Summary
免疫組織化学的方法は、成虫のミツバチの中腸および下咽頭腺におけるアポトーシスおよび壊死のレベルを検出および評価するためのミツバチの研究において有用である。
Abstract
ミツバチ(Apis mellifera L.)ハイブ内(ナースワーカーや他のハイブミツバチ)とハイブ外(採餌者)は、気候や天候の変化、さまざまな農薬、病原体、栄養失調にさらされ、主に口から侵入し、主に成虫の消化管に影響を与えます。このような外部および内部のストレッサーがミツバチに及ぼす影響を理解し、予防するために、有用な研究方法の1つが免疫組織化学的方法です。組織学的分析のために成体ミツバチの中腸(心室)および下咽頭腺(HPG)を準備するための基本的なプロトコルが説明されています。細胞損傷のレベルを評価し、組織再生の自然なプロセスとして壊死とプログラム細胞死(アポトーシス)を区別するための詳細な方法論が説明されています。シュウ酸と農薬(殺虫剤と殺ダニ剤)による成虫ミツバチの治療結果と、心室とHPGの細胞死の測定が提示されています。方法論の長所と短所についても説明します。
Introduction
ミツバチ(Apis mellifera L.)は、他の野生の花粉媒介者の中でも、農業用植物の最も重要な花粉媒介者です。何千年もの間、変化する環境は、ミツバチが形態、生理学、行動、およびいくつかの病原体や寄生虫に対する耐性を適応させるように影響を与えてきました。したがって、ミツバチは世界中で非常に多様な種と亜種を開発しました1。これらの結果は、ミツバチの消化管構造に遺伝的変異があるという以前の発見と一致していますが、中腸の変化は環境要因によるものであることも示唆しています2,3。
ミツバチの消化管には、前腸、中腸(心室)、後腸4の3つの主要部分があります。心室は花粉と蜜/蜂蜜の消化に不可欠な器官です。後腸では、浸透圧制御は水とイオンの吸収によって行われます2。ミツバチ労働者の下咽頭腺(HPG)は頭にあり、ローヤルゼリー成分を合成して分泌し、ひな、女王、およびコロニーのメンバーに餌を与えます。それらのサイズは年齢や課題によって変化し、適切な栄養(高品質の花粉)に依存します。6〜18日齢の看護師がひなの飼育を行い、HPGのサイズは5,6増加します。採餌ミツバチでは、HPGは変性し、蜂蜜中の複雑な糖を単純な糖(α-グルコシダーゼ、ロイシンアリールアミダーゼ、インベルターゼ)に変換するのに重要な酵素のみを分泌します7。
ミツバチはいくつかの生物的および非生物的ストレッサーにさらされており8、消化管はいくつかの負の覚醒剤の影響を受ける可能性があります。病原体から生物を保護する最初の障壁は、病原体から保護するための腸粘膜からなる中腸の周栄養膜です4。HPGの発生と機能は、食事、年齢、コロニーの状態9に依存し、殺虫剤、殺ダニ剤10、および病原体11、12、13の影響を受けます。バロア防除処理および環境からの農薬による巣箱内の殺ダニ剤残留物は、採餌蜂およびナースミツバチに影響を及ぼす14,15。ミツバチのコロニーに対する最大の脅威は、コロニーの損失に寄与するウイルスのベクターとして、また宿主の脂肪体(ミツバチの重要な重要な器官)の消費者として、ダニVarroaデストラクタであり、その結果、個体の体とコロニーの機能に影響を与えます17。
しかし、集中的な農地の生息地は、ミツバチに短期的な食料供給を提供することができます。したがって、農業環境計画は、農業景観における蜂蜜の花の利用可能性を高めるはずです18。異なる亜種6,19,20,21の形態、または細胞または組織レベル、特に中腸およびHPGでのこれらの因子の亜致死的影響を評価するために、組織学的および免疫組織化学的方法は実用的であり、ミツバチの組織学研究に使用するのに十分正確です。
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Protocol
1. ミツバチ研究のための基礎組織学
- ミツバチ組織の解剖
注意: 働きバチの解剖には、LED光源を備えた解剖顕微鏡を使用してください。最も有用な倍率は~20倍です。- 操作と解剖
- 働きバチを鉗子で慎重に取り、氷の上(または-20°Cの冷凍庫)に2分間入れて固定します22。ペトリ皿に蜂を胸部の背中の上部から左から右、右から左に2回斜めに固定します。
- 体を覆うために昆虫食塩水を注ぐ。ペトリ皿を顕微鏡下に置き、焦点を合わせて調整します。
- 機器を準備します( 材料の表を参照)。
- 中腸の解剖
- ミツバチの体の右側の中央にあるテルガイトA5(図1)の下にハサミの一点を挿入して、腹部から始めます。テルガイトA2にカットします。
- 内臓を傷つけないように、はさみの内刃を体の側面と平行に保ちます。はさみを左に回して1カットします。右に曲がって別のカットを行います。腹部の左側をそっと開いて固定します。反対側で繰り返します。
- 片手で鉗子を使用して、ミツバチの胃をそっと上に引き上げ、もう一方の手でハサミで食道の端を切ります。胃と中腸を腹部から引き離し、直腸を切ります。昆虫食塩水を入れたピペットを使用し、糞便や組織の一部を取り除きます。
- HPGの解剖
- ステップ1.1.1で説明されているように、働きバチを氷の上に固定します。頭を切り取り、アンテナを上に向けて小さなプレートに置きます。左複眼と右複眼の2本のピンで頭を固定します。
- ピンの内側にある最初の複眼を横切って切り込みを入れ、唇まで続けてから、反対側に2番目の複眼を横切って別の切り込みを入れます(図2)。
- アンテナを切り取ります。マスクを持ち上げて、まだ取り付けられている場所で切ります。鉗子を取り、脳と複眼の一部と一緒に腺を慎重に取り除きます。
- 操作と解剖
- 固定、脱水、パラフィン包埋
注意: 保護手袋を着用してください。- 組織をペニシリンボトルに入れ、3/4を10%ホルマリンで満たします。4°Cの冷蔵庫に保管してください。
- 24時間後、一連のアルコールで組織を脱水します:70%、80%、90%、100%、それぞれ1時間、100%2-プロパノールを1時間、100%2-プロパノールを12時間、最後に100%2-プロパノールを1時間。
- 組織をヒストカセットに入れる。印を付け、2-プロパノールとパラフィン(1:1)を入れたガラスチャンバーに入れ、60°Cのインキュベーターで24時間放置します。
- ヒストカセットをパラフィン(I.)を含む別のチャンバーにさらに24時間移動します。新鮮なパラフィンでさらに2回(IIとIII)、両方とも24時間手順を繰り返します。
- 最後に、取り付けステーションを準備し、ティッシュをワックスに埋め込み始めます。
- 各ヒストカセットを開き、カバーを取り外します。型をワックスで満たし、型の中央に温かい鉗子で組織を慎重に置きます。
- ヒストカセットを型の上に置き、ワックスで少し覆います。すぐに金型を取り付けステーションの冷たい面に数秒間置き、ワックスが硬化して金型とヒストカセットから分離するまで数分間コールドプレートに置きます。
- 完成したサンプルは、ほこりや熱から離れた箱に保管してください。
- ミクロトームで4 μmの薄い切片を切断します:最初に2つの切片を互いに取り付け、次に1つを別々に取り付けます。切片を鉗子で移し、蒸留水(42°C)に浮かせてから、対物レンズガラスの左側に2つの切片を一緒に、右側に3番目の切片を別々に配置して、きれいなスライドに集めます。マークされたスライドを加熱装置に一晩置いておき、最後に組織学サンプル専用の箱に保管します。
- 脱ろうと水分補給
注意: 保護手袋を着用してください。- 9つのコプリンジャーを準備し、セクションを一連の清澄剤(I.、II.、III.)にそれぞれ5分間入れます。
- 2-プロパノール、エタノール96%(I.、II)、アルコール90%および80%、蒸留水にそれぞれ3分間入れます。
- ヘマトキシリンとエオシンによる染色
注意: 保護手袋を着用してください。- 6つのコプリンジャーを準備します。
- ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色の場合は、脱ワックス、再水和した切片をヘマトキシリンに5分間入れてから、水道水の下に2分間注意深く置きます。次に、それらを蒸留水に1分間、エオシンに4分間入れます(エオシンの場合、コプリンジャーは必要ありません)。
- スライドをエタノール96%に1分間入れ、次に2-プロパノールに2分間入れ、最後に透明化剤に2分間入れます。
- 封入剤とカバーガラスを加え、乾燥させます。光学顕微鏡で観察する。
図1:ミツバチの体の背側図。A1-A7テルガイト。ミツバチの解剖に関する詳細な手順は、Carreckら24にあります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:HPGの背側図、脳に付着した複眼の一部(見えない)。5〜6日齢の若い働き蜂は、ふっくらとしたクリーミーな白いHPGを持っています。腺房は脳上にあり、脳の後ろに達する枝で頭の領域を埋めます。採餌中のミツバチでは、これらの腺は非常に縮小し、細い糸のような残骸だけを残します。このため、組織を失うことを避けるために、さらなる手順でそれを容易にするために、脳と一緒に腺を取り除くことをお勧めします。スケールバー= 500μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2.組織切片における細胞死の検出
- アポトーシス検出キット(アッセイA)
注意: 製造元のプロトコルに従ってください( 材料表を参照)。- コプリンジャーを準備します。
- 脱ろうと再水和(ステップ1.3を参照)の後、スライドを0.85%NaCl溶液に浸し、次にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に浸します(5分間)。
- スライドを4%パラホルムアルデヒド2 x 15分に入れます。
- スライドを容器に平らに置き、100 μLのプロテイナーゼK(20 μg / mL)溶液を加えてから、10〜30分間放置します。
- スライドをPBSに入れます(5分)。
- スライドをPBS中の4%パラホルムアルデヒドに入れます(5分)。
- スライドをPBSに浸します(2 x 5分)。
- スライドを容器に平らに置き、100 μLの平衡化バッファーを加えて、5〜10分間放置します。
- 100 μLのTdT反応ミックスを加えます。スライドの周りにペーパータオルを容器の中に入れ、タオルを水で湿らせてから、ラップで覆います。スライドを37°Cで60分間インキュベートします。
- スライドを染色ラックに戻し、2x生理食塩水-クエン酸ナトリウム(SSC)に15分間浸します。
- スライドをPBSに3 x 5分浸し、次に0.3%過酸化水素に3〜5分間浸し、次に再びPBSに3 x 5分浸します。
- 再度、スライドを容器に平らに置き、100 μLのストレプトアビジンHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)を加え、30分間放置します(ラップで覆います)。
- スライドをPBSに3 x 5分浸します。
- スライドを容器に平らに置き、100 μLの3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液を加えます。明るい茶色の背景を探します。
- スライドをラックに戻し、水で数回洗います(二重蒸留)。
- スライドを封入剤のガラスカバースリップの下に取り付け、平らにして乾かします。
- 光学顕微鏡で観察する。
- アポトーシス検出キット(アッセイB)
注意: 製造元のプロトコルに従ってください( 材料表を参照)。- コプリンジャーを準備します。
- プロテイナーゼK(PBSで希釈した20 μg/mL)を調製します。
- 切片を脱ワックスして再水和した後(ステップ1.3)、スライドをPBSに5分間入れます。
- スライドを容器に平らに置き、プロテイナーゼK(20 μg/mL、5 cm²検体あたり60 μL)を加えます。
- スライドを蒸留水で2 x 2分洗浄します。
- 室温で内因性ペルオキシダーゼ(3%水素ペルオキシダーゼ中)でクエンチします。
- スライドをPBSまたは水で2 x 5分すすぎます。
- スライドを容器に平らに置き、平衡化バッファー(75 μL/5 cm2)を室温で10秒間適用します。
- ティッシュの周りを慎重に拭きます。
- TdT酵素(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ)を各切片に加え、加湿チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。 ペーパータオルをトレイの中、スライドの周りに置き、タオルを水で湿らせ、ラップで覆います。
- インキュベーション後、検体をラックに入れ、ストップ/ウォッシュバッファー(10分)に入れます。
- 抗ジゴキシゲニンコンジュゲートを室温に温めます。
- スライドをPBSで洗います(3 x 1分)。
- ティッシュの周りを慎重に拭き取ります。
- 抗ジゴキシゲニン-ペルオキシダーゼコンジュゲート(65 μL/5 cm²)を切片に2滴加え、加湿容器で30分間インキュベートします。
- PBS 4 x 2分で洗浄した後、作業強度のペルオキシダーゼ基質を準備し、余分な液体を静かにたたき取り、セクションの周りを吸引します。
- 切片をペルオキシダーゼ基質(75 μL/5 cm²)で覆い、5分間染色します。顕微鏡の下にスライドを置き、最適な染色時間を決定します。
- 蒸留水(3 x 1分)の染色ラックでスライドを洗います。
- スライドを蒸留水で5分間インキュベートします。
- ヘマトキシリンを2分間対比染色する。
- スライドを水道水の下に3分間置きます。
- スライドを蒸留水で洗います。
- スライドを封入剤のガラスカバースリップの下に取り付け、平らにして乾かします。
- 光学顕微鏡で観察する。
- アポトーシス検出キット(アッセイC)
注意: 製造元のプロトコルに従ってください( 材料表を参照)。- コプリンジャーを準備します。
- 組織切片を脱ろうして再水和します(手順1.3を参照)。
- 組織をプロテイナーゼK(37°Cで15〜30分)でインキュベートします。
- スライドをラックに戻し、PBSで2回すすぎます。
- 50 μLの「TUNEL反応混合物」で覆います。濡れたペーパータオルを容器に入れ、ラップで覆い、37°Cで60分間放置します。
- PBSで3回すすぎます。
- スライドを容器に入れ、組織サンプルの周囲を乾燥させます。
- 50 μLのコンバーター-APをサンプルに加え、加湿容器中で37°Cで30分間インキュベートします。
- PBSで3回すすぎます。
- 50〜100μLの基質溶液を加え、暗所に10分間放置する。
注:光学顕微鏡で染色を観察します。 - スライドをPBSで3回すすぎます。
- 切片をヘマトキシリンに2分間移して対比染色し、水道水で5分間注意深くすすいでください。
- スライドを水性封入剤のガラスカバースリップの下に取り付け、平らにして乾かします。
- 光学顕微鏡で観察する。光学顕微鏡下で中腸またはHPGの各サンプル中の70〜100個の細胞を数えることにより、影響を受けた(陽性)細胞を評価します。
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Representative Results
中腸における細胞死の検出
リュブリャナのスロベニア農業研究所の実験養蜂場から新たに出現した働きバチ(Apis mellifera carnica)を、3%シュウ酸(OA)23で個別に処理しました。OAは、 Varroaデストラクタ 制御のための養蜂に頻繁に使用されます。処理後、働きバチ(各群から3匹)を氷上に固定した。中腸を解剖し、10%ホルマリンで固定した。次に、組織を一連のアルコール溶液で脱水し、最後にパラフィンワックスに包埋しました。ミクロトームで7μmの薄切片に切断した後、組織サンプルを分析用に調製した。光学顕微鏡を用いて、罹患細胞(3つの中腸サンプルのそれぞれから70〜100個の細胞)の割合を計算した。アッセイBの結果は、OAによる処理が中腸の細胞に有意に影響を与えることを示しました(図3)。アッセイAは、処理されたミツバチと対照のミツバチの間に差を示さなかった。細胞死率は10%未満であった。砂糖シロップのみを与えられた対照蜂では、中腸の形態は影響を受けず、よく保存されていました。
図3:中腸。 (A)ヘマトキシリンおよびエオジン染色;(B)中腸の免疫染色(アッセイC)。強烈な赤色染色は、中腸細胞の核に局在する。スケールバー= 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
HPGにおける細胞死の検出
次の試験では、実験を行い、3つの無病コロニー(Apis mellifera L.)を選択しました。覆われたひなの櫛をインキュベーター(34.5°C)に入れ、新しく出現した働きバチには胸部に斑点を付けて年齢を定義しました。この手順を3回繰り返して、年齢の異なるミツバチを得た。ミツバチはマークされ、コロニーに戻されました。ミツバチは、試験開始から30日後にサンプリングされた。最後に、片側に金網を付けた7.5 cm x 4 cm x 4 cmの貯蔵ケージに入れ、28°Cのインキュベーターに保管しました。
労働者は、殺虫剤(イミダクロプリド)または殺ダニ剤(クマフォス)、致死量の溶液、または砂糖シロップを対照群10として治療した。異なるグループのミツバチを固定し、HPGを解剖しました。サンプルは、できるだけ多くの細胞を得るために、同じグループから3〜5人の労働者で構成されていました。影響を受けた細胞を免疫組織学的方法を用いて評価した。赤(アッセイC)および褐色(アッセイB)の反応生成物がHPGのアポトーシス核で検出されました。 イミダクロプリドまたはクマフォス処理後の陽性の赤色核は、大部分の腺細胞で決定され(図4)、散発性の細胞核のみが同じ処理群からの茶色の反応生成物を示しました。対照群には損傷したHPG細胞はなかった。
図4:下咽頭腺。 (a)ヘマトキシリンおよびエオジン染色;(b)免疫染色(アッセイC)。赤色染色は細胞の核に局在する。(c)免疫染色(アッセイB)。茶色の反応生成物は陽性の細胞核を示す。スケールバー = 50 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
生体では、細胞死はアポトーシスまたは壊死25として定義され、オートファジー26を伴うことがあります。アポトーシス細胞と壊死細胞の違いは、アポトーシスはプログラムされた細胞死の一形態であり、正常細胞に現れるのに対し、壊死は致命的な状態(事故、病気など)によって起こることです27,28。アポトーシスは、TUNEL法に基づくアッセイキット(アポトーシス中に生成される二本鎖DNA切断の3'-ヒドロキシル末端を標識することによるDNA断片化の検出)を使用して検出できます。異なるキットは、細胞欠失を検出する際にいくつかのレベルの感度を提供します。
アッセイの1つ(アッセイC)は非常に感度が高く、アポトーシスと壊死の両方を検出します29;他のアッセイ(B)は、アポトーシス細胞死を検出するためのより高い感度を示す30。アッセイCの原理は、アポトーシスの初期段階でDNA切断を検出することです。アポトーシス細胞を固定および透過処理した後、組織をTUNEL反応混合物と共にインキュベートする。一方、TdTの役割は、DNA中の遊離3'-OH基でのフルオレセイン-dUTPの付加を触媒することです。組織を洗浄した後、抗フルオレセイン抗体はDNAの損傷部分にラベルをマークします。抗体の原理は、レポーターとして機能する酵素アルカリホスファターゼに付着することです。最後に、APは、この特定の反応31の結果として見ることができる。
臓器のヘマトキシリンおよびエオジン染色は、光学顕微鏡を用いた形態素解析のための簡単で有用な方法です。細胞の形態学的変化を観察するために、このステップを最初に含めることをお勧めします。ミツバチ組織の薄切片におけるアポトーシスの初期段階の検出には、免疫組織化学的分析用に少なくとも2つのキットが用意されています( 材料表を参照)。どちらもアポトーシス細胞核を暗褐色に変え、光学顕微鏡を使用して視覚化されます。アッセイA(TUNEL法)を用いて、ストレプトアビジンHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)コンジュゲートをビオチン化ヌクレオチドに結合し、アポトーシス核はDAB(ジアミノベンジジン、安定な色原体)の反応後に茶色に変わります。アッセイBは、早期アポトーシスの兆候であるDNA切断と凝縮クロマチンの検出 を通じて 細胞損傷を区別します。
健康な生物では、細胞再生のレベルは通常、わずかな割合で評価することができます32,33。OA処理後に中腸の細胞死が増加し、OAの使用が実験室実験における働きバチの中腸に有害な影響を与えることを示しています。イミダクロプリドとクマフォスで処理されたミツバチのグループは、食物腺10の細胞死の増加を明らかにし、細胞の損傷または壊死を示しています。プログラムされた細胞死は低レベル(茶色の核)で発見されました10。しかしながら、壊死およびアポトーシス細胞死は、特にイミダクロプリド処理後に高レベルで見出された。未処理のミツバチのグループでは、HPGのプログラム細胞死のレベルは10%以下であり、これは正常な組織代謝回転32と一致しています。
損傷またはプログラムされた細胞死の両方による細胞死は、両方のアッセイ(BおよびC)によって検出され、異なる感度をもたらしました。最初のものは壊死とプログラムされた細胞死の両方を検出します11。健常者(対照群)で確認されたように、両方のアッセイは散発的な陽性細胞のみ10個を検出した。ミツバチ組織の免疫組織化学的分析に使用されるアポトーシスおよび壊死検出アッセイは、ミツバチに対するさまざまな物質の亜致死的影響を調べるための強力な方法であることが判明しました。
プロトコルの重要な手順:
ミクロトームで切断した後、組織切片を暖かいプレート(平坦化テーブル、 材料表を参照)上の対物レンズガラス上に一晩置く必要があります。プロトコルの将来のステップのために、サンプルを十分に乾燥させることが不可欠です。組織がガラスにうまく付着していない場合、細胞死検出の手順で表面から剥離する可能性があります。光学顕微鏡を使用して、目的の組織の存在を確認することをお勧めします。次に、最初のスライドをH&Eで染色して、多くの細胞(特に腺組織)を含む正しい切片を確認し、中腸切片が適切でない場合に備えて新しい切片を準備すると便利です。HPGを見つけるのは非常に難しい場合があるため、セクションをカットしすぎないように注意する必要があります。さもなければ、腺は失われます。
DNA断片化を検出するためにポジティブコントロールを追加することは有用ですが、オプションです。実験用スライドで高いバックグラウンド染色を避けるために、スライドを個別に処理することが重要です。アッセイBでは、ポジティブコントロールが一部のキットに含まれています( 材料表を参照)。その他は別途購入する必要があります。
このメソッドには、その長さと精度に制限があります。水性封入剤中の組織の保存は短期間(3ヶ月未満)です。より長い保存が必要な場合(色の変化の可能性があるため推奨されません)、他の培地がありますが、結果はそれほど信頼できません。
これら2つの方法(アポトーシスと壊死検出)を同時に使用することは、ミツバチの組織に対する農薬のさまざまな効果、特に亜致死効果を比較するのに非常に役立ちます。代替方法は、採餌活動の観察と、農薬の影響を受けた働きバチの認知知覚への影響です。このような方法は、成虫のミツバチの活動に対する亜致死的影響を検出するのに高速ですが、若い(ナース)ミツバチのように、初期段階で行動を変える可能性のある内部損傷の程度に関する質問には答えません。
ミツバチ組織の単純な形態の組織学的分析は、細胞損傷、アポトーシス、または奇形におけるさまざまな研究の視点にアプローチするための確固たる基盤です。環境中での農薬使用や寄生虫や害虫によるコロニー処理の原因は有害であり、ミツバチの寿命とコロニーの生存に大きな影響を与える可能性があります。中腸とHPGはミツバチの必須器官であり、ミツバチの加齢に伴う活動に影響を与えるあらゆる種類の負の外的要因に迅速に対応する能力と目的を持っています。HPGのサイズと分泌能力が低下し、中腸の上皮細胞は細胞死の増加によって反応します。 in situ 研究などの免疫組織化学法は、ミツバチ組織のアポトーシス検出に有用なツールです。彼らはまた、ミツバチや他の益虫への悪影響の可能性の研究で実施される可能性を示しています。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
スロベニア研究庁、助成金番号P4-133の支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
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