Summary
Immunohistokemiska metoder är användbara i honungsbiforskning för att upptäcka och bedöma nivån av apoptos och nekros i midgut- och hypofaryngeala körtlar hos vuxna bin.
Abstract
Honungsbin (Apis mellifera L.) inuti bikupan (sjuksköterskor och andra bikupor) och utanför bikupan (födosökare) utsätts för klimat- och väderförändringar, olika bekämpningsmedel, patogener och undernäring, som huvudsakligen kommer in genom munnen och främst påverkar matsmältningsorganen hos vuxna bin. För att förstå och förhindra effekterna av sådana externa och interna stressfaktorer på honungsbin är en användbar forskningsmetod den immunohistokemiska metoden. Ett grundläggande protokoll beskrivs för att förbereda midgut (ventriculus) och hypofaryngeala körtlar (HPG) hos vuxna bin för histologisk analys. En detaljerad metod beskrivs för att bedöma nivån av cellskador och skilja nekros från programmerad celldöd (apoptos) som en naturlig process för vävnadsregenerering. Resultaten av vuxen honungsbibehandling med oxalsyra och bekämpningsmedel (insekticid och akaricid) och bestämning av celldöd i ventriculus och HPG presenteras. För- och nackdelar med metodiken diskuteras också.
Introduction
Honungsbin (Apis mellifera L.) är bland andra vilda pollinatörer de viktigaste pollinatörerna av jordbruksväxter. Under tusentals år har den förändrade miljön påverkat bin att anpassa sin morfologi, fysiologi, beteende och tolerans mot flera patogener och parasiter. Därför har honungsbin utvecklat ett mycket varierat utbud av arter och underarter runt om i världen1. Dessa resultat överensstämmer med tidigare fynd, att det finns genetisk variation i honungsbiets matsmältningsstruktur, men tyder också på att förändringar av midgut beror på miljöfaktorer 2,3.
Honungsbiets matsmältningsorgan har tre huvuddelar: foregut, midgut (ventriculus) och hindgut4. Ventriculus är ett viktigt organ för matsmältningen av pollen och nektar / honung; I bakguten sker osmotisk kontroll genom absorption av vatten och joner2. Hypofaryngeala körtlar (HPG) av honungsbiarbetare är belägna i huvudet och syntetiserar och utsöndrar kungliga gelékomponenter för att mata brödet, drottningen och medlemmarna i kolonin. Deras storlek förändras med ålder och uppgifter och beror på rätt näring (kvalitetspollen). Sjuksköterskor i åldern 6 till 18 dagar utför uppfödning av yngel och storleken på HPG ökar 5,6. I födosöksbin degenererar HPG: erna och utsöndrar endast enzymer som är viktiga för att omvandla de komplexa sockerarterna till enkla (α-glukosidaser, leucinarylamidas, invertas) i honung7.
Honungsbin utsätts för flera biotiska och abiotiska stressfaktorer8, och matsmältningskanalen kan påverkas av flera negativa stimulanser. Den första barriären som skyddar organismen från patogener är det peritrofa membranet i midguten, som består av tarmslimhinnan för att skydda mot patogener4. Utvecklingen och funktionen av HPG beror på kost, ålder och kolonitillstånd9 och påverkas av insekticider, akaricider 10 och patogener11,12,13. Akaricidrester i bikupan på grund av varroakontrollbehandling och bekämpningsmedel från miljön påverkar födosöksbin och sjuksköterska bin14,15. Det största hotet mot honungsbikolonier är kvalstret Varroa destructor, både som en vektor av virus som bidrar till koloniförluster16 och som konsument av värdens fettkropp (ett viktigt vitalt organ i honungsbin), vilket följaktligen påverkar individens kropp och kolonifunktioner17.
Intensiva livsmiljöer i odlingslandskapet kan dock ge honungsbin en kortsiktig livsmedelsförsörjning. Därför bör miljöprogram inom jordbruket öka tillgången på honungsblommor i jordbrukslandskap18. För att bedöma morfologin hos olika underarter 6,19,20,21 eller subletala effekter av dessa faktorer på cell- eller vävnadsnivåer, särskilt midgut och HPG, är histologiska och immunohistokemiska metoder praktiska och tillräckligt exakta för att kunna användas i histologiforskning i honungsbin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Grundläggande histologi för honungsbiforskning
- Dissektion av honungsbivävnad
OBS: För dissektion av arbetarbin, använd ett dissekerande mikroskop med en LED-ljuskälla. Den mest användbara förstoringen är ~ 20x.- Manipulation och dissektion
- Ta försiktigt ett arbetarbi med pincett och lägg det på is (eller i frysen vid -20 ° C) i 2 minuter för att immobilisera det22. Fäst biet på petriskålen diagonalt genom den översta bakre delen av bröstkorgen två gånger, från vänster till höger och från höger till vänster.
- Häll insektssaltlösning för att täcka kroppen. Placera petriskålen under mikroskopet, fokusera och justera.
- Förbered instrumenten (se materialförteckningen).
- Dissektion av midgut
- Börja med buken genom att sätta in en saxpunkt under tergiten A5 (figur 1) i mitten av bikroppens högra sida. Skär till tergite A2.
- Håll saxens inre blad parallellt med kroppens sida för att undvika att skada de inre organen. Vrid saxen åt vänster och gör ett snitt; sväng höger och gör ett nytt snitt. Öppna försiktigt den vänstra delen av buken och stift den. Upprepa på andra sidan.
- Använd pincett med ena handen, dra försiktigt honungsbimagen uppåt och med sax i den andra handen, skär i slutet av matstrupen. Dra magen och midguten bort från buken och skär i ändtarmen. Använd en pipett med insektssaltlösning och ta bort avföring eller delar av vävnaden.
- Dissektion av HPG
- Immobilisera ett arbetarbi på is enligt beskrivningen i steg 1.1.1. Klipp av huvudet och placera det på den mindre plattan med antennerna uppåt. Säkra huvudet med två stift: en genom det vänstra sammansatta ögat och det andra genom det högra sammansatta ögat.
- Gör ett snitt över det första sammansatta ögat på insidan av stiften, fortsätt till labrum och gör sedan ett nytt snitt på andra sidan över det andra sammansatta ögat (figur 2).
- Klipp av antennerna. Lyft av masken och skär där den fortfarande är fäst. Ta pincetten och ta försiktigt bort körtlarna tillsammans med hjärnan och en del av de sammansatta ögonen.
- Manipulation och dissektion
- Fixering, uttorkning och paraffinbäddning
OBS: Använd skyddshandskar.- Placera vävnaden i penicillinflaskor, fyllda 3/4 med 10% formalin. Förvaras i kylskåp vid 4 °C.
- Efter 24 h, dehydrera vävnaden i en serie alkoholer: 70%, 80%, 90%, 100%, för 1 h vardera, 100% 2-propanol för 1 h, 100% 2-propanol i 12 h och slutligen 100% 2-propanol för 1 h.
- Placera vävnaden i histokassetter; markera och placera dem i glaskamrarna med 2-propanol och paraffin (1:1) i en inkubator vid 60 °C i 24 timmar.
- Flytta histokassetterna till en annan kammare med paraffin (I.) i ytterligare 24 timmar. Upprepa proceduren med färskt paraffin två gånger till (II. och III.), båda i 24 timmar.
- Slutligen förbered monteringsstationen och börja bädda in vävnaden i vax.
- Öppna varje histokassett och ta bort locket. Fyll formen med vax och lägg försiktigt vävnaden med varma pincett i mitten av formen.
- Placera histokassetten på formen och täck den något med vax. Placera omedelbart formen på monteringsstationens kalla yta i några sekunder och lägg den sedan på den kalla plattan i några minuter tills vaxet härdar och separeras från formen tillsammans och histokassetten.
- Förvara de färdiga proverna i en låda, borta från damm och värme.
- Skär 4 μm tunna sektioner på en mikrotom: först två sektioner fästa vid varandra och sedan en separat. Överför sektionerna med pincett och låt dem flyta på destillerat vatten (42 °C), samla dem sedan på rena bilder genom att placera två sektioner tillsammans på vänster sida av målglaset och den tredje på höger sida, som förblir tydligt åtskilda. Lämna de markerade bilderna över natten på värmeanordningen och förvara dem slutligen i en låda avsedd för histologiprover.
- Avvaxning och rehydrering
OBS: Använd skyddshandskar.- Förbered nio Coplin-burkar och lägg sektionerna i en serie clearingagenter (I., II., III.) i 5 minuter vardera.
- Sätt i 2-propanol, etanol 96% (I., II.), alkohol 90% och 80% och destillerat vatten i 3 minuter vardera.
- Färgning med hematoxylin och eosin
OBS: Använd skyddshandskar.- Förbered sex Coplin-burkar.
- För hematoxylin och eosin (H&E) färgning, lägg de avvaxade, rehydrerade sektionerna i hematoxylin i 5 min och placera dem sedan försiktigt under det rinnande kranvattnet i 2 min. Lägg dem sedan i destillerat vatten i 1 min och eosin i 4 min (för eosin är Coplin-burken inte nödvändig).
- Placera objektsglasen i etanol 96% i 1 min, sedan 2-propanol i 2 min och slutligen i clearingmedlet i 2 min.
- Tillsätt monteringsmedium och ett täckglas och låt dem torka. Observera under ett ljusmikroskop.
Figur 1: Dorsalvy av honungsbikropp. A1-A7 tergiter. De detaljerade instruktionerna om dissektion av honungsbin finns i Carreck et al.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Dorsalvy av HPG, delar av sammansatta ögon fästa vid hjärnan (ej synliga). Ett ungt arbetarbi i åldern 5 till 6 dagar har fylliga och krämiga vita HPG. Acini ligger på hjärnan och fyller huvudområdet med grenar som når hjärnans baksida. Vid födosök av bin krymps dessa körtlar kraftigt och lämnar bara tunna trådliknande rester. Av denna anledning är det bättre att ta bort körtlar tillsammans med hjärnan för att göra det lättare i ytterligare procedurer för att undvika att förlora vävnaden. Skalstreck = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Celldödsdetektering i vävnadssektioner
- Apoptosdetekteringssats (analys A)
OBS: Följ tillverkarens protokoll (se materialförteckningen).- Förbered Coplin-burkarna.
- Efter avvaxning och rehydrering (se steg 1.3), sänk ned objektglasen i 0,85 % NaCl-lösning och därefter i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (5 min).
- Sätt bilderna i 4% paraformaldehyd 2 x 15 min.
- Placera objektglasen plant i behållaren och tillsätt 100 μl av en Proteinas K (20 μg/ml) lösning och låt dem sedan stå i 10-30 min.
- Placera bilderna i PBS (5 min).
- Placera objektglasen i 4% paraformaldehyd i PBS (5 min).
- Sänk ner bilderna i PBS (2 x 5 min).
- Placera bilderna platt i behållaren, tillsätt 100 μl jämviktsbuffert och låt dem stå i 5-10 minuter.
- Tillsätt 100 μl TdT-reaktionsblandning. Lägg pappershanddukar inuti behållaren, runt bilderna, fukta handdukarna med vatten och täck sedan med plastfolie. Inkubera objektglas i 60 minuter vid 37 °C.
- Placera tillbaka bilderna i färgningsstället och sänk ner i 2x saltlösning-natriumcitrat (SSC) i 15 minuter.
- Sänk ner bilderna 3 x 5 min i PBS, sedan i 0,3% väteperoxid i 3-5 min, och sedan i PBS igen, 3 x 5 min.
- Återigen, placera bilderna platt i behållaren, tillsätt 100 μL Streptavidin HRP (pepparrotsperoxidas) och låt stå i 30 min (täck med plastfolie).
- Sänk ner bilderna 3 x 5 min i PBS.
- Placera objektglasen plant i behållaren och tillsätt 100 μl 3,3'-diaminobenzidin (DAB)-lösning. Leta efter en ljusbrun bakgrund.
- Sätt tillbaka bilderna på stället och tvätta dem flera gånger i vatten (dubbeldestillerat).
- Montera rutschkanorna under glasöverdrag i monteringsmedium och låt stå platt för att torka.
- Observera under ett ljusmikroskop.
- Apoptosdetekteringssats (Analys B)
OBS: Följ tillverkarens protokoll (se materialförteckningen).- Förbered Coplin-burkar.
- Bered proteinas K (20 μg/ml utspätt i PBS).
- Efter avvaxning och rehydrering av sektionerna (steg 1.3), placera bilderna i PBS i 5 minuter.
- Placera objektglasen plant i behållaren och tillsätt proteinas K (20 μg/ml, 60 μl per 5 cm² prov).
- Tvätta bilderna 2 x 2 min i destillerat vatten.
- Släck i endogent peroxidas (i 3% väteperoxidas) vid rumstemperatur.
- Skölj bilderna 2 x 5 min med PBS eller vatten.
- Placera objektglasen plant i behållaren och applicera jämviktsbuffert (75 μl/5 cm2) i 10 s vid rumstemperatur.
- Torka försiktigt runt vävnaden.
- Tillsätt TdT-enzymet (terminalt deoxinukleotidyltransferas) till varje sektion och inkubera i en fuktad kammare i 1 timme vid 37 °C. Lägg pappershanddukar inuti brickan, runt bilderna, fukta handdukarna med vatten och täck dem med plastfolie.
- Efter inkubation, lägg proverna i stället och lämna dem i stopp/ tvättbuffert (10 min).
- Värm anti-digoxigeninkonjugatet till rumstemperatur.
- Tvätta bilderna i PBS (3 x 1 min).
- Torka försiktigt av runt vävnaden.
- Tillsätt två droppar antidigoxigeninperoxidaskonjugat (65 μl/5 cm²) till sektionerna och inkubera i 30 minuter i en fuktad behållare.
- Efter tvätt i PBS 4 x 2 min, förbered arbetsstyrka peroxidassubstrat och knacka försiktigt bort överflödig vätska och aspirera runt sektionen.
- Täck sektionerna med peroxidassubstrat (75 μl/5 cm²) och fläcka i 5 min. Placera en bild under mikroskopet och bestäm den optimala färgningstiden.
- Tvätta bilderna i ett färgningsställ i destillerat vatten (3 x 1 min).
- Inkubera bilderna i destillerat vatten i 5 minuter.
- Motfärgning med hematoxylin i 2 min.
- Placera rutschkanan under rinnande kranvatten i 3 minuter.
- Tvätta bilden i destillerat vatten.
- Montera rutschkanorna under glasöverdrag i monteringsmedium och låt stå platt för att torka.
- Observera under ett ljusmikroskop.
- Apoptosdetekteringssats (analys C)
OBS: Följ tillverkarens protokoll (se materialförteckningen).- Förbered Coplin-burkarna.
- Avvaxa och rehydrera vävnadssektionerna (se steg 1.3).
- Inkubera vävnaden med proteinas K (15–30 min vid 37 °C).
- Placera tillbaka bilderna på racket och skölj 2x i PBS.
- Täck med 50 μl "TUNEL-reaktionsblandning". Placera våta pappershanddukar inuti behållaren, täck dem med plastfolie och låt dem stå i 60 minuter vid 37 °C.
- Skölj 3x med PBS.
- Placera objektglasen i behållaren och torka området runt vävnadsprovet.
- Tillsätt 50 μl omvandlare-AP till provet och inkubera i en fuktad behållare i 30 minuter vid 37 °C.
- Skölj 3x i PBS.
- Tillsätt 50-100 μl substratlösning och låt stå i 10 minuter i mörkret.
OBS: Observera färgningen under ett ljusmikroskop. - Skölj bilderna 3x med PBS.
- Motmåla genom att överföra sektioner till hematoxylin i 2 min och skölj sedan försiktigt i rinnande kranvatten i 5 min.
- Montera rutschkanorna under glaskåpor i ett vattenhaltigt monteringsmedium och låt dem torka platt.
- Observera under ett ljusmikroskop. Bedöm de drabbade (positiva) cellerna genom att räkna 70 till 100 celler i varje prov av midgut eller HPG under ett ljusmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celldödsdetektering i midgut
Nyuppkomna arbetarbin (Apis mellifera carnica) från den experimentella bigården vid Sloveniens jordbruksinstitut i Ljubljana behandlades individuellt med 3% oxalsyra (OA)23. OA används ofta i biodling för Varroa destructor kontroll. Efter behandlingen immobiliserades arbetarbina (tre från varje grupp) på is. Midguten dissekerades och fixerade den i 10% formalin. Vävnaden dehydrerades sedan i en serie alkohollösningar och slutligen inbäddades i paraffinvax. Efter att ha skurits med en mikrotom i 7 μm tunna sektioner förbereddes vävnadsproverna för analys. Med hjälp av ett ljusmikroskop beräknades andelen drabbade celler (70-100 celler från var och en av tre midgutprover). Resultaten med Assay B indikerade att behandling med OA signifikant påverkade cellerna i mellantarmen (figur 3). Analys A visade ingen skillnad mellan behandlade bin och kontrollbin; Graden av celldöd var under 10%. I kontrollbin, som endast matades med sockersirap, var midgutens morfologi opåverkad och välbevarad.
Figur 3: Midgut. (A) Hematoxylin och eosinfärgning; (B) Immunfärgning (Analys C) av mellantarmen. Intensiv röd färgning är lokaliserad i kärnorna i midgutcellerna. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Celldödsdetektering i HPG
I nästa studie genomfördes experimentet och valde tre sjukdomsfria kolonier (Apis mellifera L.). Kammar med täckt kull placerades i en kuvös (34,5 °C), och de nyuppkomna arbetarbina märktes med en fläck på bröstkorgen för att definiera deras ålder. Denna procedur upprepades tre gånger för att få olika åldrade bin. Bina märktes och återvände till sin koloni. Bina provtogs efter 30 dagar från försökets början. Slutligen sattes de i en 7,5 cm x 4 cm x 4 cm hamstringsbur, med trådnät på ena sidan och förvarades i en kuvös vid 28 °C.
Arbetare behandlades med insektsmedel (imidakloprid) eller akaricid (kumarofos), båda lösningarna i subletala doser eller sockersirap som kontrollgrupp10. Bina i olika grupper immobiliserades och HPG: erna dissekerades. Ett prov bestod av tre till fem arbetare från samma grupp för att få så många celler som möjligt. De drabbade cellerna utvärderades med hjälp av immunohistologiska metoder. Röda (Assay C) och bruna (Assay B) reaktionsprodukter detekterades i de apoptotiska kärnorna i HPG. Positiva röda kärnor efter imidakloprid eller kumarofosbehandling bestämdes i majoriteten av körtelcellerna (Figur 4), och endast sporadiska cellkärnor visade brun reaktionsprodukt från samma behandlade grupper. Kontrollgruppen hade inga skadade HPG-celler.
Figur 4: Hypofaryngeala körtlar. (A) Hematoxylin och eosinfärgning; B) Immunfärgning (analys C). Röd färgning är lokaliserad i cellernas kärnor. c) Immunfärgning (analys B). Brun reaktionsprodukt indikerar de positiva cellkärnorna. Skalstänger = 50 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I levande organismer definieras celldöd som apoptos eller nekros25 och kan åtföljas av autofagi26. Skillnaden mellan apoptotiska och nekrotiska celler är att apoptos är en form av programmerad celldöd och uppträder i normala celler, medan nekros uppstår på grund av dödliga tillstånd (t.ex. olycka, sjukdom)27,28. Apoptos kan detekteras med hjälp av analyssatser baserade på TUNEL-tekniken (detektion avDNA-fragmentering genom märkning av 3′-hydroxylterminerna i dubbelsträngs-DNA-pauser som genereras under apoptos). Olika kit ger flera nivåer av känslighet vid detektering av cellradering.
En av analyserna (Assay C) är mycket känslig och detekterar både apoptos och nekros29; den andra analysen (B) visar högre känslighet för att detektera apoptotisk celldöd30. Principen för analys C är att upptäcka DNA-brott i de tidiga stadierna av apoptos. Efter fixering och permeabilisering av de apoptotiska cellerna inkuberas vävnaden med en TUNEL-reaktionsblandning. Under tiden är TdT: s roll att katalysera tillsatsen av fluorescein-dUTP vid fria 3′-OH-grupper i DNA. Efter att vävnaden har tvättats markerar anti-fluorescein-antikroppen etiketten i de skadade delarna av DNA. Principen för antikroppen är att fästa vid enzymet alkaliskt fosfatas som fungerar som reporter. Slutligen kan AP ses som ett resultat av denna specifika reaktion31.
Hematoxylin och eosinfärgning av organ är en enkel och användbar metod för morfologisk analys med hjälp av ljusmikroskopi. Inklusive detta steg först för att observera eventuella morfologiska förändringar av celler rekommenderas. För detektion av tidiga stadier av apoptos i de tunna delarna av honungsbivävnad finns minst två kit tillgängliga för immunohistokemisk analys (se materialförteckningen). Båda gör de apoptotiska cellkärnorna mörkbruna och visualiseras med hjälp av ljusmikroskopi. Med hjälp av analys A (TUNEL-teknik) konjugerar Streptavidin HRP (pepparrotsperoxidas) till biotinylerade nukleotider och apoptotiska kärnor blir bruna efter reaktionen av DAB (diaminobenzidin, en stabil kromogen). Analys B skiljer cellskador genom detektion av DNA-klyvning och kondenserat kromatin, vilket är ett tecken på tidig apoptos.
I en frisk organism kan nivån av cellförnyelse vanligtvis bedömas i små procentandelar32,33. Celldöden i midguten ökade efter OA-behandlingen, vilket indikerar att användningen av OA har en skadlig effekt på arbetarbins midguts i laboratorieexperiment. Gruppen av bin som behandlades med imidakloprid och kumaros avslöjade en ökad celldöd (röda kärnor) i livsmedelskörtlarna10, vilket indikerar cellskada eller nekros; programmerad celldöd hittades på en låg nivå (bruna kärnor)10. Nekrotisk och apoptotisk celldöd hittades emellertid vid höga nivåer, särskilt efter imidaklopridbehandling. I gruppen obehandlade bin var nivån av programmerad celldöd i HPG inte mer än 10%, vilket är i enlighet med normal vävnadsomsättning32.
Celldöd, både på grund av skada eller programmerad celldöd, upptäcktes av båda analyserna (B och C) och resulterade i olika känslighet; Den första upptäcker både nekrotisk och programmerad celldöd11. Som bekräftats hos de friska arbetarna (kontrollgruppen) detekterade båda analyserna sporadiska positiva celler endast10. Apoptos- och nekrosdetekteringsanalyserna som används vid immunohistokemisk analys av honungsbivävnad visade sig vara en kraftfull metod för att utforska de subletala effekterna av olika ämnen på honungsbin.
Kritiska steg i protokollet:
Efter att ha skurits med en mikrotom måste vävnadssektioner placeras på målglaset på en varm platta (plattbord, se materialtabell) över natten. Det är viktigt att proverna torkas väl för framtida steg i protokollen. När vävnaden inte är väl fastsatt på glaset kan den lossna från ytan i proceduren för celldödsdetektering. Det är lämpligt att använda ljusmikroskopet för att verifiera närvaron av önskad vävnad. Därefter är det användbart att färga den första bilden med H&E för att kontrollera om det finns rätt sektion med många celler (särskilt körtelvävnaden) och förbereda nya om midgutsektionen inte är lämplig. HPG kan vara ganska utmanande att hitta, så man måste vara försiktig så att man inte skär för många sektioner; Annars kommer körtlarna att gå vilse.
Att lägga till positiv kontroll för att upptäcka DNA-fragmentering är användbart men valfritt. Det är viktigt att behandla bilderna separat för att undvika hög bakgrundsfärgning i de experimentella bilderna. I analys B ingår de positiva kontrollerna i några av satserna (se materialförteckningen). andra bör köpas separat.
Metoden har en begränsning i sin längd och precision. Bevarande av vävnad i ett vattenhaltigt monteringsmedium är endast kortsiktigt (under 3 månader). Om längre konservering önskas (rekommenderas inte på grund av eventuella färgförändringar) finns det andra medier, men resultaten är inte lika tillförlitliga.
Att använda dessa två metoder (apoptos och nekrosdetektering) samtidigt är mycket användbart för att jämföra de olika effekterna av bekämpningsmedel på honungsbivävnad, särskilt för subletala effekter. Den alternativa metoden skulle vara observation av födosöksaktivitet och dess inverkan på den kognitiva uppfattningen av arbetarbin som påverkas av bekämpningsmedel. En sådan metod skulle vara snabbare när det gäller att upptäcka subletala effekter på vuxna bins aktiviteter, men skulle inte svara på några frågor om omfattningen av de inre skador som kan förändra beteendet i ett tidigt skede, som hos unga (sjuksköterska) bin.
Histologisk analys av honungsbivävnadens enkla morfologi är en solid grund för att närma sig olika forskningsperspektiv i cellskador, apoptos eller missbildningar. Orsakerna till användning av bekämpningsmedel i miljön eller kolonibehandling på grund av parasiter och skadedjur kan vara skadliga och väsentligt påverka honungsbiets livslängd och koloniöverlevnad. Midgut och HPG är viktiga organ i honungsbin och har förmågan och syftet att snabbt reagera på alla typer av negativa yttre faktorer som påverkar binas åldersrelaterade aktiviteter. HPG: erna minskar i storlek och utsöndringsförmåga, och epitelceller i midguten svarar med ökad celldöd. Immunohistokemiska metoder, såsom in situ-studier , är användbara verktyg för detektering av apoptos i bivävnad. De visar också på potentialen att implementeras i studier av möjliga negativa effekter på honungsbin och andra nyttiga insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Jag erkänner tacksamt stödet från den slovenska forskningsbyrån, bidrag nr P4-133.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R.
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , Dadant and Sons. 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. , Cornell University Press. (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , Taylor & Francis Group. 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M.
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, Ö Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , Chapman & Hall. London. (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D'Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
