffin (1:1) in einen Inkubator bei 60 °C für 24 h legen.
- Die Histokassetten für weitere 24 h in eine andere Kammer mit Paraffin (I.) bringen. Wiederholen Sie den Vorgang mit frischem Paraffin noch zweimal (II. und III.), beide für 24 h.
- Bereiten Sie abschließend die Montagestation vor und beginnen Sie mit der Einbettung des Gewebes in Wachs.
- Öffnen Sie jede histokassette und entfernen Sie die Abdeckung. Füllen Sie die Form mit Wachs und legen Sie das Gewebe vorsichtig mit einer warmen Pinzette in die Mitte der Form.
- Legen Sie die histokassette auf die Form und bedecken Sie sie leicht mit Wachs. Legen Sie die Form sofort für einige Sekunden auf die kalte Oberfläche der Montagestation, dann legen Sie sie für einige Minuten auf die kalte Platte, bis das Wachs aushärtet und sich von der Form und der histokassette trennt.
- Lagern Sie die fertigen Proben in einer Box, weg von Staub und Hitze.
- Schneiden Sie 4 μm dünne Schnitte auf einem Mikrotom: zuerst zwei Abschnitte, die aneinander befestigt sind, und dann einen separat. Übertragen Sie die Abschnitte mit einer Pinzette und lassen Sie sie auf destilliertem Wasser (42 °C) schwimmen, sammeln Sie sie dann auf sauberen Objektträgern, indem Sie zwei Abschnitte auf der linken Seite des Objektivglases und den dritten auf der rechten Seite zusammenlegen, wobei sie deutlich getrennt bleiben. Lassen Sie die markierten Objektträger über Nacht auf dem Heizgerät und bewahren Sie sie schließlich in einer Box für histologische Proben auf.
- Entwachsung und Rehydratation
HINWEIS: Tragen Sie Schutzhandschuhe.- Bereiten Sie neun Coplin-Gläser vor und legen Sie die Abschnitte für jeweils 5 min in eine Reihe von Clearingmitteln (I., II., III.).
- In 2-Propanol, Ethanol 96% (I., II.), Alkohol 90% und 80% und destilliertes Wasser für jeweils 3 min gegeben.
- Färben mit Hämatoxylin und Eosin
HINWEIS: Tragen Sie Schutzhandschuhe.- Bereiten Sie sechs Coplin-Gläser vor.
- Für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H & E) legen Sie die entwachsten, rehydrierten Abschnitte für 5 min in Hämatoxylin und legen Sie sie dann vorsichtig für 2 min unter das fließende Leitungswasser. Dann legen Sie sie für 1 min in destilliertes Wasser und Eosin für 4 min (für Eosin ist das Coplin-Glas nicht notwendig).
- Die Objektträger in Ethanol 96% für 1 min, dann 2-Propanol für 2 min und schließlich für 2 min in das Clearingmittel geben.
- Fügen Sie ein Montagemedium und ein Deckglas hinzu und lassen Sie sie trocknen. Unter einem Lichtmikroskop beobachten.
Abbildung 1: Dorsale Ansicht des Honigbienenkörpers. A1-A7 Tergite. Die detaillierte Anleitung zur Sektion von Honigbienen findet sich in Carreck et al.24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Dorsale Ansicht von HPGs, Teile von Facettenaugen, die am Gehirn befestigt sind (nicht sichtbar). Eine junge Arbeiterbiene im Alter von 5 bis 6 Tagen hat pralle und cremeweiße HPGs. Die Acini befinden sich im Gehirn und füllen den Kopfbereich mit Ästen, die den hinteren Teil des Gehirns erreichen. Bei Futterbienen sind diese Drüsen stark geschrumpft und hinterlassen nur dünne fadenförmige Überreste. Aus diesem Grund ist es besser, Drüsen zusammen mit dem Gehirn zu entfernen, um es bei weiteren Verfahren zu erleichtern, um den Verlust des Gewebes zu vermeiden. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
2. Zelltodnachweis in Gewebeschnitten
- Apoptose-Detektionskit (Assay A)
HINWEIS: Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle).- Bereiten Sie die Coplin-Gläser vor.
- Nach der Entwachsung und Rehydratation (siehe Schritt 1.3) tauchen Sie die Objektträger in 0,85%ige NaCl-Lösung und dann in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (5 min).
- Legen Sie die Objektträger in 4% Paraformaldehyd 2 x 15 min.
- Legen Sie die Objektträger flach in den Behälter und fügen Sie 100 μL einer Proteinase K (20 μg / ml) Lösung hinzu und lassen Sie sie dann für 10-30 min.
- Legen Sie die Dias in PBS (5 min).
- Legen Sie die Objektträger in 4% Paraformaldehyd in PBS (5 min).
- Tauchen Sie die Dias in PBS (2 x 5 min).
- Legen Sie die Objektträger flach in den Behälter, fügen Sie 100 μL Gleichgewichtspuffer hinzu und lassen Sie sie für 5-10 min.
- Fügen Sie 100 μL TdT-Reaktionsmischung hinzu. Legen Sie Papierhandtücher in den Behälter, um die Objektträger herum, befeuchten Sie die Handtücher mit Wasser und bedecken Sie sie dann mit Plastikfolie. Objektträger 60 min bei 37 °C inkubieren.
- Legen Sie die Objektträger zurück in das Färbegestell und tauchen Sie 15 min in 2x Kochsalzlösungs-Natriumcitrat (SSC) ein.
- Tauchen Sie die Objektträger 3 x 5 min in PBS, dann 3-5 min in 0,3% Wasserstoffperoxid und dann wieder in PBS, 3 x 5 min.
- Legen Sie die Objektträger erneut flach in den Behälter, fügen Sie 100 μL Streptavidin HRP (Meerrettichperoxidase) hinzu und lassen Sie sie 30 Minuten einwirken (mit Plastikfolie abdecken).
- Tauchen Sie die Dias 3 x 5 min in PBS.
- Legen Sie die Objektträger flach in den Behälter und fügen Sie 100 μL 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Lösung hinzu. Suchen Sie nach einem hellbraunen Hintergrund.
- Bringen Sie die Objektträger wieder in das Gestell und waschen Sie sie mehrmals in Wasser (doppelt destilliert).
- Montieren Sie die Dias unter Glasdeckgläsern in Montagemedium und lassen Sie sie flach trocknen.
- Unter einem Lichtmikroskop beobachten.
- Apoptose-Detektionskit (Assay B)
HINWEIS: Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle).- Coplin-Gläser vorbereiten.
- Proteinase K (20 μg/ml verdünnt in PBS) herstellen.
- Nach dem Entwachsen und Rehydrieren der Abschnitte (Schritt 1.3) legen Sie die Objektträger für 5 min in PBS.
- Die Objektträger flach in den Behälter geben und Proteinase K (20 μg/ml, 60 μL pro 5 cm² Probe) hinzufügen.
- Die Objektträger 2 x 2 min in destilliertem Wasser waschen.
- Quench in endogener Peroxidase (in 3% Wasserstoffperoxidase) bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Objektträger 2 x 5 min mit PBS oder Wasser ab.
- Legen Sie die Objektträger flach in den Behälter und tragen Sie einen Gleichgewichtspuffer (75 μL/5 cm2) für 10 s bei Raumtemperatur auf.
- Wischen Sie vorsichtig um das Gewebe herum.
- Zu jedem Abschnitt wird das Enzym TdT (terminale Desoxynukleotidyltransferase) hinzugefügt und in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei 37 °C inkubiert. Legen Sie Papiertücher in das Tablett, um die Rutschen herum, befeuchten Sie die Handtücher mit Wasser und bedecken Sie sie mit Plastikfolie.
- Nach der Inkubation legen Sie die Proben in das Gestell und lassen Sie sie im Stop/Wash-Puffer (10 min).
- Erwärmen Sie das Anti-Digoxigenin-Konjugat auf Raumtemperatur.
- Die Objektträger in PBS waschen (3 x 1 min).
- Vorsichtig um das Gewebe herum abwischen.
- Zwei Tropfen Anti-Digoxigenin-Peroxidase-Konjugat (65 μL/5 cm²) zu den Abschnitten geben und 30 min in einem befeuchteten Behälter inkubieren.
- Nach dem Waschen in PBS 4 x 2 min das Peroxidasesubstrat in Arbeitsstärke vorbereiten und überschüssige Flüssigkeit vorsichtig abklopfen und um den Abschnitt herum aspirieren.
- Die Abschnitte mit Peroxidasesubstrat (75 μL/5 cm²) abdecken und 5 min einfärben. Legen Sie einen Objektträger unter das Mikroskop und bestimmen Sie den optimalen Färbezeitpunkt.
- Die Objektträger in einem Fleckengestell in destilliertem Wasser waschen (3 x 1 min).
- Die Objektträger in destilliertem Wasser 5 min inkubieren.
- Gegenfärbung mit Hämatoxylin für 2 min.
- Legen Sie die Folie für 3 min unter fließendes Leitungswasser.
- Waschen Sie den Objektträger in destilliertem Wasser.
- Montieren Sie die Dias unter Glasdeckgläsern in Montagemedium und lassen Sie sie flach trocknen.
- Unter einem Lichtmikroskop beobachten.
- Apoptose-Detektionskit (Assay C)
HINWEIS: Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle).- Bereiten Sie die Coplin-Gläser vor.
- Entwachsen und rehydrieren Sie die Gewebeabschnitte (siehe Schritt 1.3).
- Inkubieren Sie das Gewebe mit Proteinase K (15-30 min bei 37 °C).
- Legen Sie die Dias wieder auf das Rack und spülen Sie sie 2x in PBS ab.
- Mit 50 μL "TUNEL-Reaktionsgemisch" abdecken. Legen Sie nasse Papierhandtücher in den Behälter, bedecken Sie sie mit Frischhaltefolie und lassen Sie sie 60 Minuten bei 37 °C.
- 3x mit PBS abspülen.
- Legen Sie die Objektträger in den Behälter und trocknen Sie den Bereich um die Gewebeprobe ab.
- 50 μL Converter-AP in die Probe geben und 30 min bei 37 °C in einem befeuchteten Behälter inkubieren.
- Spülen Sie 3x in PBS.
- 50-100 μL Substratlösung zugeben und 10 min im Dunkeln stehen lassen.
HINWEIS: Beobachten Sie die Färbung unter einem Lichtmikroskop. - Spülen Sie die Objektträger 3x mit PBS ab.
- Gegenfärbung durch Übertragen von Abschnitten in Hämatoxylin für 2 min und dann vorsichtig in fließendem Leitungswasser für 5 min abspülen.
- Montieren Sie die Dias unter Glasdeckgläsern in einem wässrigen Montagemedium und lassen Sie sie flach trocknen.
- Unter einem Lichtmikroskop beobachten. Beurteilen Sie die betroffenen (positiven) Zellen, indem Sie 70 bis 100 Zellen in jeder Probe des Mitteldarms oder HPGs unter einem Lichtmikroskop zählen.
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Representative Results
Zelltodnachweis im Mitteldarm
Neu geschlüpfte Arbeiterbienen (Apis mellifera carnica) aus dem Versuchsimkerei des Landwirtschaftsinstituts Sloweniens in Ljubljana wurden einzeln mit 3% Oxalsäure (OA)23 behandelt. OA wird häufig in der Imkerei zur Varroa-Destruktorkontrolle eingesetzt. Nach der Behandlung wurden die Arbeiterbienen (drei aus jeder Gruppe) auf Eis immobilisiert. Der Mitteldarm wurde seziert und in 10% Formalin fixiert. Das Gewebe wurde dann in einer Reihe von Alkohollösungen dehydriert und schließlich in Paraffinwachs eingebettet. Nach dem Schneiden mit einem Mikrotom in 7 μm dünne Schnitte wurden die Gewebeproben für die Analyse vorbereitet. Mit einem Lichtmikroskop wurde der Prozentsatz der betroffenen Zellen (70-100 Zellen aus jeder der drei Mitteldarmproben) berechnet. Die Ergebnisse mit Assay B zeigten, dass die Behandlung mit OA die Zellen im Mitteldarm signifikant beeinflusste (Abbildung 3). Assay A zeigte keinen Unterschied zwischen behandelten und Kontrollbienen; Die Zelltodrate lag unter 10%. Bei Kontrollbienen, die nur mit Zuckersirup gefüttert wurden, war die Morphologie des Mitteldarms unberührt und gut erhalten.
Abbildung 3: Mitteldarm. (A) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung; (B) Immunfärbung (Assay C) des Mitteldarms. Intensive rote Färbung ist in den Kernen der Mitteldarmzellen lokalisiert. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zelltodnachweis bei HPGs
In der nächsten Studie wurde das Experiment durchgeführt, wobei drei krankheitsfreie Kolonien (Apis mellifera L.) ausgewählt wurden. Waben mit bedeckter Brut wurden in einen Brutkasten (34,5 °C) gelegt, und die neu geschlüpften Arbeiterbienen wurden mit einem Punkt auf dem Thorax markiert, um ihr Alter zu bestimmen. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt, um unterschiedlich gealterte Bienen zu erhalten. Die Bienen wurden markiert und in ihr Volk zurückgebracht. Die Bienen wurden nach 30 Tagen nach Beginn des Versuchs beprobt. Schließlich wurden sie in einen 7,5 cm x 4 cm x 4 cm großen Hortkäfig mit einseitigem Drahtgeflecht gelegt und in einem Inkubator bei 28 °C gehalten.
Die Arbeiter wurden mit Insektizid (Imidacloprid) oder Akarizid (Coumaphos), beides Lösungen in subletalen Dosen, oder Zuckersirup als Kontrollgruppe10 behandelt. Die Bienen verschiedener Gruppen wurden immobilisiert und die HPGs seziert. Eine Stichprobe bestand aus drei bis fünf Arbeitern aus derselben Gruppe, um so viele Zellen wie möglich zu erhalten. Die betroffenen Zellen wurden mit immunohistologischen Methoden ausgewertet. Rote (Assay C) und braune (Assay B) Reaktionsprodukte wurden in den apoptotischen Kernen von HPGs nachgewiesen. Positive rote Kerne nach Imidacloprid- oder Coumaphos-Behandlung wurden in der Mehrheit der Drüsenzellen bestimmt (Abbildung 4), und nur sporadische Zellkerne zeigten braune Reaktionsprodukte aus den gleichen behandelten Gruppen. Die Kontrollgruppe hatte keine beschädigten HPG-Zellen.
Abbildung 4: Hypopharynxdrüsen. (A) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung; (B) Immunfärbung (Assay C). Die rote Färbung ist in den Zellkernen lokalisiert. (C) Immunfärbung (Assay B). Braunes Reaktionsprodukt zeigt die positiven Zellkerne an. Maßstabsbalken = 50 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In lebenden Organismen wird der Zelltod als Apoptose oder Nekrose25 definiert und kann von Autophagie26 begleitet werden. Der Unterschied zwischen apoptotischen und nekrotischen Zellen besteht darin, dass Apoptose eine Form des programmierten Zelltods ist und in normalen Zellen auftritt, während Nekrose aufgrund tödlicher Bedingungen (z. B. Unfall, Krankheit) auftritt27,28. Apoptose kann mit Assay-Kits nachgewiesen werden, die auf der TUNEL-Technik basieren (Nachweis der DNA-Fragmentierung durch Markierung der 3′-Hydroxyl-Termini in den während der Apoptose erzeugten Doppelstrang-DNA-Brüchen). Verschiedene Kits bieten mehrere Empfindlichkeitsstufen bei der Erkennung der Zelldeletion.
Einer der Assays (Assay C) ist hochempfindlich und weist sowohl Apoptose als auch Nekrose29 nach; der andere Assay (B) zeigt eine höhere Sensitivität für den Nachweis des apoptotischen Zelltods30. Das Prinzip von Assay C besteht darin, DNA-Brüche in den frühen Stadien der Apoptose zu erkennen. Nach der Fixierung und Permeabilisierung der apoptotischen Zellen wird das Gewebe mit einem TUNEL-Reaktionsgemisch inkubiert. In der Zwischenzeit besteht die Rolle von TdT darin, die Addition von Fluorescein-dUTP an freien 3′-OH-Gruppen in der DNA zu katalysieren. Nachdem das Gewebe gewaschen wurde, markiert der Anti-Fluoreszenz-Antikörper die Markierung in den beschädigten Teilen der DNA. Das Prinzip des Antikörpers besteht darin, an das Enzym alkalische Phosphatase zu binden, das als Reporter arbeitet. Schließlich kann der AP als Ergebnis dieser spezifischen Reaktion gesehen werden31.
Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung von Organen ist eine einfache und nützliche Methode zur morphologischen Analyse mittels Lichtmikroskopie. Es wird empfohlen, diesen Schritt zuerst einzubeziehen, um morphologische Veränderungen der Zellen zu beobachten. Für den Nachweis früher Stadien der Apoptose in den dünnen Abschnitten des Honigbienengewebes stehen mindestens zwei Kits für die immunhistochemische Analyse zur Verfügung (siehe Materialtabelle). Beide färben die apoptotischen Zellkerne dunkelbraun und werden lichtmikroskopisch sichtbar gemacht. Unter Verwendung von Assay A (TUNEL-Technik) konjugiert das Streptavidin HRP (Meerrettichperoxidase) zu biotinylierten Nukleotiden, und apoptotische Kerne werden nach der Reaktion von DAB (Diaminobenzozidin, ein stabiles Chromogen) braun. Assay B unterscheidet Zellschäden durch den Nachweis von DNA-Spaltung und kondensiertem Chromatin, was ein Zeichen für eine frühe Apoptose ist.
In einem gesunden Organismus kann der Grad der Zellerneuerung in der Regel in kleinen Prozentsätzen32,33 beurteilt werden. Der Zelltod im Mitteldarm nahm nach der OA-Behandlung zu, was darauf hindeutet, dass sich die Verwendung von OA in Laborexperimenten nachteilig auf den Mitteldarm der Arbeiterbienen auswirkt. Die Gruppe der Bienen, die mit Imidacloprid und Coumaphos behandelt wurden, zeigte einen erhöhten Zelltod (rote Kerne) in den Nahrungsdrüsen10, was auf Zellschäden oder Nekrosen hindeutet; Der programmierte Zelltod wurde auf niedrigem Niveau (braune Kerne) gefunden10. Es wurde jedoch ein nekrotischer und apoptotischer Zelltod in hohen Konzentrationen festgestellt, insbesondere nach der Behandlung mit Imidacloprid. In der Gruppe der unbehandelten Bienen betrug der Grad des programmierten Zelltods in HPGs nicht mehr als 10%, was dem normalen Gewebeumsatz entspricht32.
Der Zelltod, sowohl durch Schädigung als auch durch programmierten Zelltod, wurde durch beide Assays (B und C) nachgewiesen und führte zu einer unterschiedlichen Empfindlichkeit; Die erste erkennt sowohl nekrotischen als auch programmierten Zelltod11. Wie bei den gesunden Arbeitern (Kontrollgruppe) bestätigt, wiesen beide Assays nur sporadisch positive Zellen als10 nach. Die Apoptose- und Nekrosenachweis-Assays, die in der immunhistochemischen Analyse von Honigbienengewebe verwendet werden, erwiesen sich als eine leistungsstarke Methode, um die subletalen Auswirkungen verschiedener Substanzen auf Honigbienen zu untersuchen.
Kritische Schritte im Protokoll:
Nach dem Schneiden mit einem Mikrotom müssen die Gewebeschnitte über Nacht auf das Objektivglas auf einer warmen Platte (Flachtisch, siehe Materialtabelle) gelegt werden. Es ist wichtig, dass die Proben für zukünftige Schritte in den Protokollen gut getrocknet sind. Wenn Gewebe nicht gut am Glas befestigt ist, kann es sich im Verfahren zur Zelltoderkennung von der Oberfläche lösen. Es ist ratsam, das Lichtmikroskop zu verwenden, um das Vorhandensein des gewünschten Gewebes zu überprüfen. Als nächstes ist es nützlich, den ersten Objektträger mit H & E zu färben, um den richtigen Abschnitt mit vielen Zellen (insbesondere dem Drüsengewebe) zu überprüfen und neue vorzubereiten, falls der Mitteldarmabschnitt nicht geeignet ist. HPGs können ziemlich schwierig zu finden sein, daher muss darauf geachtet werden, nicht zu viele Abschnitte zu schneiden. Andernfalls gehen die Drüsen verloren.
Das Hinzufügen einer Positivkontrolle zum Nachweis einer DNA-Fragmentierung ist nützlich, aber optional. Es ist wichtig, die Objektträger separat zu behandeln, um eine hohe Hintergrundfärbung in den experimentellen Objektträgern zu vermeiden. In Assay B sind die Positivkontrollen in einigen der Kits enthalten (siehe Materialtabelle); andere sollten separat erworben werden.
Die Methode hat eine Einschränkung in ihrer Länge und Präzision. Die Konservierung von Gewebe in einem wässrigen Montagemedium ist nur kurzfristig (unter 3 Monaten). Wenn eine längere Konservierung gewünscht wird (aufgrund möglicher Farbveränderungen nicht empfohlen), gibt es andere Medien, aber die Ergebnisse sind nicht so zuverlässig.
Die gleichzeitige Verwendung dieser beiden Methoden (Apoptose- und Nekrosenachweis) ist sehr nützlich, um die verschiedenen Wirkungen von Pestiziden auf Honigbienengewebe zu vergleichen, insbesondere für subletale Effekte. Die alternative Methode wäre die Beobachtung der Nahrungssuche und ihrer Auswirkungen auf die kognitive Wahrnehmung von Arbeiterbienen, die von Pestiziden betroffen sind. Eine solche Methode wäre schneller bei der Erkennung subletaler Auswirkungen auf die Aktivitäten erwachsener Bienen, würde aber keine Fragen zum Ausmaß der inneren Schäden beantworten, die das Verhalten im Frühstadium verändern können, wie bei jungen (Ammen-) Bienen.
Die histologische Analyse der einfachen Morphologie von Honigbienengewebe ist eine solide Grundlage für die Annäherung an unterschiedliche Forschungsperspektiven bei Zellschädigung, Apoptose oder Fehlbildungen. Die Ursachen für den Einsatz von Pestiziden in der Umwelt oder die Behandlung von Bienenvölkern aufgrund von Parasiten und Schädlingen können schädlich sein und die Lebensdauer von Honigbienen und das Überleben von Bienenvölkern erheblich beeinträchtigen. Der Mitteldarm und HPGs sind essentielle Organe bei Honigbienen und haben die Fähigkeit und den Zweck, schnell auf jede Art von negativen externen Faktoren zu reagieren, die die altersbedingten Aktivitäten der Bienen beeinflussen. Die HPGs nehmen an Größe und Sekretionsfähigkeit ab, und Epithelzellen im Mitteldarm reagieren mit erhöhtem Zelltod. Immunhistochemische Methoden, wie z.B. In-situ-Studien , sind nützliche Werkzeuge für den Apoptose-Nachweis im Bienengewebe. Sie zeigen auch das Potenzial, in Studien über mögliche nachteilige Auswirkungen auf Honigbienen und andere nützliche Insekten umgesetzt zu werden.
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Disclosures
Der Autor hat keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Ich bedanke mich für die Unterstützung der slowenischen Forschungsagentur, Zuschuss Nr. P4-133.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R.
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , Dadant and Sons. 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. , Cornell University Press. (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , Taylor & Francis Group. 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M.
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, Ö Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , Chapman & Hall. London. (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D'Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
