Summary
Als reactie op de pandemie van het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) werd een laboratoriumprotocol ontwikkeld om de virale desinfectie-werkzaamheid van het wassen van warm water van stoffen gezichtsbedekking, katoenen scrubs en denimbroeken te testen. Het Phi6-virus (bacteriofaag) werd gebruikt als het organisme om de werkzaamheid van desinfectie te testen.
Abstract
Dit protocol geeft een voorbeeld van een laboratoriumproces voor het uitvoeren van witwasstudies die gegevens genereren over virale desinfectie. Hoewel het protocol is ontwikkeld voor onderzoek tijdens de pandemie van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19), is het bedoeld als een kader dat kan worden aangepast aan andere virusdesinfectiestudies; het toont de stappen voor de voorbereiding van het testvirus, het inenten van het testmateriaal, het beoordelen van visuele en integriteitsveranderingen aan de gewassen items als gevolg van het witwasproces en het kwantificeren van de vermindering van de virale lading. Bovendien schetst het protocol de noodzakelijke kwaliteitscontrolemonsters om ervoor te zorgen dat de experimenten niet worden bevooroordeeld door besmetting en metingen / observaties die moeten worden geregistreerd om de materiële integriteit van de persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) items na meerdere witwascycli te volgen. De representatieve resultaten die bij het protocol worden gepresenteerd, gebruiken de Phi6-bacteriofaag die is ingeënt op katoenscrub, denim en katoenen gezichtsbedekkende materialen en geven aan dat het warmwaterwas- en droogproces is bereikt over een vermindering van de virale lading met 3 log (99,9%) voor alle monsters (een reductie van 3 log is de prestatiemaatstaf voor desinfectiemiddel in de Product Performance Test Guideline 810.2200 van het Amerikaanse Environmental Protection Agency). De vermindering van de virale lading was uniform op verschillende locaties op de PBM-items. De resultaten van dit virale desinfectie werkzaamheidstestprotocol moeten de wetenschappelijke gemeenschap helpen de effectiviteit van thuiswassen voor andere soorten testvirussen en witwasprocedures te onderzoeken.
Introduction
De pandemie van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) veroorzaakte een ongekende wereldwijde verstoring van de toeleveringsketen en leidde tot een kritiek tekort aan veel artikelen, waaronder essentiële persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's)1,2,3. Degenen in beroepen met een hoog risico moesten zich aanpassen met behulp van aanbevolen crisiscapaciteitsstrategieën en het publiek nam het gebruik van niet-gespecialiseerde items zoals stoffen gezichtsbedekkingen aan, voornamelijk voor broncontrole, maar ook om enige ademhalingsbescherming voor dragers te bieden. In de Verenigde Staten was gespecialiseerde ademhalingsbescherming (d.w.z. filterende mondkapjes (FFR's) zoals N95's) gereserveerd voor sommige van deze risicovolle beroepen (bijv. Gezondheidszorg) tijdens leveringstekorten4. Toen er weinig bekend was over de overdracht van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-Cov-2), werden een verscheidenheid aan andere soorten kledingmaterialen ook beschouwd als barrièrebescherming in het begin van de pandemie5. Met de diversiteit aan stoffen die worden gebruikt voor de bescherming van de drager, rezen er vragen over het gebruik, hergebruik en desinfectie / decontaminatie van deze items. Terwijl in de Verenigde Staten algemeen werd aangenomen dat het routinematig wassen van gezichtsbedekkingen en andere kledingstukken door thuismachines virussen op die oppervlakken niet-infectieus maakte, bestonden er weinig gegevens om deze claim te valideren en was er een gebrek aan gepubliceerde laboratoriumprotocollen voor testen. Het doel van het hier gepresenteerde onderzoeksprotocol is om een voorbeeld te geven van een laboratoriumproces voor het uitvoeren van witwasstudies die gegevens genereren over virale desinfectie. Hoewel het protocol is ontwikkeld voor onderzoek tijdens de COVID-19-pandemie, is het bedoeld als een raamwerk dat kan worden aangepast aan andere virusdesinfectiestudies.
De rol van kleding bij ziekteoverdracht is een moeilijk te kwantificeren concept. Het International Scientific Forum on Home Hygiene probeerde deze uitdagende taak door een beoordeling uit te voeren van de rol van kleding bij de verspreiding van infectieziekten in combinatie met een risicobeoordeling van thuishygiënepraktijken6. Inbegrepen in dit werk was de beoordeling van verschillende wetenschappelijke studies die de overleving van verschillende virale stammen op verschillende soorten stoffen zoals wol en katoen onderzochten 7,8,9,10,11. Elke studie richtte zich op een ander type virus, waaronder vaccinia, poliovirus, respiratoir syncytieel virus, herpesvirus en influenzavirus. De overlevingstijden van de verschillende virussen op de stoffen varieerden van 30 minuten tot 5 maanden, afhankelijk van de combinatie virus-materiaal. Verschillende van de studies toonden ook de overdracht van virale besmetting van het materiaal op handen aan. Als onderdeel van de publicatie werd effectief witwassen besproken als een belangrijke managementtechniek om de overdracht te verminderen, maar erkend dat de omvang van de impact van witwassen op het verminderen van de ziektelast afhankelijk was van de specifieke virale verontreiniging en moeilijk te kwantificeren 7,8,9,10,11.
Het witwasproces vernietigt micro-organismen met behulp van chemische, fysische en thermische behandelingsprocessen. Zepen en detergentia kunnen bijvoorbeeld bodems scheiden en kunnen een chemisch gemedieerde antimicrobiële werking geven. Fysiek kunnen verdunning en agitatie helpen bij het verminderen van virale ladingen. Een studie die de persistentie van het menselijke coronavirus HCoV-OC43 op katoenen stalen onderzocht met behulp van industriële en huishoudelijke wascycli met en zonder temperatuur en wasmiddel, vond geen detecteerbaar virus bij het wassen in onverwarmd water zonder wasmiddel, maar dat in de aanwezigheid van een bodembelasting (kunstmatig speeksel), huishoudelijke wascycli wasmiddel vereisten voor monsters om niet-gedetecteerde virusbelastingen te hebben12. Warm water zelf kan ook een effectief middel zijn om sommige micro-organismen te vernietigen13,14.
In een recente publicatie waarin de staat van de huidige waspraktijken wordt samengevat, werden veel factoren zoals stofsamenstelling, opslagomstandigheden, vuilbelasting, wastemperatuur en -tijd en droogtemperatuur geïdentificeerd als variërend in wereldwijde witwaspraktijken15. Hoewel witwassen een veelgebruikte reinigingsmethode is voor een groot percentage van de bevolking, maakt deze grote variatie in bestaande praktijken het uitgeven van gedetailleerde richtlijnen voor hoe dit veilig en effectief te doen, wanneer een item besmet kan zijn met een virus, uitdagend en schaars. Tijdens de COVID-19-pandemie hebben de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) van de Verenigde Staten richtlijnen uitgegeven voor het wassen van items voor huiseigenaren16,17. Veel van deze witwasrichtlijnen waren gebaseerd op verschillende oudere studies naar bacteriële desinfectie18,19 en ondersteund door verschillende benchtop-studies die omhulde virussen hebben gevonden die zijn geïnactiveerd in water met detergentia20,21. De richtlijnen kunnen worden samengevat als 1) volg de instructies van de fabrikant voor het wasmiddel, 2) gebruik de warmste geschikte waterinstelling en 3) droog items volledig. De redenering van deze aanbevelingen was dat wassen op de warmst mogelijke cyclus met wasmiddel in combinatie met volledig drogen (indien mogelijk met warmte) het SARS-CoV-2-virus zal doden.
Het enorme aantal mogelijke variaties in het witwasproces vereist een uniform protocol, zoals hier gepresenteerd, om variabelen te kunnen isoleren en de virale desinfectie-werkzaamheid van specifieke processen te kunnen testen. De bedoeling van dit protocol in combinatie met een instructievideo is om een laboratoriumgebaseerd warmwaterwasproces te demonstreren voor replicatie in andere onderzoeken. Bovendien moeten de resultaten van deze virale desinfectie-werkzaamheidstests het vertrouwen van de consument in de effectiviteit van thuiswassen tijdens virale pandemieën vergroten.
Protocol
Phi6 werd ontvangen van een samenwerkend laboratorium als een ~ 1 ml bevroren aliquot en werd bewaard bij -80 ° C tot gebruik. Het werd aanvankelijk gebruikt om meer virusvoorraden te verspreiden die vervolgens tot gebruik bij -80 °C werden opgeslagen. Phi6 werd geselecteerd als het demonstratievirus omdat het vaak wordt gebruikt als een modelomhuld virus, kan worden verspreid naar hoge titers en een laboratorium met een laag bioveiligheidsniveau vereist om de tests uit te voeren 22,23,24.
1. Bereid virusvoorraadoplossing voor
- Vermeerder bacteriofaag Phi6 in bacteriële gastheer Pseudomonas syringae met behulp van een gemodificeerd Tryptic Soy Agar mediapreparaat en zachte agar-overlaymethode zoals hieronder beschreven.
- Bereid gemodificeerde Tryptic Soy Agar door de ingrediënten uit tabel 1 te wegen en te mengen in gedeïoniseerd water.
- Bereid een nachtcultuur van P. syringae door een 1 ml aliquot P. syringae toe te voegen met een optische dichtheid (OD600) tussen 0,9 en 1,5, tot 100 ml gemodificeerde Tryptische sojabouillon (tabel 1) en broed in een schudincubator bij ~ 260 tpm bij kamertemperatuur (20-26 °C).
- Bereid zachte agarbuizen voor door gemodificeerde Tryptic Soy Agar (~ 6 ml) in reageerbuizen te plaatsen en af te dekken met een autoclaveerbare dop. Bewaren bij 4 °C tot gebruik. Autoclaaf zachte agarbuizen bij 121 °C gedurende 15 minuten om agar te smelten. Houd op 48 °C tot het plateren. Equilibratie bij 48 °C is belangrijk, anders kan het virus in de test worden geïnactiveerd.
- Voeg 1 ml onverdunde geconcentreerde virusaliquot toe aan zachte agar en 100 μL van een logfase (OD600 tussen 0,9 en 1,5) P. syringae-cultuur . Giet zachte agar op het oppervlak van een gestolde 100 mm diameter gemodificeerde Tryptic Soy agar plaat. Om bellen en/of morsen te voorkomen, draait u de platen voorzichtig om de zachte agar gelijkmatig over het vaste agaroppervlak te verdelen en 's nachts bij kamertemperatuur te incuberen.
- Schraapvoorzichtig 25 de inhoud van de drie platen met een steriele celverspreider in een steriele conische buis van 50 ml met 15 ml SM-buffer. Vortexbuizen op maximale instelling gedurende 1-2 minuten om agar te breken en vervolgens gedurende 15 minuten bij 7.000 x g te centrifugeren.
- Verwijder supernatant en filtreer door een spuitfilter van 0,2 μm. Bewaar 1 ml aliquots in cryovialen bij -80 °C tot gebruik.
2. Voer een visuele beoordeling vooraf uit van het PBM-item
- Plaats elk PBM-item op een schoon, glad oppervlak (bijvoorbeeld een laboratoriumbank bedekt met een papieren wegwerpfolie). Beoordeel elk PBM-item in drievoud.
- Zorg voor de juiste verlichting tijdens het PBM-onderzoek. Meet en noteer de lengte en breedte van de ongewassen items op verschillende locaties (figuur 1).
Figuur 1. Meetlocaties voor pbm-pretestbeoordeling. Denim-, scrub- en gezichtsbedekkende locaties waar de lengte werd geregistreerd voor het volgen van materiële wijzigingen van het witwasproces. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Bereid coupons voor
- Maak testcoupons van 2 cm x 4 cm door PBM's te snijden, bereid twee coupons per gezichtsbedekking voor (drie gezichtsbedekkingen werden getest), vijf coupons per denimbroek (drie denimbroeken werden getest) en drie coupons per scrubshirt (drie scrubs werden getest).
- Bereid een set van 2 cm x 4 cm procedurele blanco coupons voor (een set voor één pbm-item op ware grootte) voor elk materiaaltype dat niet wordt ingeënt maar wordt gewassen. Bereid twee coupons voor elke dag van gezichtsbedekkende experimenten, vijf coupons voor elke dag van denimexperimenten en drie coupons voor elke dag van scrub-experimenten.
- Bereid een set van 2 cm x 4 cm positieve controlebonnen voor die worden ingeënt, maar niet worden gewassen. Bereid twee coupons voor elke dag van gezichtsbedekkende experimenten voor (drie gezichtsbedekkingen werden getest), vijf coupons voor elke dag van denimexperimenten (drie denimbroeken werden getest) en drie coupons voor elke dag scrub-experimenten (drie scrubs werden getest) en drie roestvrijstalen coupons.
OPMERKING: Er zijn verschillende aantallen replicaties geselecteerd op basis van de grootte van het item. Het is bijvoorbeeld fysiek moeilijk om vijf coupons op de gezichtsbedekking te plakken en twee coupons zouden een beperkt deel van de denimbroek vertegenwoordigen. De locaties werden geselecteerd om de dekking te maximaliseren en in zones die tijdens het wassen kunnen worden gevouwen en moeilijker schoon te maken zijn.
4. Voer inenting uit
- Bereid een 10% rundvleesextractoplossing door 1 g rundvleesextract op te lossen in een totaal volume van 10 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing. Filter steriliseer het gehele volume met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm.
- Ontdooi de in rubriek 1 bereide virusvoorraadoplossing bij kamertemperatuur. Voeg op de dag van gebruik 100 μL van de ontdooide Phi6-bouillon toe aan 900 μL van de 10% rundvleesextractoplossing.
- Ent testcoupons en positieve controlebonnen met ~107 PFU/monster door een druppeltje van 10 μL oplossing op het PBM-item te pipetteren en de druppel te verspreiden met de punt van de pipet. Afhankelijk van het PBM-materiaal zullen de druppels scheiden en opnieuw aggregeren.
- Laat ingeënte coupons drogen in een bioveiligheidskast. Bepaald droogtijd(en) via observatie voor uw specifieke materialen. Voor de hier gepresenteerde resultaten werden de volgende tijden gebruikt: scrubs = 30 min droogtijd; gezichtsbedekking = 60 minuten droogtijd; denim = 30 min droogtijd; roestvrij staal = 120 min droogtijd.
- Bevestig ingeënte coupons aan pbm-artikelen op ware grootte volgens figuur 2 met behulp van veiligheidsspelden en aseptische technieken.
Figuur 2. Test couponlocaties op denim, scrubs en gezichtsbedekking. Letters A-D komt overeen met de unieke coupon-id's voor alle witwasexperimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Witwassen uitvoeren
- Bereid wasmiddel als volgt voor.
- Steriliseer kraanwater dat in de wasmachine wordt gebruikt en verzamel 10 ml geautoclaveerd water voor een steriliteitscontrole. Voor dit protocol autoclaaf 7 L kraanwater op een vloeistofcyclus van 60 minuten.
- Bereid de wasoplossing volgens de verdunningsinstructies van de fabrikant. Los voor dit protocol 1,54 ml wasmiddel op in 3,5 l steriel kraanwater. Verwarm de wasoplossing tot 50 °C met behulp van een hete plaat en roerstaaf. Meet en noteer de pH en temperatuur van de wasoplossing. Verzamel 10 ml oplossing voor steriliteitscontrole.
- Giet de wasoplossing in een gesteriliseerde wasmachine (3,25 l). Pre-steriliseer wasmachines met behulp van een 250 ppm-4 h cyclus van dampend waterstofperoxide tussen de tests.
- Plaats PBM-item(s) in een gesteriliseerde wasmachine. Voeg een denim broek en een scrub shirt per wasmachine toe. Voeg één ingeënte gezichtsbedekking en vier niet-besmette vulmaskers per wasmachine toe; vulmaskers hadden geen coupons bevestigd.
- Was PBM-items gedurende 18 minuten (twee wascycli van 9 minuten met normaal roeren). Giet de wasmachine af en spoel driemaal af met kraanwater op kamertemperatuur (telkens 5 L) om schuim te verwijderen. Voeg gesteriliseerd kraanwater op kamertemperatuur toe aan de wasmachine (3,25 l) en voer een 9 minuten lange spoelcyclus uit.
- Verplaats de PBM-item(s) in de centrifugezijde van de wasmachine en draai gedurende 5 minuten. Verplaats de PBM's naar de droger en droog gedurende 80 minuten op de hoge warmtestand (93 °C).
- Verplaats PBM's van droger naar steriele werkruimte en verwijder aseptisch de coupons van elk item en plaats ze in conische buizen. Vul de buizen voor met 10 ml 10% Dey-Engley bouillon extractiebuffer en dek af met aluminiumfolie.
6. Extraheer en som virale ladingen op coupons op
- Extraheer coupons in 10 ml van 10% Dey-Engley neutraliserende bouillon door gedurende 2 minuten te vortexen op de maximale instelling van uw apparatuur.
- Plaatextracten met behulp van een conventionele softtop agar overlay methode26.
- Bereid tubes zachte gemodificeerde Tryptic Soy Agar en een P. syringae-cultuur zoals beschreven in rubriek 1. Autoclaaf op de testdag de zachte agarbuizen bij 121 °C gedurende 15 minuten om de agar te smelten. Houd de zachte agar op 48 °C tot het plateren. Equilibratie bij 48 °C is belangrijk, anders kan het virus thermisch worden geïnactiveerd in de test.
- Bereid een tienvoudige verdunningsreeks in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing voor elk testmonster dat in het witwasonderzoek wordt gebruikt. Gebruik zowel serieel verdunde (100 μL) als onverdunde (1 ml en 100 μL) aliquots voor plating.
- Voeg aliquots van het testmonster toe aan de zachte agarbuis met 6 ml zachte agar en 100 μL van de logfase P. syringae-cultuur (OD600 tussen 0,9-1,5). Giet de zachte agar op het oppervlak van een gestolde gemodificeerde Tryptic Soy agar plaat. Verdeel de zachte agar gelijkmatig over het massieve agaroppervlak door de plaat te draaien.
- Incubeer platen 's nachts bij kamertemperatuur en inventariseer de volgende dag handmatig door de plaquevormende eenheden op elke plaat te tellen.
7. Voer een visuele beoordeling na de test uit van pbm's
- Documenteer het volgende in de verschillende PBM-items die voor het testen worden gebruikt: tekenen van vervaging, verkleuring en / of schade (bijv. scheuren, uitrekken); Geuren; kleine gaten, snijwonden of scheuren (gebruik een kleine zaklamp om naar schade te zoeken); scheiding van lagen, ontbrekende draden, gebieden waar de binding is beschadigd; schade aan naden of ritsen; meet en registreer het uitrekken van elastiek.
Representative Results
Verschillende soorten kwaliteitscontrolegegevens en -resultaten worden gegenereerd na voltooiing van dit protocol. Plaque forming unit (PFU) plaattellingen samen met het geëxtraheerde monstervolume maken de berekening van het aantal PFU per testcoupon mogelijk. Tabel 2 is een voorbeeld van een gegevensregistratieblad voor seriële verdunnings-/platingresultaten. Met behulp van de verdunningsfactor, het monstervolume en het aantal platen uit tabel 1 toont tabel 3 representatieve virale herstelresultaten voor een gezichtsbedekkende test. Merk op dat deze gegevens de testcoupons en de kwaliteitscontrolemonsters voor het entmateriaal, coupons en waswater (met en zonder wasmiddel) omvatten. De procedurele blanco- en steriliteitskwaliteitscontrolemonsters zijn belangrijk om te bevestigen dat de wateroplossingen en PBM-materialen niet besmet waren met Phi6. Indicatie van besmetting zou leiden tot onjuiste berekeningen van de werkzaamheid van de desinfectie en zou een herhaling van de test vereisen. De positieve controlemonsters zijn bedoeld om na te gaan of de virusvoorraadoplossing tijdens de experimenten niet ecologisch/natuurlijk is afgebroken, waardoor het effect van het witwasproces op de vermindering van de virale lading wordt opgeblazen. Deze monsters moeten binnen 1 log PFU van de entmateriaalcontroles blijven om de resultaten van de testcoupon te accepteren. Een grote vermindering van de PFU van de positieve controlemonsters geeft ook aan dat alle stappen van de couponinenting zorgvuldig moeten worden beoordeeld om ervoor te zorgen dat de analist het protocol uitvoert met de juiste pipetteer- en verspreidingstechnieken.
Dit protocol bevat ook informatie voor het beoordelen van wijzigingen in de materiaaleigenschappen van kledingstukken als gevolg van witwassen en informatie over kwaliteitscontrole met betrekking tot het protocol (tabel 4 en figuur 3). Deze gegevens zijn om verschillende redenen nuttig. Het vastleggen van de trends in metingen van de PBM-artikelen maakt het mogelijk om een artikel met een fabricagefout te identificeren. Deze identificatie kan helpen om uitschieters microbiële gegevens te verklaren en de variatie in productgedrag te contextualiseren. Het noteren van geuren of schade kan ook een indicatie geven of de wasmachine of droger tijdens een experiment suboptimaal werkte en of de tests moeten worden herhaald of de apparatuur moet worden onderhouden. Bovendien, als het testplan meerdere witwascycli van hetzelfde PBM-item vereist, kunnen de gegevens helpen bepalen hoe lang de PBM-items hun integriteit behouden voor gebruik bij het witwassen. Het bijhouden van de pH van de detergentoplossing waarschuwt voor veranderingen in de waterbron of het wasmiddelproduct. Het bijhouden van een tijdlogboek van de wasstappen zorgt ervoor dat de timer op de wasmachine en droger geen variaties op het experimentele protocol veroorzaakt.
Uiteindelijk worden deze gegevens gebruikt om de desinfectie-effectiviteit van de warmwaterwasprocedure tegen een surrogaat voor virale pathogenen te rapporteren. De desinfectie-efficiëntie van het witwassen (Eqn. 1) wordt berekend door de gemiddelde log10-virusherstel van pbm-testcoupon af te trekken van de gemiddelde log10-virusherstelresultaten van PBM-positieve controleresultaten (figuur 4). Voor testcouponresultaten die niet worden gedetecteerd, wordt log10 van de detectielimiet gebruikt in de berekening van de desinfectie-efficiëntie. Het is gebruikelijk om de werkzaamheid van desinfectie te rapporteren als logwaarden voor vergelijking met andere virale desinfectietechnieken en -normen.
Desinfectie-efficiëntie = gemiddelde log10 (positieve controles) - Gemiddelde log10 (testcoupons) (Eqn. 1)
Figuur 3. Verandering in PBM-afmetingen per locatie. Δ = Pre-test meting - post-test meting. Een negatieve Δ-waarde komt overeen met het uitrekken van het artikel op de opgegeven locatie en een positieve waarde komt overeen met krimp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Effectiviteit van het wassen van warm water bij het desinfecteren van gezichtsbedekking, denim en scrub PBM-materialen van Phi6. Sterren geven aan dat volledige desinfectie heeft plaatsgevonden (niet-detecteert op de testcoupons). Foutbalken geven de standaarddeviatie aan (n = 3). Locatieletters komen overeen met de plaatsing in figuur 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Oplossingsrecepten. Ingrediënten en hoeveelheden die nodig zijn om tryptische soja-agar, tryptische sojabouillon en rundvleesextractoplossingen te bereiden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2. Een voorbeeldgedeelte van een resultatenblad voor seriële verdunning/beplating. Sjabloon voor het rapporteren van ruwe microbiële gegevens. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3. Gezichtsbedekkende microbiële resultaten. Voorbeeldoverzichtsblad voor gegevens van verwerkte plaquevormende eenheden (PFU). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4. Schrobt kwaliteitscontrole en materiaalbeoordelingslogboek. Sjabloon voor het rapporteren van kalibratie van pH-sonde, pH van wasmiddeloplossing, metingen voor en na het wassen en wascyclustijden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Dit protocol is ontwikkeld om systematische laboratoriumtests uit te voeren om de witwaseffectiviteit van virale desinfectie van full-size PBM's / kledingstukken te beoordelen. De procedures beschrijven de kritieke stappen voor het voorbereiden van het virus, het inenten van het testmateriaal, het beoordelen van de wijzigingen in de items als gevolg van het witwasproces en het kwantificeren van de vermindering van de virale lading als gevolg van het wassen (machinaal wassen en drogen) proces. Bovendien schetst het protocol de benodigde kwaliteitscontrolemonsters om ervoor te zorgen dat de experimenten niet worden bevooroordeeld door verontreiniging en metingen / observaties die moeten worden geregistreerd om de materiële integriteit van de PBM-items na meerdere witwascycli te volgen. De resultaten met Phi6 geven aan dat het warmwaterwasproces dat in dit protocol wordt gebruikt, een vermindering van meer dan 3 log in virale lading voor alle monsters (gezichtsbedekking, scrubs en denimbroeken) heeft bereikt. De vermindering van de virale lading was ook uniform op verschillende locaties op de PBM/kledingstukken. Om 3-log reductie aan te tonen, vereist dit protocol het gebruik van een hoge virale lading en een stabilisatiemiddel (rundvleesextract) dat mogelijk niet representatief is voor de bodembelasting voor alle situaties.
Miniwassers en compacte drogers werden geselecteerd om het aantal replicatie-experimenten te optimaliseren dat kon worden uitgevoerd in een ruimtebeperkte omgeving en om de sterilisatie van apparatuur en watervolume die tijdens de experimenten werden gebruikt, beheersbaar te houden voor laboratoriumpersoneel. Als gevolg van het gebruik van de miniwasser waren de spoelstappen handmatig in vergelijking met de meeste thuiswastoepassingen die volledig geautomatiseerd zijn. Het is ook belangrijk om te onthouden dat machinaal wassen overheerst in ontwikkelde landen, maar handen wassen wordt nog steeds over de hele wereld beoefend15. Bovendien hebben sommigen mogelijk geen toegang tot warm water om te wassen, en anderen drogen kleding handmatig aan de lucht in plaats van machinaal te drogen. Deze verschillen in witwaspraktijken werden niet behandeld in dit huidige protocol, maar konden gemakkelijk worden onderzocht met kleine aanpassingen, zoals het vervangen van de was- en droogstappen door het gebruik van een emmer en een nauwe lijn.
In de wetenschappelijke literatuur is op ware grootte minimaal aandacht geweest voor het reinigen/desinfecteren van viraal besmette gezichtsbedekking en straatkleding. Vaker beoordelen studies de filtratieprestaties van gezichtsbedekkingen na herhaald wassen en drogen, maar evalueren ze niet de werkzaamheid van virale desinfectie27,28. Clapp et al. evalueerden bijvoorbeeld de filtratie-efficiëntie van stoffen maskers en aangepaste proceduremaskers en vonden een grote variatie in prestaties, met eenvoudige aanpassingen die een verhoogde pasvorm en filtratie-efficiëntie bieden29. Een andere studie keek naar de filtratie-efficiëntie van vier stoffen maskers van verschillende materialen30, opnieuw gericht op broncontrole of persoonlijke bescherming. Dit kan te wijten zijn aan een gebrek aan specialisatie voor zowel het microbiële gedeelte als mechanische tests in hetzelfde laboratorium. Het hier gepresenteerde protocol biedt een evaluatie van de werkzaamheid van desinfectie en de degradatie van het materiaal.
Er zijn een aantal decontaminatie-/desinfectiemethoden voor wegwerpluchtwegbescherming (voornamelijk N95's) onlangs gepubliceerd in de wetenschappelijke literatuur 31,32,33. De primaire focus op FFR's (bijv. N95's) is te wijten aan de kritieke ademhalingsbescherming die ze bieden aan gezondheidswerkers en andere eerstelijnsberoepen. Primaire technologieën voor decontaminatie van het gasmasker omvatten verdampte waterstofperoxide (VHP), ultraviolette kiemdodende straling (UVGI) en vochtige warmte (stoom) voor virusinactivatie. Viscusi et al. evalueerden vijf decontaminatiemethoden voor FFR's en UVGI; ethyleenoxide en VHP bleken de meest veelbelovende decontaminatiemethoden te zijn31. Fischer et al. evalueerden vier verschillende decontaminatiemethoden - UV-licht, droge warmte, 70% ethanol en VHP - op hun vermogen om verontreiniging met SARS-CoV-2 te verminderen en hun effect op de N95-ademhalingsfunctie32. Er zijn veel aanvullende studies over effectieve decontaminatietechnologieën voor FFR's die zijn samengevat en gepubliceerd in 202033. Deze gespecialiseerde methoden zijn echter niet toegankelijk of ontworpen om veilig te worden gebruikt door de gemiddelde huis- of kleine bedrijfseigenaar.
Dit protocol is ontwikkeld met behulp van Phi6, een omhulde bacteriofaag die vergelijkbaar is met SARS-CoV-2, spike-eiwitten heeft en van vergelijkbare grootte is (80-100 nm) 34, voor alle tests. Omdat Phi6 geen bekende ziekteverwekker is, kan het worden gemanipuleerd in een algemeen microbiologisch Biosafety Level 1 (BSL-1) laboratorium. Werkzaamheid tegen Phi6 kan wijzen op de werkzaamheid van andere omhulde virussen, maar empirische verificatie voor elk virus van belang is noodzakelijk35. Door een vergelijkbaar, niet-pathogeen viraal middel te gebruiken, wordt gehoopt dat dit protocol elders kan worden herhaald en kan worden gebruikt voor het bestuderen van toekomstige virale epidemieën / pandemieën. Toekomstig onderzoek kan het gebruik van desinfectiemiddelen (bijv. Bleekmiddel) omvatten naast reinigingsmiddelen en een gestandaardiseerd protocol voor handen wassen en lijndrogen.
Disclosures
Er zijn geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA) heeft via zijn Office of Research and Development het hierin beschreven onderzoek onder EP-C-15-008 met Jacobs Technology Inc. geleid. Het is door het Agentschap beoordeeld, maar weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten van het Agentschap. Er mag geen officiële goedkeuring worden afgeleid. EPA onderschrijft de aankoop of verkoop van commerciële producten of diensten niet. De auteurs willen EPA-contractanten Denise Aslett bedanken voor het toezicht op de EPA RTP-microbiologie, Brian Ford, Rachael Baartmans en Lesley Mendez Sandoval voor hun werk aan dit project in het EPA RTP-microbiologielaboratorium, Ramona Sherman voor het verstrekken van de EPA-kwaliteitsborgingsbeoordeling en Worth Calfee en Shannon Serre voor het verstrekken van EPA-technische beoordelingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freezer (- 80 °C) | ThermoFisher Scientific | FDE30086FA | |
| Hot Plate | VWR | 97042-714 | |
| Safety Pins (steel) | Singer | 319921 | |
| Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3525 | |
| SM buffer | Teknova, Hollister, CA | S0249 | |
| Syringe filter (0.2 μm) | Corning, Corning, NY | PES syringe filters, 431229 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Teknova, Hollister, CA | P0196, 10X PBS solution | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Autoclavable caps | DWK Life Sciences, Millville, NJ | KIM-KAP Caps, 73663-18 | |
| Autoclave | Steris | AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS | |
| Beef Extract | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA | P/N B4888-100g | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| Cell spreaders | Busse Hospital Disposables | 23600894 | |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004271 | Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge |
| Certified Timer | https://nist.time.gov/ | Not Applicable | |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Life Sciences | 352098 | Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AY509X33 | |
| Denim | Wrangler | Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW | |
| Detergent | Proctor and Gamble | Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068 | |
| Dextrose | Fisher | BP350 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Becton Dickinson | DF0819172 | |
| Dryer | Magic Chef | MCSDRY15W | |
| Face Coverings | Felina | Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4 | |
| Incubator (top agar) | Symphony | 414004-596 | |
| Laboratory Notebook | Scientific Notebook Company | 2001 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Media sterilization and dispensing system | Integra | Media Clave/Media Jet | |
| Petri Dishes (100 mm) | VWR | 25384-342 | |
| pH Meter | Orion/Oakton | STARA1110/EW-35634-35 | |
| pH Probe | Orion | 8157BNUMD | |
| pH Standards | Oakton | 00654-(00/04/08) | |
| Phi 6 and Pseudomonas syringae | Battelle Memorial Institute, Columbus, OH | Not Applicable | |
| Pipette & Tips | Rainin | (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382 | |
| Refrigerator | True Manufacturing Co., Inc. | GDM-33 | |
| Scrubs | Gogreen cool | PN: WS19100PT | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 57656 | |
| Stir Bar | Fisherbrand | 16-800-512 | |
| Tape Measure | Lufkin | PS3425 | |
| Test Tubes for Soft agar (14 mL) | Corning, Corning, NY | 352059 | |
| Thermometer | Fisherbrand | 14-983-19B | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T9410 | |
| Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags | STERIS | 62020TW | |
| Vortex (during the plating process) | Daigger Scientific, Inc | 3030A | Vortex Genie 2 |
| Vortex (for sample extraction) | Branson Ultrasonics | 58816-115 | Multi-Tube vortexer |
| Washer | Kuppet | KP1040600A | |
| Washer Sterilization | Steris | STERIS VHP ED1000 generator | |
| Yeast extract | Gibco | 212750 |
References
- Emanuel, E. J., et al. Fair allocation of scarce medical resources in the time of Covid-19. The New England Journal of Medicine. 382 (21), 2049-2055 (2020).
- Cohen, J., van der Meulen Rodgers, Y. Contributing factors to personal protective equipment shortages during the COVID-19 pandemic. Preventive Medicine. 141, 106263 (2020).
- Burki, T. Global shortage of personal protective equipment. The Lancet Infectious Diseases. 20 (7), 785-786 (2020).
- Optimizing Personal Protective Equipment (PPE) Supplies. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/ppe-strategy/index.html (2020).
- Livingston, E., Desai, A., Berkwits, M. Sourcing personal protective equipment during the COVID-19 pandemic. Jama. 323 (19), 1912-1914 (2020).
- Bloomfield, S. F., Exner, M., Signorelli, C., Nath, K. J., Scott, E. A. The infection risks associated with clothing and household linens in home and everyday life settings, and the role of laundry. International Scientific Forum on Home Hygiene. , (2011).
- Hall, C. B., Douglas, R. G., Geiman, J. M. Possible transmission by fomites of respiratory syncytial virus. Journal of Infectious Diseases. 141 (1), 98-102 (1980).
- Turner, R., Shehab, Z., Osborne, K., Hendley, J. O. Shedding and survival of herpes simplex virus from 'fever blisters'. Pediatrics. 70 (4), 547-549 (1982).
- Bean, B., et al. Survival of influenza viruses on environmental surfaces. Journal of Infectious Diseases. 146 (1), 47-51 (1982).
- Brady, M. T., Evans, J., Cuartas, J. Survival and disinfection of parainfluenza viruses on environmental surfaces. American Journal of Infection Control. 18 (1), 18-23 (1990).
- Sidwell, R. W., Dixon, G. J., Mcneil, E. Quantitative studies on fabrics as disseminators of viruses: I. Persistence of vaccinia virus on cotton and wool fabrics. Applied Microbiology. 14 (1), 55-59 (1966).
- Owen, L., Shivkumar, M., Laird, K. The stability of model human coronaviruses on textiles in the environment and during health care laundering. Msphere. 6 (2), 00316-00321 (2021).
- Sehulster, L., et al. Guidelines for environmental infection control in health-care facilities. Recommendations from CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (HICPAC). American Society for Healthcare Engineering/American Hospital Association. , (2004).
- Chen, H., et al. Influence of different inactivation methods on severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA copy number. Journal of Clinical Microbiology. 58 (8), e00958 (2020).
- Abney, S. E., Ijaz, M. K., McKinney, J., Gerba, C. P. Laundry hygiene and odor control-state of the science. Applied and Environmental Microbiology. 87 (14), 0300220 (2021).
- COVID-19 Cleaning and Disinfecting Your Home. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/disinfecting-you-home.html (2021).
- COVID-19 Your Guide to Masks - How to select, properly wear, clean, and store masks. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/about-face-coverings.html (2021).
- Walter, W. G., Schillinger, J. E.
- Blaser, M. J., Smith, P. F., Cody, H. J., Wang, W. -L. L., LaForce, F. M. Killing of fabric-associated bacteria in hospital laundry by low-temperature washing. Journal of Infectious Diseases. 149 (1), 48-57 (1984).
- Gerhardts, A., et al. Testing of the adhesion of herpes simplex virus on textile substrates and its inactivation by household laundry processes. Journal of Biosciences and Medicines. 4 (12), 111 (2016).
- Heinzel, M., Kyas, A., Weide, M., Breves, R., Bockmühl, D. P. Evaluation of the virucidal performance of domestic laundry procedures. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 213 (5), 334-337 (2010).
- Casanova, L. M., Weaver, S. R. Inactivation of an enveloped surrogate virus in human sewage. Environmental Science & Technology Letters. 2 (3), 76-78 (2015).
- Aquino de Carvalho, N., Stachler, E. N., Cimabue, N., Bibby, K. Evaluation of Phi6 persistence and suitability as an enveloped virus surrogate. Environmental Science & Technology. 51 (15), 8692-8700 (2017).
- Ye, Y., Chang, P. H., Hartert, J., Wigginton, K. R. Reactivity of enveloped virus genome, proteins, and lipids with free chlorine and UV254. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7698-7708 (2018).
- Bacteriology Culture Guide. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/resources/culture-guides/bacteriology-culture-guide (2022).
- Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Bacteriophages. , Springer. 69-76 (2009).
- Sankhyan, S., et al. Filtration performance of layering masks and face coverings and the reusability of cotton masks after repeated washing and drying. Aerosol and Air Quality Research. 21 (11), 210117 (2021).
- Kumar, A., Bhattacharjee, B., Sangeetha, D., Subramanian, V., Venkatraman, B. Evaluation of filtration effectiveness of various types of facemasks following with different sterilization methods. Journal of Industrial Textiles. , (2021).
- Clapp, P. W., et al. Evaluation of cloth masks and modified procedure masks as personal protective equipment for the public during the COVID-19 pandemic. JAMA Internal Medicine. 181 (4), 463-469 (2021).
- Lu, H., Yao, D., Yip, J., Kan, C. -W., Guo, H. Addressing COVID-19 spread: development of reliable testing system for mask reuse. Aerosol and air quality research. 20 (11), 2309-2317 (2020).
- Viscusi, D. J., Bergman, M. S., Eimer, B. C., Shaffer, R. E. Evaluation of five decontamination methods for filtering facepiece respirators. Annals of Occupational Hygiene. 53 (8), 815-827 (2009).
- Fischer, R. J., et al. Effectiveness of N95 respirator decontamination and reuse against SARS-CoV-2 virus. Emerging Infectious Diseases. 26 (9), 2253 (2020).
- Derraik, J. G., Anderson, W. A., Connelly, E. A., Anderson, Y. C. Rapid review of SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 viability, susceptibility to treatment, and the disinfection and reuse of PPE, particularly filtering facepiece respirators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (17), 6117 (2020).
- Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T., Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva microdroplets deposited on glass surfaces. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Calfee, M. W., et al. Virucidal efficacy of antimicrobial surface coatings against the enveloped bacteriophage Φ6. Journal of Applied Microbiology. 132 (3), 1813-1824 (2022).
