Summary
Den nuværende protokol beskriver en metode til injektion af flåtembryoner. Embryoinjektion er den foretrukne teknik til genetisk manipulation til at generere transgene linjer.
Abstract
Flåter kan overføre forskellige virale, bakterielle og protozoiske patogener og betragtes derfor som vektorer af medicinsk og veterinær betydning. På trods af den voksende byrde af flåtbårne sygdomme har forskning i flåter haltet bagefter insektsygdomsvektorer på grund af udfordringer med at anvende genetiske transformationsværktøjer til funktionelle undersøgelser til flåternes unikke biologi. Genetiske indgreb har fået opmærksomhed for at reducere myggebårne sygdomme. Udviklingen af sådanne interventioner kræver imidlertid stabil kimlinjetransformation ved at injicere embryoner. En sådan embryoinjektionsteknik mangler for chelicerater, herunder flåter. Flere faktorer, såsom et eksternt tykt vokslag på flåtembryoner, hård chorion og højt intra-ovalt tryk, er nogle forhindringer, der tidligere forhindrede embryoinjektionsprotokoludvikling i flåter. Det nuværende arbejde har overvundet disse forhindringer, og en embryoinjektionsteknik til den sortbenede flåt, Ixodes scapularis, er beskrevet her. Denne teknik kan bruges til at levere komponenter, såsom CRISPR/Cas9, til stabile kimlinjetransformationer.
Introduction
Flåter er vektorer af medicinsk og veterinær betydning, der er i stand til at overføre en række virale, bakterielle, protozopatogener og nematoder 1,2. I det østlige USA er den sortbenede flåt, Ixodes scapularis, en vigtig vektor af Lyme-sygdommen (LD) patogenet, spirochete Borrelia burgdorferi. Over 400.000 tilfælde af LD rapporteres hvert år i USA, hvilket gør det til den øverste vektorbårne infektionssygdom i USA1. Ud over B. burgdorferi overføres seks andre mikroorganismer af I. scapularis- herunder fire bakterier (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi og Ehrlichia muris eauclarensis), en protozoparasit (Babesia microti) og en virus (Powassan-virus), hvilket gør denne flåtart til et stort folkesundhedsproblem3 . Mens flåtbårne sygdomme er blevet mere udbredte i de senere år, er forskning i flåter faldet bag andre leddyrvektorer, såsom myg, på grund af flåternes unikke biologi og udfordringer forbundet med anvendelse af genetiske og funktionelle genomiske værktøjer 4,5.
Genredigeringsteknikker, især CRISPR/Cas9, har nu gjort funktionelle genomforskningsstudier mulige i organismer uden for modellen. For at skabe arvelige mutationer i en organisme forbliver embryoinjektion den foretrukne metode til at levere konstruktioner til ændring af kimlinjen 6,7,8,9. Indtil for nylig 4 blev flåtæg imidlertid betragtetsom for vanskelige eller endda umulige at injicere uden at dræbe embryoet10,11. Et tykt vokslag på æg, hård chorion og højt intra-ovalt tryk var nogle af de største forhindringer, der forhindrede embryoinjektion i flåter. Voksen, blodfodret I. scapularis deponerer en enkelt kobling på op til 2.000 æg12 over 3-4 uger (ca. 100 æg / dag). Æg lægges enkeltvis, og hvert æg er belagt med voks, der udskilles af fremspring eller "horn" af kirtelgenéens organ13,14,15 af moderen. Denne voks beskytter æggene mod udtørring og indeholder antimikrobielle forbindelser15. For at kunne injicere krydsæg er det vigtigt at fjerne vokslaget, blødgøre chorionen og udtørre æggene for at mindske det intraovale tryk, så injektionen ikke irreversibelt beskadiger ægget. For at forstå den kritiske betydning af embryoinjektioner for en vellykket kimlinjetransformation udvikles en protokol for I. scapularis, som kan bruges til at levere en CRISPR / Cas9-konstruktion og generere stabile kimlinjemutationer4. Ud over dets bidrag til I. scapularis-forskning kan denne protokol også optimeres til andre flåtarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ixodes scapularis voksne blev enten købt fra Oklahoma State University (OSU) eller opdrættet på University of Nevada, Reno (UNR) (IACUC protokol # 21-001-1118).
1. Forberedelse af kvindelige flåter til embryoindsamling
BEMÆRK: For at samle æg i passende alder er det vigtigt at synkronisere æglægning. Selvom æglægningssignaler i flåter forbliver uklare, begynder I. scapularis-hunner under de normale insektforhold (27 ° C temperatur og >90% relativ fugtighed (RH)) at lægge æg ca. 8 dage efter værtsopløsning. Denne tidslinje kan forlænges ved at opbevare fyldte hunner ved 4 °C. Vi har opbevaret blodfodrede hunner ved 4 °C i op til 8 uger uden nogen negativ effekt på æglægningen. Disse betingelser skal muligvis ændres for hvert insekt.
- Opbevar alle fyldte hunner ved 4 °C med >90% RH i en 6-liters plastkasse foret med fugtigt filterpapir, indtil de bruges til mikroinjektioner.
- En uge før injektioner overføres hunnerne fra 4 °C til en 27 °C inkubator til igangsætning af æglægning.
- Når hunnerne begynder at lægge æg (3-4 dage efter at have flyttet dem til 27 °C), skal du fjerne eventuelle æg med en pensel med fin spids og forberede hunnerne på Genés organablation (vokskirtel).
BEMÆRK: Genés organ strækker sig fra området mellem scutum og capitulum (dorsal base af munddelene), munddele bøjer over den ventrale kropsoverflade (parallelt med overfladen), og det udvidede Genes organ dækker æg, så snart æggene er lagt (figur 1). Æg, der lægges før Genés organfjernelse eller tømning af voks, vil have en voksbelægning og er ikke egnede til injektioner og skal kasseres. - For enten at fjerne eller tømme Genés organ skal du bruge ler til at placere den opsvulmede kvinde på et glasglas under et mikroskop orienteret, så munddele er synlige på både ventrale og dorsale sider (figur 1B, C).
- Stik forsigtigt området nøjagtigt mellem scutum og munddele ved hjælp af fine tang og wolframnåle fremstillet i laboratoriet ved hjælp af wolframtråd efter en tidligere offentliggjort protokol16 (nåle kan også købes kommercielt og fastgøres til en mikrodissekeringssonde, se Materialetabel).
- Arbejd vejen ind med wolframnålen, træk vokskirtlen ud (figur 1D, E). Det kan tage flere minutter at fjerne kirtlen. Tør enhver flydende vokssekretion væk ved hjælp af laboratorieservietter.
BEMÆRK: Kirtlen kan også fjernes fra den ventrale side lige under munddelene; ved at række bagud mod scutum med en nål og tang. Påføring af siliciumlim omkring munddele blokerer også Genes organeversion og kan bruges i stedet for at fjerne eller tømme voksen (personlig kommunikation med Dr. Ladislav Simo, INRAE, Frankrig). Engorged flåter forbliver ikke på dobbeltsidet tape. Ved hjælp af ler til at "svøbe" hjælper flåten med at holde dem på plads under manipulation. Brug tang til at holde flåten og wolframnålen til dissektion. Den ventrale del er lettere at gennembore med en nål og foretrækkes af forfatterne.
- For at tømme kirtlen skal du arrangere gravid tick som nævnt i trin 1.4. Punkter forsigtigt området bag munddelene på rygsiden og læg pres på den ventrale side ved hjælp af tang.
BEMÆRK: Alternativt er det ikke nødvendigt at fjerne vokskirtlen; tømning af vokskirtlen vil vare i flere dage. Æglæggende hunner har et hvidt område omkring munddelene, der angiver placeringen af vokskirtlen og kan bruges som reference.- Placer kanten af en fnugfri laboratorieserviet, og fjern den flydende voks, der kommer ud af punkteringsstedet. Sørg for at undgå hæmolymfesekretion, som er en klar væske sammenlignet med let gullig tyktflydende voks. Det kan tage 5-10 min indtil det meste af voksen er fjernet.
- Efter manipulation placeres hunner i en inkubator ved 27 °C (>90% RH) og giver dem mulighed for at komme sig i 1-2 dage.
BEMÆRK: Behandlede kvinder tager normalt 1-2 dage at komme sig og begynde at lægge æg igen. - Når hunnerne begynder at lægge æg igen, skal du bruge en fin pensel til at samle frisk deponerede æg (0-18 timer efter æglægning) og placere dem i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Hvis du bruger æg fra samme kvinde over tid, skal denne procedure gentages efter 4-5 dages æglægning, hvis kirtler ikke blev fjernet.
2. Embryobehandling af mikroinjektioner
- Tilsæt ~200 μL (eller tilstrækkeligt volumen til at dække æggene, afhængigt af antallet af æg) af 5% (vægt/volumen) benzalkoniumchlorid/vand (se Materialetabel) i røret indeholdende 0-18 timer gamle æg. Hvirvl forsigtigt æggene med penslen i 5 minutter for at undgå, at æggene sætter sig i bunden af røret (for detaljer, se Sharma et al.4). Fjern supernatanten ved hjælp af en mikropipette, og lad æggene stå i røret.
FORSIGTIG: Benzalkoniumchlorid er ætsende for hud og øjne, brug handsker og øjenbeskyttelse. - Tilsæt ~ 200 μL destilleret (DI) vand til røret, der indeholder æg, hvirvl med en pensel, og fjern vandet fra mikrocentrifugerøret ved hjælp af en mikropipette. Gentag vasken med DI-vand en gang til.
- Efter vask med DI-vand tilsættes ~ 200 μL 5% (w / v) natriumchlorid (NaCl) og hvirvles forsigtigt med en pensel i 5 minutter. Fjern opløsningen fra røret efter 5 min og vask æggene to gange med DI vand.
- Tilsæt ~100 μL 1% (w/v) NaCl-opløsning i mikrocentrifugerøret indeholdende æg. Æggene opbevares i 1% (w/v) NaCl-opløsning, indtil de anvendes til injektionsvæsker.
- Start mikroinjektioner efter ca. en time. Denne tidslinje hjælper med korrekt udtørring af æggene og forhindrer dem i at briste.
BEMÆRK: Æg kan opbevares i 1% (w / v) NaCl-opløsning i 7-8 timer uden at påvirke overlevelsen væsentligt. Hvis æggene er vanskelige at injicere eller sprænge, er æggene ikke udtørret nok og kan yderligere behandles med 5% (w / v) NaCl i yderligere 5 minutter.
3. Forberedelse af injektionsnåle
- Indsæt et aluminosilikatkapillærglas (med glødetråd, se Materialetabel) i nåletrækkeren efter producentens anvisninger.
- Juster nåletrækkeren til følgende indstillinger: Varme: 575, Træk: 20, Hastighed: 50, Tid: 200 og Tryk: 700.
- Aktiver nåletrækkerens trækfunktion, og gentag processen for yderligere nåle.
- Opbevar de trukne nåle ved at stikke dem i linjer af modellervoks i en ren petriskål.
- Læg kanylen med injektionsblandingen ved hjælp af en mikrolæsserspids (se Materialetabel).
BEMÆRK: Sammenligningen af nåle, der anvendes til kryds- og mygembryoinjektion, er vist i figur 2.
4. Dias opsætning til mikroinjektionerne
- Ved hjælp af dobbeltsidet tape skal du klæbe to glasmikroskopglider sammen og efterlade et hul på ca. 0,5 cm for at understøtte justering af æg og forhindre dem i at rulle over under injektioner (figur 3A).
- Påfør et stykke gennemsigtig filmdressing (se Materialetabel) på det dobbeltsidede tape i mellemrummet mellem diasene. Sørg for at justere filmdressingen perfekt med hullet.
5. Embryo mikroinjektioner
- Juster 8-10 æg ad gangen på diasopsætningen (ovenfor) ved hjælp af en enkelthåret pensel.
BEMÆRK: Æg, der er justeret med den længere akse vinkelret (figur 3B) på glidekanten, er lettere at injicere end æg, hvis længdeakse er justeret parallelt med kanten (figur 3C). Æg i vinkelret orientering (figur 3B) kan bedre modstå injektion, hvilket resulterer i højere overlevelse. - Placer diaset med justerede æg på scenen af et sammensat mikroskop. Brug et stykke fnugfri klud til at fjerne 1% NaCl-opløsningen, hvori de opbevares.
- Fastgør den fyldte injektionsnål til en mikroinjektor, der er forbundet til en mikromanipulator (se Materialetabel).
- Åbn nålen ved forsigtigt at gnide den mod ægoverfladen ved hjælp af en højtryksindstilling på mikroinjektoren (>5.000 hPa).
- Når nålen er åbnet, reduceres trykket (1.000-2.500 hPa) af mikroinjektoren afhængigt af nålens åbning.
BEMÆRK: En lille åbning kræver forholdsvis højere tryk, mens en større åbning kræver et lavere tryk. Dette er for at kontrollere volumenet af den injicerede konstruktion. Afhængigt af størrelsen på nåleåbningen varierer injektionsvolumenet fra 1-5 pL. - Injicer alle æggene på rutsjebanen i en vinkel på 10°-15° så hurtigt som muligt, og flyt straks glideren til forhold med høj luftfugtighed i en petriskål foret med fugtigt papir. Så snart æggene injiceres, begynder de at tørre.
BEMÆRK: Injektion af et lille antal æg ad gangen øger injektionssuccesen og overlevelsessandsynligheden. Nåle bliver tilstoppet af embryo refluks. Hvis spidsen stadig er skarp, skal du flytte nålen til en lille dråbe på 1% NaCl tilsat kanten af diaset for at rydde tilstoppede nåle. Kapillærhandlingen løsner den lille træsko. Hvis nålen allerede er stump, skal du ændre den.
6. Pleje af embryoner efter injektion
- Diaset med injicerede embryoner anbringes i en stor petriskål foret med fugtigt filterpapir.
BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at forstyrre æggene i mindst 5-6 timer. Dette gør det muligt for injektionssåret at forsegle ordentligt. Injektionssåret kan åbne sig, når det er ophidset, og cytoplasma kan begynde at sive ud, hvilket resulterer i ægdødelighed. - Efter 5-6 timer tilsættes en lille dråbe DI-vand til den gennemsigtige filmdressing med injicerede embryoner fastgjort. Brug en pensel til forsigtigt at fortrænge æggene. Overfør æggene til en lille petriskål (10 cm) og nedsænk dem i DI-vand.
BEMÆRK: Filmdressingen tillader nem fjernelse af æg efter injektioner. I det øjeblik der tilsættes en vanddråbe til filmdressingen, begynder æggene at bevæge sig sammen med vandet. - Hold æggene nedsænket i vand og læg petriskålen i en 6-liters plastkasse i en inkubator ved 27 ° C og > 90% RH.
- Kontroller æggene regelmæssigt, dagligt i de første par dage, og derefter hver 3-4 dage, indtil larverne begynder at klække.
BEMÆRK: Hvis et stort antal æg beskadiges under mikroinjektioner, vil forsigtig dræning af DI-vandet efter en uge forhindre svampevækst på de døde æg. - Når larverne begynder at klække fra de injicerede embryoner (21-25 dage efter injektion til den nuværende laboratorieopsætning), skal du kontrollere dem dagligt og overføre eventuelle klækkede larver til glasflasker med en skærm ovenpå. Larver kan klække under vandet og overleve i ~ 1-2 uger.
- Screen larverne4 , hvis æggene blev injiceret med en konstruktion, der kan resultere i en synlig fænotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket embryoinjektionsprotokol for I. scapularis er beskrevet i denne artikel. Æglæggende hunner blev holdt ved høj luftfugtighed for at undgå udtørring af delvist voksede æg. Vokslaget blev fjernet for at injicere flåtembryoner ved at ablere genets organ (vokskirtel) af den gravide kvinde (figur 1A-E). Vi brugte aluminosilikatglasnåle med en kortere hals (figur 2). Denne form var ideel til injektion af flåtæg, da den bedre kunne tåle trykket end den langhalsede (tilspidsede) nål, der blev brugt til insektæginjektioner. Den sfæriske form af flåtæg kræver en glideplatform backstage (figur 3A) for at undgå at rulle ægget af diaset under nåleindsættelse. Den tidlige embryonale udvikling af I. scapularis er ukendt, så tidspunktet og placeringen af kimcelledannelse er også ukendt. Derfor valgte vi at injicere æg tidligt i udviklingen (12-18 timer gamle) og fandt ud af, at justering af æggets længere akse vinkelret på kanten af diaset resulterer i højere overlevelse (figur 3B, C). Ved hjælp af denne protokol blev flere tusinde æg injiceret. Af disse injicerede æg overlevede op til 8,5%, og larver klækkede (tabel 1). Behandlede, men ikke-injicerede æg havde en meget højere overlevelse (op til 70%), hvilket tyder på forbedring af injektioner (enten ved timing, injektionssted eller nål) kan forbedre ægoverlevelsen. Denne protokol blev udviklet til injektion af æg tidligt i embryogenese (12-18 timer gammel); Dette kan dog bruges til æg, der er op til 10 dage gamle med længere behandling med NaCl og benzalkoniumchlorid.
Figur 1: Manipulation af I. scapularis Genés organ. (A) Diagram over Genes organ. Øverst: Gene's organ under scutum. Nederst: Vendekirtel og munddele foldet ned. (B) En fyldt kvinde under mikroskopet sikret med ler. (C) En kvinde bevæger sine munddele på den ventrale overflade under æglægning for at udvide Genes organ. Gule pile viser hvide pletter og kan bruges som reference for Genes organplacering. Disse områder er synlige hos kvinder, der lægger æg i 2-3 uger. (D,E) Gene's organ (en lille boble i D og udvidet i E) er synlig mellem scutum og capitulum. Hornene på Genés orgel strækker sig, når munddelene bøjes nedad (E). Den blå pil viser placeringen for at indsætte en wolframnål for at fjerne kirtlen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sammenligning af formen på glaskanyler. Den midterste bruges til krydsembryoner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ægjustering til injektioner . (A) Opsætning af glasdias, der anvendes til embryoinjektioner. Mikroskopglasglas er fastgjort og efterlader et hul ved hjælp af dobbeltsidet tape, og den gennemsigtige filmdressing placeres på båndet. Æggene er justeret på kanten af diaset. (B) Optimal justering af æg med en lang akse vinkelret på kanten af rutsjebanen. (C) Mindre effektiv justering af æg med den lange akse parallelt med kanten af diasopsætningen. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Konstruktion injiceret | Tid efter æglægning | Antal injicerede æg | Antal larver klækket | Overlevelsesprocent |
| sgRNA + Cas9 | ≤12 timer | 2,396 | 147 | 6.14 |
| Gen 1 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 timer | 3, 135 | 269 | 8.58 |
| Gen 2 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 timer | 2, 460 | 139 | 5.65 |
| Gen 3 | ||||
| Wolbachia | ≥ 24 timer (24-36 timer) | 1, 765 | 72 | 4.08 |
| sgRNA + Cas9 | 48-60 timer | 191 | 5 | 2.62 |
| Gen 2 |
Tabel 1: Vellykket æginjektion og larveklækning i Ixodes scapularis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette er den første protokol, der er udviklet til at injicere tidlige flåtembryoner med succes. Der er opnået en overlevelsesrate på ~4%-8%, hvilket kan sammenlignes med embryoinjektion i andre veletablerede insektmodeller5.
Da dette er den oprindelige protokol, forventes det, at denne protokol vil blive yderligere raffineret og specialiseret til individuelle flåtarter. Især vil injektionstidspunktet variere fra art til art, afhængigt af embryogenese, især tidspunktet for cellularisering. De foreløbige data tyder på, at I. scapularis æg ikke gennemgår hurtig nuklear opdeling i de første 24 timer efter lægning og cellularisering sker et par dage senere (upublicerede data). Vi har allerede brugt denne protokol til plasmidlevering 4, CRISPR-medieret gen knockout4 og levering af bakterier (Wolbachia) (tabel 1). Det forventes, at denne embryoinjektionsprotokol vil give mulighed for at generere transgene flåter og vil gøre gen knockout og knock-in undersøgelser mulige i ethvert laboratorium. Dette vil vise sig værdifuldt for at fremskynde undersøgelser, der udforsker flåtbiologi og kryds-patogen-værtsgrænseflader.
Kritiske trin i protokollen
Det er vigtigt at indsamle æg inden for 24 timer efter lægningen, fordi denne protokol er blevet standardiseret for tidlige embryoner. Hvis æg opsamles efter dette tidspunkt, er der behov for en længere behandling af benzalkoniumchlorid og NaCl, og overlevelsen er lavere hos ældre æg (tabel 1). Korionen hærder over tid, hvilket gør det vanskeligt at udføre kontrolleret udtørring til mikroinjektioner i æg ældre end 24 timer. Det blev bemærket, at injektion af færre æg ad gangen hjælper med overlevelse, fordi de behandlede æg har tendens til at tørre hurtigt, når de fjernes fra 1% NaCl-opløsningen. Hvis æggene tørrer for meget, vil de dø, men de vil briste under mikroinjektion, hvis de ikke udtørres korrekt. Derfor er optimering af den passende udtørringstid nødvendig for forskellige flåtarter eller stammer. Desuden er det afgørende at holde æggene uforstyrret efter mikroinjektioner under forhold med høj luftfugtighed.
Begrænsninger og fremtidige retninger
Når embryonerne er afvokset, har de en tendens til at udtørre hurtigt, så processen med at justere dem på diaset og injicere dem skal udføres hurtigt. Den hurtige forbedring i hastighed og nøjagtighed kan kun opnås gennem konstant praksis og tålmodighed. Vores fremtidige arbejde vil være fokuseret på at forbedre overlevelsesprocenten for embryoner efter injektion og identificere tidspunktet for kimcelledannelse for at sikre arvelige mutationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Channa Aluvihare og Yonus Gebermicale, ITF, UMD, for indsigt og støtte i den indledende fase af protokoludviklingen. Wolfram nåle var en generøs gave fra David O'Brochta, ITF, UMD. Vi er taknemmelige for Dr. Ladislav Simo for at teste denne protokol i I. ricinus og for indsigtsfulde diskussioner. Dette projekt blev finansieret af NIH-NIAID R21AI128393 og Plymouth Hill Foundation, NY til MG-N, opstartsmidler fra University of Nevada til AN, National Science Foundation Grant No. 2019609 til MG-N og AN og et Peer-to-Peer Grant fra IGTRCN til AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
