Summary
면역 조직 화학적 방법은 꿀벌 연구에서 성인 꿀벌의 중추 및 하인두 땀샘에서 세포 사멸 및 괴사 수준을 감지하고 평가하는 데 유용합니다.
Abstract
꿀벌 (Apis mellifera L.) 벌집 내부 (간호사 및 기타 벌집 꿀벌)와 벌집 외부 (채집자)는 기후 및 날씨 변화, 다양한 살충제, 병원균 및 영양 실조에 노출되며 주로 입을 통해 들어가고 주로 성인 꿀벌의 소화관에 영향을 미칩니다. 꿀벌에 대한 이러한 외부 및 내부 스트레스 요인의 영향을 이해하고 예방하기 위해 유용한 연구 방법 중 하나는 면역 조직 화학적 방법입니다. 조직 학적 분석을 위해 성인 꿀벌의 중추 (심실) 및 하인두 땀샘 (HPG)을 준비하기위한 기본 프로토콜이 설명됩니다. 세포 손상 수준을 평가하고 조직 재생의 자연적인 과정으로서 괴사를 프로그램 된 세포 사멸 (세포 사멸)과 구별하기위한 상세한 방법론이 설명됩니다. 옥살산과 살충제 (살충제 및 살비제)로 성인 꿀벌을 치료하고 심실 및 HPG에서 세포 사멸을 측정 한 결과가 제시됩니다. 방법론의 장단점도 논의됩니다.
Introduction
꿀벌 (Apis mellifera L.)은 다른 야생 수분 매개자 중에서도 농업 식물의 가장 중요한 수분 매개자입니다. 수천 년에 걸쳐 변화하는 환경은 꿀벌이 형태, 생리학, 행동 및 여러 병원체와 기생충에 대한 내성을 적응시키는 데 영향을 미쳤습니다. 따라서 꿀벌은 전 세계적으로 매우 다양한 종과 아종을 개발했습니다1. 이러한 결과는 꿀벌의 소화관 구조에 유전 적 변이가 있다는 이전 발견과 일치하지만 중추의 변화가 환경 요인 2,3에 기인 한 것임을 시사합니다.
꿀벌의 소화관에는 앞장, 중추 (심실) 및 뒷부4의 세 가지 주요 부분이 있습니다. 심실은 꽃가루와 꿀/꿀의 소화에 필수적인 기관입니다. 뒷다리에서 삼투압 조절은 물과 이온의 흡수를 통해 발생합니다2. 꿀벌 작업자의 하인두 땀샘 (HPG)은 머리에 위치하며 로열 젤리 성분을 합성하고 분비하여 무리, 여왕 및 식민지 구성원에게 먹이를줍니다. 그들의 크기는 나이와 작업에 따라 변하고 적절한 영양 (품질 꽃가루)에 달려 있습니다. 6 일에서 18 일 사이의 간호사는 양육을 수행하며 HPG의 크기는 5,6 증가합니다. 채집 꿀벌에서 HPG는 퇴화되어 꿀7에서 복잡한 당을 단순한 설탕 (α- 글루코시다 아제, 류신 아릴 아미다 제, 인버 타제)으로 전환하는 데 중요한 효소 만 분비합니다.
꿀벌은 여러 생물학적 및 비생물적스트레스 요인8에 노출되며 소화관은 여러 가지 부정적인 자극제의 영향을 받을 수 있습니다. 병원체로부터 유기체를 보호하는 첫 번째 장벽은 병원균으로부터 보호하기 위해 장 점막으로 구성된 중추의 주변 영양 막입니다4. HPG의 발달과 기능은 식단, 연령 및 집락 상태9에 따라 달라지며 살충제, 살비제10 및 병원균11,12,13의 영향을 받습니다. varroa 방제 처리 및 환경의 살충제로 인한 벌통의 살비제 잔류 물은 수렵 꿀벌과 간호사 꿀벌14,15에 영향을 미칩니다. 꿀벌 식민지에 대한 가장 큰 위협은 진드기 Varroa 소멸자로, 식민지 손실에 기여하는 바이러스 벡터16 및 숙주의 지방 신체 (꿀벌의 중요한 중요한 기관)의 소비자로서 결과적으로 개인의 신체와 식민지 기능에 영향을 미칩니다17.
그러나 집약적 인 농지 서식지는 꿀벌에게 단기적인 식량 공급을 제공 할 수 있습니다. 따라서 농업 환경 계획은 농업 경관에서 꿀 꽃의 가용성을 향상시켜야합니다18. 세포 또는 조직 수준, 특히 중추 및 HPG에서 다른 아종 6,19,20,21 또는 이러한 요인의 치명적인 영향을 평가하기 위해 조직 학적 및 면역 조직 화학적 방법은 꿀벌의 조직학 연구에 사용하기에 실용적이고 충분히 정확합니다.
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Protocol
1. 꿀벌 연구를위한 기본 조직학
- 꿀벌 조직의 해부
알림: 일벌을 해부하려면 LED 광원이 있는 해부 현미경을 사용하십시오. 가장 유용한 배율은 ~ 20x입니다.- 조작 및 해부
- 조심스럽게 집게로 일벌을 가져 와서 얼음 (또는 -20 ° C의 냉동실)에 2 분 동안 넣어고정시킵니다 22. 페트리 접시에 꿀벌을 왼쪽에서 오른쪽으로, 오른쪽에서 왼쪽으로 두 번 흉부의 맨 위 뒤쪽 부분을 통해 대각선으로 고정합니다.
- 곤충 식염수를 부어 몸을 덮으십시오. 페트리 접시를 현미경 아래에 놓고 초점을 맞추고 조정합니다.
- 기기를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
- 중추의 해부
- 꿀벌 몸의 오른쪽 중앙에있는 tergite A5 (그림 1) 아래에 가위의 한 지점을 삽입하여 복부부터 시작하십시오. 테르 기트 A2로 자릅니다.
- 내부 장기가 손상되지 않도록 가위의 안쪽 날을 몸의 측면과 평행하게 유지하십시오. 가위를 왼쪽으로 돌려 한 번 자릅니다. 우회전하여 다시 자릅니다. 복부의 왼쪽 부분을 부드럽게 열고 고정하십시오. 반대쪽에서도 반복하십시오.
- 한 손으로 집게를 사용하여 꿀벌 위를 부드럽게 위로 당기고 다른 손에는 가위로 식도 끝에서 자릅니다. 복부에서 위와 중추를 당겨 직장을 자릅니다. 곤충 식염수가 든 피펫을 사용하여 대변이나 조직의 일부를 제거하십시오.
- HPG의 해부
- 1.1.1 단계에서 설명한대로 일벌을 얼음 위에 고정시킵니다. 머리를 잘라 안테나가 위를 향하도록 작은 접시에 놓습니다. 두 개의 핀으로 머리를 고정합니다 : 하나는 왼쪽 겹눈을 통과하고 다른 하나는 오른쪽 겹눈을 관통합니다.
- 핀 안쪽의 첫 번째 겹안을 가로질러 절단하고 음순으로 계속 이동한 다음 두 번째 겹눈을 가로질러 다른 쪽을 다시 절단합니다(그림 2).
- 안테나를 잘라냅니다. 마스크를 벗고 아직 부착된 부분을 자릅니다. 집게를 가지고 뇌와 겉눈의 일부와 함께 땀샘을 조심스럽게 제거하십시오.
- 조작 및 해부
- 고정, 탈수 및 파라핀 삽입
알림: 보호 장갑을 착용하십시오.- 조직을 페니실린 병에 넣고 10 % 포르말린으로 3/4을 채 웁니다. 4 ° C의 냉장고에 보관하십시오.
- 24 시간 후, 일련의 알코올로 조직을 탈수하십시오 : 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 각각 1 시간, 100 % 2- 프로판올 12 시간, 마지막으로 100 % 2- 프로판올 1 시간.
- 조직을 히스토카세트에 넣습니다. 표시하고 2- 프로판올과 파라핀 (1 : 1)으로 60 ° C의 인큐베이터에서 24 시간 동안 유리 챔버에 넣습니다.
- 히스토카세트를 파라핀(I.)이 있는 다른 챔버로 24시간 더 옮깁니다. 신선한 파라핀으로 24 시간 동안 두 번 더 (II. 및 III.) 절차를 반복하십시오.
- 마지막으로 장착 스테이션을 준비하고 티슈를 왁스에 매립하기 시작합니다.
- 각 히스토카세트를 열고 덮개를 제거합니다. 금형을 왁스로 채우고 금형 중앙에 따뜻한 집게로 티슈를 조심스럽게 넣으십시오.
- 히스토카세트를 몰드에 놓고 왁스로 약간 덮으십시오. 즉시 장착 스테이션의 차가운 표면에 금형을 몇 초 동안 놓은 다음 왁스가 경화되어 금형과 히스토카세트에서 함께 분리될 때까지 몇 분 동안 냉각판에 놓습니다.
- 완성 된 샘플을 먼지와 열이없는 상자에 보관하십시오.
- 마이크로톰에서 4μm의 얇은 섹션을 자릅니다: 먼저 두 개의 섹션이 서로 부착된 다음 하나씩 별도로 부착됩니다. 집게로 섹션을 옮기고 증류수(42°C)에 띄운 다음 대물 유리의 왼쪽에 두 섹션을 함께 배치하고 오른쪽에 세 번째 섹션을 함께 배치하여 깨끗한 슬라이드에 수집합니다. 표시된 슬라이드를 가열 장치에 밤새 방치하고 마지막으로 조직학 샘플 전용 상자에 보관하십시오.
- 탈랍 및 재수화
알림: 보호 장갑을 착용하십시오.- 9 개의 코플린 병을 준비하고 섹션을 일련의 제거제 (I., II., III.)에 각각 5 분 동안 넣습니다.
- 2-프로판올, 에탄올 96%(I., II.), 알코올 90% 및 80%, 증류수를 각각 3분 동안 투입하였다.
- 헤마톡실린과 에오신으로 염색
알림: 보호 장갑을 착용하십시오.- 6 개의 코플린 항아리를 준비하십시오.
- 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색의 경우, 탈랍되고 재수화된 부분을 헤마톡실린에 5분 동안 넣은 다음 흐르는 수돗물 아래에 2분 동안 조심스럽게 두십시오. 그런 다음 증류수에 1 분, 에오신 4 분 동안 넣으십시오 (에오신의 경우 코플린 병은 필요하지 않습니다).
- 슬라이드를 에탄올 96 %에 1 분 동안 넣은 다음 2- 프로판올에 2 분, 마지막으로 투명화제에 2 분 동안 넣습니다.
- 장착 매체와 커버 유리를 추가하고 건조시킵니다. 광학 현미경으로 관찰하십시오.
그림 1: 꿀벌 몸의 등쪽 모습. A1-A7 테르 자이트. 꿀벌 해부에 대한 자세한 지침은 Carreck et al.24에서 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 뇌에 부착된 겹눈의 일부인 HPG의 등쪽 보기(보이지 않음). 5-6 일 된 어린 일벌은 통통하고 크림색의 흰색 HPG를 가지고 있습니다. acini는 뇌에 위치하고 뇌 뒤쪽에 도달하는 가지로 머리 부분을 채 웁니다. 꿀벌을 채집 할 때,이 땀샘은 크게 줄어들고 얇은 실 모양의 잔해 만 남습니다. 이러한 이유로 조직 손실을 피하기 위해 추가 절차를 더 쉽게 수행 할 수 있도록 뇌와 함께 땀샘을 제거하는 것이 좋습니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 조직 절편에서 세포 사멸 검출
- 세포자멸사 검출 키트(분석 A)
알림: 제조업체의 프로토콜을 따르십시오( 재료 표 참조).- 코플린 항아리를 준비하십시오.
- 탈랍 및 재수화 후(1.3단계 참조) 슬라이드를 0.85% NaCl 용액에 담근 다음 인산염 완충 식염수(PBS)에 담근다(5분).
- 슬라이드를 4% 파라포름알데히드 2 x 15분에 넣습니다.
- 슬라이드를 용기에 평평하게 놓고 100μL의 프로테이나제 K(20μg/mL) 용액을 추가한 다음 10-30분 동안 그대로 두십시오.
- 슬라이드를 PBS에 넣습니다(5분).
- 슬라이드를 PBS의 4% 파라포름알데히드에 넣습니다(5분).
- 슬라이드를 PBS에 담그십시오(2 x 5분).
- 슬라이드를 용기에 평평하게 놓고 100μL의 평형 버퍼를 추가하고 5-10분 동안 그대로 둡니다.
- 100 μL의 TdT 반응 혼합물을 추가합니다. 종이 타월을 용기 안, 슬라이드 주위에 넣고 수건에 물을 적신 다음 플라스틱 랩으로 덮으십시오. 슬라이드를 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 염색 랙에 다시 놓고 2x 식염수-시트르산 나트륨(SSC)에 15분 동안 담그십시오.
- 슬라이드를 PBS에 3 x 5분 동안 담근 다음 0.3% 과산화수소에 3-5분 동안 담근 다음 다시 PBS에 3 x 5분 동안 담그십시오.
- 다시 슬라이드를 용기에 평평하게 놓고 스트렙타비딘 HRP(양 고추냉이 과산화효소) 100μL를 넣고 30분 동안 그대로 둡니다(플라스틱 랩으로 덮음).
- 슬라이드를 PBS에 3 x 5분 동안 담그십시오.
- 슬라이드를 용기에 평평하게 놓고 100μL의 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 용액을 추가합니다. 밝은 갈색 배경을 찾으십시오.
- 슬라이드를 랙에 다시 넣고 물로 여러 번 씻으십시오 (이중 증류).
- 장착 매체의 유리 커버슬립 아래에 슬라이드를 장착하고 평평하게 두어 건조시킵니다.
- 광학 현미경으로 관찰하십시오.
- 세포자멸사 검출 키트(분석 B)
알림: 제조업체의 프로토콜을 따르십시오( 재료 표 참조).- 코플린 항아리를 준비하십시오.
- 프로테이나제 K(PBS에 희석한 20μg/mL)를 준비합니다.
- 섹션을 탈랍하고 재수화한 후(1.3단계) 슬라이드를 PBS에 5분 동안 놓습니다.
- 슬라이드를 용기에 평평하게 놓고 프로테이나제 K(20μg/mL, 5cm² 표본당 60μL)를 추가합니다.
- 슬라이드를 증류수로 2 x 2 분 동안 씻으십시오.
- 실온에서 내인성 과산화 효소 (3 % 과산화 수소 효소)에서 담금질합니다.
- 슬라이드를 PBS 또는 물로 2 x 5분 동안 헹굽니다.
- 슬라이드를 용기에 평평하게 놓고 실온에서 10초 동안 평형 버퍼(75μL/5cm2)를 적용합니다.
- 티슈 주위를 조심스럽게 닦으십시오.
- TdT 효소 (말단 데 옥시 뉴클레오티딜 트랜스퍼 라제)를 각 섹션에 첨가하고 37 ° C에서 1 시간 동안 가습 챔버에서 배양합니다. 종이 타월을 트레이 내부, 슬라이드 주위에 놓고 수건에 물을 적신 다음 플라스틱 랩으로 덮으십시오.
- 배양 후 표본을 랙에 넣고 정지/세척 버퍼(10분)에 그대로 둡니다.
- 항-디곡시제닌 접합체를 실온으로 따뜻하게 합니다.
- 슬라이드를 PBS로 세척합니다(3 x 1분).
- 조직 주위를 조심스럽게 닦아냅니다.
- 항-디곡시제닌-퍼옥시다제 접합체(65μL/5cm²) 2방울을 섹션에 추가하고 가습 용기에서 30분 동안 배양합니다.
- PBS 4 x 2 분으로 세척 한 후 작동 강도의 퍼 옥시 다제 기질을 준비하고 여분의 액체를 부드럽게 두드리고 섹션 주위를 흡인합니다.
- 과산화효소 기질(75μL/5cm²)로 섹션을 덮고 5분 동안 염색합니다. 현미경 아래에 슬라이드를 놓고 최적의 염색 시간을 결정합니다.
- 슬라이드를 증류수(3 x 1분)의 염색 선반으로 세척합니다.
- 슬라이드를 증류수에 5분 동안 배양합니다.
- 헤마톡실린을 사용하여 2분 동안 카운터염색합니다.
- 흐르는 수돗물에 슬라이드를 3분 동안 두십시오.
- 증류수로 슬라이드를 씻으십시오.
- 장착 매체의 유리 커버슬립 아래에 슬라이드를 장착하고 평평하게 두어 건조시킵니다.
- 광학 현미경으로 관찰하십시오.
- 세포자멸사 검출 키트(분석 C)
알림: 제조업체의 프로토콜을 따르십시오( 재료 표 참조).- 코플린 항아리를 준비하십시오.
- 조직 절편을 탈랍하고 재수화합니다(1.3단계 참조).
- 조직을 프로테이나제 K로 배양합니다(37°C에서 15-30분).
- 슬라이드를 랙에 다시 놓고 PBS로 2번 헹굽니다.
- 50 μL의 'TUNEL 반응 혼합물'로 덮습니다. 젖은 종이 타월을 용기 안에 넣고 플라스틱 랩으로 덮고 37 ° C에서 60 분 동안 그대로 두십시오.
- PBS로 3 번 헹굽니다.
- 슬라이드를 용기에 넣고 조직 샘플 주위를 건조시킵니다.
- 50μL의 변환기-AP를 샘플에 추가하고 37°C에서 30분 동안 가습 용기에서 배양합니다.
- PBS로 3 번 헹굽니다.
- 50-100 μL의 기질 용액을 첨가하고 어둠 속에서 10 분 동안 그대로 두십시오.
참고: 광학 현미경으로 염색을 관찰하십시오. - PBS로 슬라이드를 3배 헹굽니다.
- 섹션을 헤마톡실린에 2분 동안 옮겨 염색을 한 다음 흐르는 수돗물로 5분 동안 조심스럽게 헹굽니다.
- 수성 장착 매체의 유리 커버슬립 아래에 슬라이드를 장착하고 평평하게 두어 건조시킵니다.
- 광학 현미경으로 관찰하십시오. 광학 현미경으로 중추 또는 HPG의 각 샘플에서 70-100 개의 세포를 세어 영향을받은 (양성) 세포를 평가하십시오.
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Representative Results
중추의 세포 사멸 감지
류블 랴나에있는 슬로베니아 농업 연구소의 실험 양봉장에서 새로 출현 한 일벌 (Apis mellifera carnica)은 3 % 옥살산 (OA)으로 개별적으로 처리되었습니다.23. OA는 Varroa 소멸자 제어를 위해 양봉에 자주 사용됩니다. 처리 후, 일벌 (각 그룹에서 3 명)을 얼음 위에 고정시켰다. 중추를 해부하여 10 % 포르말린으로 고정시켰다. 그런 다음 조직을 일련의 알코올 용액에서 탈수시키고 최종적으로 파라핀 왁스에 매립했습니다. 마이크로톰으로 7 μm 얇은 절편으로 절단된 후, 조직 샘플을 분석을 위해 준비하였다. 광학 현미경을 사용하여 영향을받은 세포 (3 개의 중추 샘플 각각에서 70-100 개의 세포)의 백분율을 계산했습니다. 분석 B를 사용한 결과는 OA 처리가 중추의 세포에 상당한 영향을 미친다는 것을 나타냅니다(그림 3). 분석 A는 처리 된 꿀벌과 대조 꿀벌간에 차이가 없음을 보여주었습니다. 세포 사멸률은 10% 미만이었다. 설탕 시럽 만 먹인 대조 꿀벌에서는 중추의 형태가 영향을받지 않고 잘 보존되었습니다.
도 3: 중장 (A) 헤마톡실린 및 에오신 염색; (b) 중장의 면역염색 (분석 C). 강렬한 적색 염색은 중추 세포의 핵에 국한되어 있습니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
HPG의 세포 사멸 검출
다음 시험에서는 3 개의 무병 콜로니 (Apis mellifera L.)를 선택하여 실험을 수행했습니다. 덮인 무리가있는 빗을 인큐베이터 (34.5 ° C)에 넣고 새로 나온 일벌은 흉부에 반점을 표시하여 나이를 정의했습니다. 이 과정을 세 번 반복하여 다르게 노화 된 꿀벌을 얻었습니다. 꿀벌은 표시되어 식민지로 돌아 왔습니다. 꿀벌은 시험 시작으로부터 30 일 후에 샘플링되었습니다. 마지막으로, 그들은 한쪽면에 철망이있는 7.5cm x 4cm x 4cm 비축 케이지에 넣고 28 ° C의 인큐베이터에 보관했습니다.
작업자는 살충제 (imidacloprid) 또는 살비제 (coumaphos), 둘 다 치사량의 용액 또는 대조군으로 설탕 시럽으로 처리되었습니다10. 다른 그룹의 꿀벌은 고정되었고 HPG는 해부되었습니다. 샘플은 가능한 한 많은 세포를 얻기 위해 동일한 그룹의 3-5 명의 작업자로 구성되었습니다. 영향을 받은 세포를 면역조직학 방법을 사용하여 평가하였다. 적색 (분석 C) 및 갈색 (분석 B) 반응 생성물은 HPG의 세포 사멸 핵에서 검출되었다. imidacloprid 또는 coumaphos 처리 후 양성 적색 핵은 대부분의 선 세포에서 결정되었으며 (그림 4), 산발적 인 세포핵 만이 동일한 처리 그룹의 갈색 반응 생성물을 보였다. 대조군에는 손상된 HPG 세포가 없었습니다.
그림 4: 인두샘. (a) 헤마톡실린 및 에오신 염색; (b) 면역염색 (분석 C). 적색 염색은 세포의 핵에 국한되어 있습니다. (c) 면역염색 (분석 B). 갈색 반응 생성물은 양성 세포핵을 나타냅니다. 스케일 바 = 50mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
살아있는 유기체에서, 세포 사멸은 아폽토시스 또는 괴사(25)로서 정의되고, 자가포식(autophagy)26을 동반할 수 있다. 세포 사멸과 괴사 세포의 차이점은 세포 사멸은 프로그램 된 세포 사멸의 한 형태이며 정상 세포에서 나타나는 반면 괴사는 치명적인 상태 (예 : 사고, 질병)로 인해 발생한다는 것입니다 27,28. 아폽토시스는 TUNEL 기술(아폽토시스 동안 생성된 이중 가닥 DNA 절단에서 3'-하이드록실 말단을 표지하여 DNA 단편화 검출)을 기반으로 하는 분석 키트를 사용하여 검출할 수 있습니다. 다양한 키트는 세포 결실 검출에서 여러 수준의 감도를 제공합니다.
분석 중 하나 (분석 C)는 매우 민감하고 세포 사멸 및 괴사(29) 모두를 검출합니다. 다른 분석 (B)는 세포 사멸30을 검출하기 위해 더 높은 감도를 나타낸다. 분석 C의 원리는 세포 사멸의 초기 단계에서 DNA 절단을 감지하는 것입니다. 세포사멸 세포를 고정 및 투과화시킨 후, 조직을 TUNEL 반응 혼합물로 인큐베이션한다. 한편, TdT의 역할은 DNA의 유리 3'-OH 그룹에서 플루오레세인-dUTP의 첨가를 촉매하는 것입니다. 조직을 세척 한 후 항 플루오 레신 항체는 DNA의 손상된 부분에 라벨을 표시합니다. 항체의 원리는 리포터로 작용하는 효소 알칼리성 인산 가수 분해 효소에 부착하는 것입니다. 마지막으로, AP는 이러한 특정 반응(31)의 결과로서 볼 수 있다.
장기의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 광학 현미경을 사용한 형태학적 분석에 간단하고 유용한 방법입니다. 세포의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 이 단계를 먼저 포함하는 것이 좋습니다. 꿀벌 조직의 얇은 부분에서 세포 사멸의 초기 단계를 검출하기 위해 면역 조직 화학 분석에 적어도 두 개의 키트를 사용할 수 있습니다 ( 재료 표 참조). 둘 다 세포 사멸 세포 핵을 짙은 갈색으로 바꾸고 광학 현미경을 사용하여 시각화됩니다. 분석 A (TUNEL 기술)를 사용하여 스트렙타비딘 HRP (양 고추 냉이 퍼 옥시다아제)는 비오틴 화 뉴클레오티드에 접합하고 세포 사멸 핵은 DAB (디 아미노 벤지딘, 안정한 발색 물질)의 반응 후 갈색으로 변합니다. 분석 B는 초기 세포 사멸의 징후 인 DNA 절단 및 응축 된 염색질의 검출을 통해 세포 손상을 구별합니다.
건강한 유기체에서 세포 재생 수준은 일반적으로 작은 백분율로 평가할 수 있습니다32,33. OA 처리 후 중추의 세포 사멸이 증가했는데, 이는 OA의 사용이 실험실 실험에서 일벌의 중추에 해로운 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 이미다클로프리드(imidacloprid)와 쿠마포스(coumaphos)로 처리된 꿀벌 그룹은 세포 손상 또는 괴사를 나타내는 음식 땀샘(10)에서 증가된 세포 사멸(적색 핵)을 나타냈다; 프로그램 된 세포 사멸은 낮은 수준 (갈색 핵)에서 발견되었습니다 10. 그러나, 괴사 및 세포 사멸은 특히 imidacloprid 치료 후에 높은 수준에서 발견되었습니다. 처리되지 않은 꿀벌 그룹에서, HPGs에서 프로그램 된 세포 사멸의 수준은 정상 조직 회전율32에 따른 10 % 이하였다.
손상 또는 프로그램 된 세포 사멸로 인한 세포 사멸은 두 분석 (B 및 C)에 의해 검출되었으며 다른 감도를 초래했습니다. 첫 번째는 괴사 및 프로그램 된 세포 사멸11을 모두 감지합니다. 건강한 작업자 (대조군)에서 확인 된 바와 같이, 두 분석 모두 산발적 인 양성 세포가10 개만 검출되었습니다. 꿀벌 조직의 면역 조직 화학 분석에 사용되는 세포 사멸 및 괴사 검출 분석은 꿀벌에 대한 다양한 물질의 치명적인 영향을 탐구하는 강력한 방법으로 밝혀졌습니다.
프로토콜의 중요한 단계:
마이크로톰으로 절단한 후 조직 절편을 따뜻한 판(평탄화 테이블, 재료 표 참조)의 대물 렌즈 유리 위에 밤새 놓아야 합니다. 프로토콜의 향후 단계를 위해 샘플을 잘 건조시키는 것이 필수적입니다. 조직이 유리에 잘 부착되지 않으면 세포 사멸 검출 절차에서 표면에서 분리 될 수 있습니다. 광학 현미경을 사용하여 원하는 조직의 존재를 확인하는 것이 좋습니다. 다음으로, H & E로 첫 번째 슬라이드를 염색하여 많은 세포 (특히 선 조직)가있는 올바른 섹션을 확인하고 중추 섹션이 적절하지 않은 경우 새 섹션을 준비하는 것이 유용합니다. HPG는 찾기가 매우 어려울 수 있으므로 너무 많은 섹션을 자르지 않도록 주의해야 합니다. 그렇지 않으면 땀샘이 손실됩니다.
DNA 단편화를 검출하기 위해 양성 대조군을 추가하는 것은 유용하지만 선택 사항입니다. 실험 슬라이드에서 높은 배경 얼룩을 피하기 위해 슬라이드를 별도로 처리하는 것이 중요합니다. 분석 B에서, 양성 대조군은 일부 키트에 포함된다 ( 재료 표 참조); 다른 것들은 별도로 구입해야합니다.
이 방법은 길이와 정밀도에 제한이 있습니다. 수성 장착 매체에서 조직의 보존은 단기간(3개월 미만)입니다. 더 오래 보존하려는 경우 (색상 변경 가능성으로 인해 권장되지 않음) 다른 매체가 있지만 결과는 신뢰할 수 없습니다.
이 두 가지 방법 (세포 사멸 및 괴사 검출)을 동시에 사용하면 꿀벌 조직에 대한 살충제의 다양한 효과, 특히 치명적인 효과를 비교하는 데 매우 유용합니다. 대체 방법은 채집 활동을 관찰하고 살충제의 영향을받는 일벌의인지 인식에 미치는 영향입니다. 이러한 방법은 성인 꿀벌의 활동에 대한 치명적인 영향을 감지하는 데 더 빠르지 만 어린 (간호사) 꿀벌에서와 같이 초기 단계에서 행동을 바꿀 수있는 내부 손상의 정도에 관한 질문에는 대답하지 않습니다.
꿀벌 조직의 단순한 형태에 대한 조직학적 분석은 세포 손상, 세포자멸사 또는 기형에 대한 다양한 연구 관점에 접근하기 위한 견고한 기초입니다. 기생충 및 해충으로 인한 환경 또는 식민지 처리에서의 살충제 사용의 원인은 해로울 수 있으며 꿀벌의 수명과 식민지 생존에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 중추와 HPG는 꿀벌의 필수 기관이며 꿀벌의 연령 관련 활동에 영향을 미치는 모든 종류의 부정적인 외부 요인에 신속하게 대응할 수있는 능력과 목적을 가지고 있습니다. HPG는 크기와 분비 능력이 감소하고 중추의 상피 세포는 세포 사멸이 증가하여 반응합니다. 현장 연구와 같은 면역조직화학 방법은 꿀벌 조직에서 세포자멸사 검출에 유용한 도구입니다. 그들은 또한 꿀벌과 다른 유익한 곤충에 대한 가능한 부작용에 대한 연구에서 구현 될 가능성을 보여줍니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
슬로베니아 연구 기관, 보조금 번호 P4-133의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
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