Summary
En respuesta a la pandemia del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), se desarrolló un protocolo de laboratorio para probar la eficacia de la desinfección viral del lavado con agua caliente de cubiertas faciales de tela, exfoliantes de algodón y pantalones de mezclilla. El virus Phi6 (bacteriófago) se utilizó como organismo para probar la eficacia de la desinfección.
Abstract
Este protocolo proporciona un ejemplo de un proceso de laboratorio para realizar estudios de lavado que generan datos sobre la desinfección viral. Si bien el protocolo se desarrolló para la investigación durante la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), pretende ser un marco, adaptable a otros estudios de desinfección de virus; Demuestra los pasos para preparar el virus de prueba, inocular el material de prueba, evaluar los cambios visuales y de integridad en los artículos lavados debido al proceso de lavado y cuantificar la reducción de la carga viral. Además, el protocolo describe las muestras de control de calidad necesarias para garantizar que los experimentos no estén sesgados por la contaminación y las mediciones / observaciones que deben registrarse para rastrear la integridad material de los artículos del equipo de protección personal (EPP) después de múltiples ciclos de lavado. Los resultados representativos presentados con el protocolo utilizan el bacteriófago Phi6 inoculado en matorrales de algodón, mezclilla y materiales de cobertura facial de algodón e indican que el proceso de lavado y secado con agua caliente logró una reducción de 3 logaritmos (99.9%) en la carga viral para todas las muestras (una reducción de 3 log es la métrica de rendimiento del desinfectante en la Directriz de prueba de rendimiento del producto 810.2200 de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos). La reducción de la carga viral fue uniforme en diferentes ubicaciones en los artículos de EPP. Los resultados de este protocolo de prueba de eficacia de desinfección viral deberían ayudar a la comunidad científica a explorar la efectividad del lavado doméstico para otros tipos de virus de prueba y procedimientos de lavado.
Introduction
La pandemia de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) causó una interrupción sin precedentes de la cadena de suministro mundial y provocó una escasez crítica de muchos artículos, incluidos los equipos esenciales de protección personal (EPP)1,2,3. Aquellos en ocupaciones de alto riesgo tuvieron que adaptarse utilizando las estrategias recomendadas de capacidad de crisis y el público adoptó el uso de artículos no especializados, como cubiertas faciales de material de tela, principalmente para el control de la fuente, pero también para proporcionar cierta protección respiratoria a los usuarios. En los Estados Unidos, la protección respiratoria especializada (es decir, respiradores con máscara filtrante (FFR) como los N95) se reservó para algunas de estas ocupaciones de alto riesgo (por ejemplo, atención médica) durante la escasez de suministros4. Cuando se sabía poco sobre la transmisión del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-Cov-2), una variedad de otros tipos de materiales de ropa también se consideraron como protección de barrera al principio de la pandemia5. Con la diversidad de telas que se utilizan para la protección del usuario, surgieron preguntas sobre el uso, la reutilización y la desinfección / descontaminación de estos artículos. Si bien en los Estados Unidos se aceptaba en general que el lavado rutinario de cubiertas faciales y otras prendas de vestir en máquinas domésticas hacía que los virus en esas superficies no fueran infecciosos, existían pocos datos para validar esta afirmación, y había una falta de protocolos de laboratorio publicados para las pruebas. El propósito del protocolo de investigación presentado aquí es proporcionar un ejemplo de un proceso de laboratorio para realizar estudios de lavado que generen datos sobre desinfección viral. Si bien el protocolo se desarrolló para la investigación durante la pandemia de COVID-19, está destinado a ser un marco adaptable a otros estudios de desinfección de virus.
El papel de la ropa en la transmisión de enfermedades es un concepto difícil de cuantificar. El Foro Científico Internacional sobre Higiene en el Hogar intentó esta difícil tarea mediante la realización de una revisión del papel de la ropa en la propagación de enfermedades infecciosas junto con una evaluación de riesgos de las prácticas de higiene en el hogar6. En este trabajo se incluyó la revisión de varios estudios científicos que examinaron la supervivencia de diferentes cepas virales en diferentes tipos de tejidos como la lana y el algodón 7,8,9,10,11. Cada estudio se centró en un tipo diferente de virus, incluida la vacunación, el poliovirus, el virus sincitial respiratorio, el herpesvirus y el virus de la influenza. Los tiempos de supervivencia de los diferentes virus en los tejidos variaron de 30 min a 5 meses dependiendo de la combinación virus-material. Varios de los estudios también demostraron la transferencia de contaminación viral del material a las manos. Como parte de la publicación, se discutió el lavado efectivo como una técnica de gestión importante para reducir la transmisión, pero se reconoció que la magnitud del impacto del lavado en la reducción de la carga de enfermedad dependía del contaminante viral específico y era difícil de cuantificar 7,8,9,10,11.
El proceso de lavado destruye los microorganismos mediante procesos químicos, físicos y de tratamiento térmico. Por ejemplo, los jabones y detergentes pueden separar los suelos y pueden impartir alguna acción antimicrobiana mediada químicamente. Físicamente, la dilución y la agitación pueden ayudar en la reducción de las cargas virales. Un estudio que examinó la persistencia del coronavirus humano HCoV-OC43 en muestras de algodón utilizando ciclos de lavado industriales y domésticos con y sin temperatura y detergente no encontró virus detectables al lavar en agua no calentada sin detergente, pero que en presencia de una carga de suelo (saliva artificial), los ciclos de lavado doméstico requerían detergente para que las muestras tuvieran cargas de virus no detectables12. El agua caliente en sí misma también puede proporcionar un medio eficaz para destruir algunos microorganismos13,14.
En una publicación reciente que resume el estado de las prácticas actuales de lavandería, se identificaron muchos factores como la composición de la tela, las condiciones de almacenamiento, la carga de suciedad, la temperatura y el tiempo de lavado y la temperatura de secado como variables en las prácticas globales de lavado15. Si bien el lavado es un método de limpieza común para un gran porcentaje de la población, esta gran variación en las prácticas existentes hace que la emisión de una guía detallada sobre cómo hacerlo de manera segura y efectiva, cuando un artículo puede estar contaminado por un virus, sea difícil y escaso. Durante la pandemia de COVID-19, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos emitieron una guía sobre cómo lavar artículos para propietariosde viviendas 16,17. Gran parte de esta guía de lavado se basó en varios estudios más antiguos sobre desinfección bacteriana18,19 y respaldada por varios estudios de sobremesa que han encontrado virus envueltos inactivados en agua con detergentes20,21. La guía se puede resumir como 1) siga las instrucciones del fabricante para el detergente, 2) use el ajuste de agua más caliente apropiado y 3) seque los artículos por completo. El fundamento de estas recomendaciones fue que lavar en el ciclo más caliente posible con detergente combinado con secado completo (con calor si es posible) matará el virus SARS-CoV-2.
La gran cantidad de posibles variaciones en el proceso de lavado requiere un protocolo uniforme, como el que se presenta aquí, para poder aislar variables y probar la eficacia de la desinfección viral de procesos específicos. La intención de este protocolo, junto con un video instructivo, es demostrar un proceso de lavado de agua caliente basado en el laboratorio para su replicación en otros estudios de investigación. Además, los resultados de esta prueba de eficacia de desinfección viral deberían generar confianza en el consumidor en la efectividad del lavado doméstico durante las pandemias virales.
Protocol
Phi6 se recibió de un laboratorio colaborador como una alícuota congelada de ~ 1 ml y se almacenó a -80 ° C hasta su uso. Inicialmente se utilizó para propagar más existencias de virus que posteriormente se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Phi6 fue seleccionado como el virus de demostración porque se usa comúnmente como un virus envuelto modelo, puede propagarse a títulos altos y requiere un laboratorio de bajo nivel de bioseguridad para realizar las pruebas22,23,24.
1. Preparar la solución madre de virus
- Propague el bacteriófago Phi6 en el huésped bacteriano Pseudomonas syringae utilizando una preparación modificada de medios de agar de soja tríptica y un método de superposición de agar blando como se describe a continuación.
- Prepare agar de soja tríptico modificado pesando y mezclando los ingredientes de la Tabla 1 en agua desionizada.
- Preparar un cultivo nocturno de P. syringae agregando una alícuota de 1 ml de P. syringae con una densidad óptica (OD 600) entre 0.9 a 1.5, a100 mL de caldo de soja tríptico modificado (Tabla 1) e incubando en una incubadora agitadora a ~260 rpm a temperatura ambiente (20-26 °C).
- Prepare tubos de agar blando colocando agar de soja tríptico modificado (~ 6 ml) en tubos de ensayo y cubriendo con una tapa esterilizable en autoclave. Conservar a 4 °C hasta su uso. Tubos de agar blando en autoclave a 121 °C durante 15 min para derretir el agar. Conservar a 48 °C hasta el emplatado. El equilibrio a 48 °C es importante, de lo contrario el virus puede inactivarse en el ensayo.
- Añadir 1 ml de alícuota viral concentrada sin diluir al agar blando y 100 μL de una fase logarítmica (OD600 entre 0,9 y 1,5) cultivo de P. syringae. Vierta agar blando sobre la superficie de una placa de agar de soja tríptica modificada solidificada de 100 mm de diámetro. Para evitar burbujas y/o derrames, agite las placas suavemente para distribuir uniformemente el agar blando sobre la superficie del agar sólido e incube durante la noche a temperatura ambiente.
- Raspa suavemente25 el contenido de las tres placas con un esparcidor de células estéril en un tubo cónico estéril de 50 ml que contenga 15 ml de tampón SM. Tubos de vórtice en el ajuste máximo durante 1-2 min para romper el agar y luego centrifugar a 7.000 x g durante 15 min.
- Retire el sobrenadante y filtre a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm. Conservar 1 ml de alícuotas en crioviales a -80 °C hasta su uso.
2. Realizar una evaluación visual previa a la prueba del artículo EPP
- Coloque cada artículo de EPP sobre una superficie limpia y lisa (p. ej., un banco de laboratorio cubierto con un forro de papel desechable). Evalúe cada elemento de EPP por triplicado.
- Asegúrese de que la iluminación sea adecuada durante el examen del EPP. Mida y registre la longitud y el ancho de los artículos sin lavar en varios lugares (Figura 1).
Figura 1. Ubicaciones de medición de la evaluación previa a la prueba de EPP. Lugares de mezclilla, fregado y cubierta facial donde se registró la longitud para rastrear los cambios materiales del proceso de lavado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Prepara cupones
- Haga cupones de prueba de 2 cm x 4 cm cortando el EPP, prepare dos cupones por cubierta facial (se probaron tres cubiertas faciales), cinco cupones por pantalón de mezclilla (se probaron tres pantalones de mezclilla) y tres cupones por camisa exfoliante (se probaron tres exfoliantes).
- Prepare un juego de cupones en blanco de procedimiento de 2 cm x 4 cm (un juego para un artículo de EPP de tamaño completo) para cada tipo de material que no se inoculará sino que se lavará. Prepare dos cupones por cada día de experimentos de cubrirse la cara, cinco cupones por cada día de experimentos de mezclilla y tres cupones por cada día de experimentos de exfoliación.
- Prepare un conjunto de cupones de control positivo de 2 cm x 4 cm que serán inoculados, pero no lavados. Prepare dos cupones por cada día de experimentos de cobertura facial (se probaron tres cubiertas faciales), cinco cupones por cada día de experimentos de mezclilla (se probaron tres pantalones de mezclilla) y tres cupones por cada día de experimentos de exfoliación (se probaron tres exfoliantes) y tres cupones de acero inoxidable.
NOTA: Se seleccionaron diferentes números de réplicas en función del tamaño del elemento. Por ejemplo, es físicamente difícil adherir cinco cupones en la cubierta facial, y dos cupones representarían un área limitada de los pantalones de mezclilla. Las ubicaciones fueron seleccionadas para maximizar la cobertura y en zonas que podrían doblarse durante el lavado y ser más difíciles de limpiar.
4. Realizar la inoculación
- Prepare una solución de extracto de carne de res al 10% disolviendo 1 g de extracto de carne en un volumen total de 10 ml de solución salina tamponada con fosfato. El filtro esteriliza todo el volumen con un filtro de jeringa de 0,2 μm.
- Descongelar la solución madre de virus preparada en la sección 1 a temperatura ambiente. El día de uso, añadir 100 μL del caldo Phi6 descongelado a 900 μL de la solución de extracto de carne al 10%.
- Inocular cupones de prueba y cupones de control positivo con ~107 UFP/muestra pipeteando una gota de solución de 10 μL sobre el elemento EPP y extendiendo la gota usando la punta de la pipeta. Dependiendo del material del EPP, las gotas se separarán y se reagregarán de manera diferente.
- Permita que los cupones inoculados se sequen en un gabinete de bioseguridad. Tiempo(s) de secado determinado(s) a través de la observación de sus materiales específicos. Para los resultados aquí presentados, se utilizaron los siguientes tiempos: exfoliantes = 30 min de tiempo de secado; cubrirse la cara = 60 min de tiempo de secado; denim = 30 min de tiempo de secado; acero inoxidable = 120 min de tiempo de secado.
- Adjunte cupones inoculados a los artículos de EPP de tamaño completo de acuerdo con la Figura 2 utilizando imperdibles y técnicas asépticas.
Figura 2. Pruebe las ubicaciones de los cupones en mezclilla, exfoliantes y cubiertas faciales. Las letras A-D corresponden a los identificadores únicos de cupón para todos los experimentos de lavado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Realizar lavado
- Prepare detergente para lavar de la siguiente manera.
- Esterilice el agua del grifo que se utilizará en la lavadora y recoja 10 ml de agua esterilizada en autoclave para un control de esterilidad. Para este protocolo, autoclave 7 L de agua del grifo en un ciclo líquido de 60 minutos.
- Prepare la solución de lavado de acuerdo con las instrucciones de dilución del fabricante. Para este protocolo, disuelva 1,54 ml de detergente en 3,5 L de agua del grifo estéril. Caliente la solución de lavado a 50 °C con una placa caliente y agite la barra. Mida y registre el pH y la temperatura de la solución de lavado. Recoger 10 ml de solución para comprobar la esterilidad.
- Vierta la solución de lavado en una arandela esterilizada (3,25 L). Preesterilice las arandelas utilizando un ciclo de 250 ppm-4 h de peróxido de hidrógeno vaporoso entre pruebas.
- Coloque los artículos de EPP en una lavadora esterilizada. Agregue un pantalón de mezclilla y una camisa exfoliante por lavadora. Agregue una cubierta facial inoculada y cuatro máscaras de relleno no contaminadas por lavadora; Las máscaras de relleno no tenían cupones adjuntos.
- Lave el artículo EPP durante 18 minutos (dos ciclos de lavado de 9 minutos con agitación normal). Drene la lavadora y enjuague tres veces con agua del grifo a temperatura ambiente (5 L cada vez) para eliminar la espuma. Agregue agua del grifo esterilizada a temperatura ambiente en la lavadora (3.25 L) y realice un ciclo de enjuague de 9 minutos de duración.
- Mueva los artículos de EPP al lado de centrifugado de la lavadora y gire durante 5 minutos. Mueva los elementos EPI a la secadora y séquelos durante 80 minutos a fuego alto (93 °C).
- Mueva el EPP de la secadora al espacio de trabajo estéril y retire asépticamente los cupones de cada artículo y colóquelos en tubos cónicos. Pre-llene los tubos con 10 ml de tampón de extracción de caldo Dey-Engley al 10% y cubra con papel de aluminio.
6. Extraer y enumerar cargas virales en cupones
- Extraiga cupones en 10 mL de caldo neutralizante Dey-Engley al 10% mediante vórtice durante 2 min en la configuración máxima de su equipo.
- Extractos de placas utilizando un método convencional de recubrimiento de agar de tapa blanda26.
- Preparar tubos de agar de soja tríptico suave modificado y un cultivo de P. syringae como se describe en la sección 1. El día de la prueba, autoclave los tubos de agar blando a 121 °C durante 15 min para derretir el agar. Mantener el agar blando a 48 °C hasta que esté emchapado. El equilibrio a 48 °C es importante, de lo contrario el virus puede inactivarse térmicamente en el ensayo.
- Preparar una serie de dilución diez veces mayor en solución salina tamponada con fosfato 1x para cada muestra de ensayo utilizada en el estudio de lavado. Utilice alícuotas diluidas en serie (100 μL) y sin diluir (1 ml y 100 μL) para el chapado.
- Añadir alícuotas de muestra problema al tubo de agar blando que contenga 6 ml de agar blando y 100 μL del cultivo log fase de P . syringae (OD600 entre 0,9-1,5). Vierta el agar blando sobre la superficie de una placa de agar de soja tríptica modificada solidificada. Distribuya uniformemente el agar blando sobre la superficie del agar sólido girando la placa.
- Incubar las placas durante la noche a temperatura ambiente y enumerar manualmente al día siguiente contando las unidades formadoras de placa en cada placa.
7. Realizar una evaluación visual posterior a la prueba de los artículos de EPP
- Documente lo siguiente en los diversos artículos de EPP utilizados para la prueba: signos de decoloración, decoloración y / o daño (por ejemplo, desgarro, estiramiento); Olores; pequeños agujeros, cortes o desgarros (use una linterna pequeña para buscar daños); separación de capas, hilos faltantes, áreas donde la unión está dañada; daños en costuras o cremalleras; Medir y registrar el estiramiento del elástico.
Representative Results
Varios tipos diferentes de datos y resultados de control de calidad se generan después de completar este protocolo. Los recuentos de placas de la unidad formadora de placas (PFU) junto con el volumen de muestra extraído permiten el cálculo del número de PFU por cupón de prueba. La Tabla 2 es un ejemplo de una hoja de registro de datos para los resultados de dilución/recubrimiento en serie. Usando el factor de dilución, el volumen de la muestra y el recuento de placas de la Tabla 1, la Tabla 3 muestra resultados representativos de recuperación viral para una prueba de cubierta facial. Tenga en cuenta que estos datos incluyen los cupones de prueba y las muestras de control de calidad para el inóculo, los cupones y el agua de lavado (con y sin detergente). Las muestras de control de calidad de esterilidad y espacios en blanco de procedimiento son importantes para confirmar que las soluciones de agua y los materiales de EPP no estaban contaminados con Phi6. La indicación de contaminación causaría cálculos erróneos de la eficacia de la desinfección y requeriría que se repitiera la prueba. Las muestras de control positivo están destinadas a verificar que la solución madre de virus no se degradó ambiental o naturalmente durante los experimentos, inflando así el efecto del proceso de lavado en la reducción de la carga viral. Estas muestras deben permanecer dentro de 1 log PFU de los controles de inóculo para aceptar los resultados del cupón de prueba. Una gran reducción en la PFU de las muestras de control positivo también indica que todos los pasos de la inoculación del cupón deben revisarse cuidadosamente para garantizar que el analista esté ejecutando el protocolo con las técnicas adecuadas de pipeteo y propagación.
Este protocolo también proporciona información para evaluar los cambios en las propiedades materiales de las prendas de vestir debido al lavado y la información de control de calidad relacionada con el protocolo (Tabla 4 y Figura 3). Estos datos son útiles por varias razones. El registro de las tendencias en las mediciones de los elementos de EPI permite la identificación de un artículo con un defecto de fabricación. Esta identificación puede ayudar a explicar los datos microbianos atípicos y contextualizar la variación en el comportamiento del producto. Tomar notas de olores o daños también puede proporcionar una indicación de si la lavadora o secadora estaba funcionando de manera subóptima durante un experimento y si las pruebas deben repetirse o el equipo debe repararse. Además, si el plan de prueba requiere múltiples ciclos de lavado del mismo artículo de EPP, los datos pueden ayudar a determinar cuánto tiempo los artículos de EPP mantienen su integridad para su uso durante el lavado. Mantener un registro del pH de la solución detergente proporciona una alerta a los cambios en la fuente de agua o el producto detergente. Mantener un registro de tiempo de los pasos de lavado garantiza que el temporizador de la lavadora y secadora no cause variaciones en el protocolo experimental.
En última instancia, estos datos se utilizan para informar sobre la eficacia de desinfección del procedimiento de lavado de agua caliente contra un sustituto de patógenos virales. La eficacia de la desinfección del lavado (Ecn. 1) se calcula restando el promedio de recuperaciones de viruslogarítmicos 10 del cupón de prueba de EPP del promedio de recuperaciones de virus log10 de los resultados positivos de control de EPP (Figura 4). Para los resultados de cupones de prueba que no se detectan, el log10 del límite de detección se utiliza en el cálculo de la eficacia de la desinfección. Es común informar la eficacia de la desinfección como valores logarítmicos para la comparación con otras técnicas y estándares de desinfección viral.
Eficacia de la desinfección = Promedio log 10 (Controles positivos) - Promedio log10 (Cupones de prueba) (Eqn. 1)
Figura 3. Cambio en las dimensiones del EPI por ubicación. Δ = Medición previa a la prueba - medición posterior a la prueba. Un valor Δ negativo corresponde al estiramiento del artículo en la ubicación especificada y un valor positivo corresponde a la contracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Eficacia del lavado de agua caliente para desinfectar cubiertas faciales, mezclilla y materiales de EPP de Phi6. Las estrellas denotan que se produjo una desinfección completa (no se detecta en los cupones de prueba). Las barras de error indican la desviación estándar (n = 3). Las letras de ubicación corresponden a la ubicación representada en la Figura 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Recetas de soluciones. Ingredientes y cantidades necesarias para preparar soluciones trípticas de agar de soja, caldo de soja tríptico y extracto de carne. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2. Una parte de ejemplo de una hoja de resultados de dilución/recubrimiento en serie. Plantilla para reportar datos microbianos sin procesar. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3. Resultados microbianos que cubren la cara. Ejemplo de hoja de resumen para datos procesados de unidades formadoras de placa (PFU). Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 4. Control de calidad de exfoliaciones y registro de evaluación de materiales. Plantilla para informar la calibración de la sonda de pH, el pH de la solución detergente, las mediciones previas y posteriores al lavado y los tiempos de ciclo de lavado. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Discussion
Este protocolo fue desarrollado para ejecutar pruebas de laboratorio sistemáticas para evaluar la efectividad del lavado de la desinfección viral de EPP / prendas de vestir de tamaño completo. Los procedimientos describen los pasos críticos para preparar el virus, inocular el material de prueba, evaluar los cambios en los artículos debido al proceso de lavado y cuantificar la reducción de la carga viral como resultado del proceso de lavado (lavado y secado a máquina). Además, el protocolo describe las muestras de control de calidad necesarias para garantizar que los experimentos no estén sesgados por la contaminación y las mediciones / observaciones que deben registrarse para rastrear la integridad material de los artículos de EPP después de múltiples ciclos de lavado. Los resultados utilizando Phi6 indican que el proceso de lavado de agua caliente utilizado en este protocolo logró una reducción superior a 3 log en la carga viral para todas las muestras (cubierta facial, exfoliantes y pantalones de mezclilla). La reducción de la carga viral también fue uniforme en diferentes ubicaciones en el EPP / prendas de vestir. Para demostrar la reducción de 3 logaritmos, este protocolo requiere el uso de una carga viral alta y un agente estabilizador (extracto de carne) que puede no ser representativo de la carga del suelo para todas las situaciones.
Se seleccionaron mini lavadoras y secadoras compactas para optimizar el número de experimentos replicados que podrían llevarse a cabo en un entorno con limitaciones de espacio y para mantener la esterilización del equipo y el volumen de agua utilizado durante los experimentos manejable para el personal de laboratorio. Como resultado del uso de la mini lavadora, los pasos de enjuague fueron manuales en comparación con la mayoría de las aplicaciones de lavado doméstico que están completamente automatizadas. También es importante recordar que el lavado a máquina predomina en los países desarrollados, pero el lavado de manos todavía se practica en todo el mundo15. Además, algunos pueden no tener acceso a agua caliente para lavar, y otros secan manualmente la ropa al aire en lugar de secarse a máquina. Estas diferencias en las prácticas de lavado no se abordaron en este protocolo actual, pero podrían investigarse fácilmente con modificaciones menores, como sustituir los pasos de lavado y secado con el uso de un cubo y una línea cerrada.
Ha habido un enfoque mínimo en la limpieza / desinfección de cubiertas faciales y ropa de calle contaminadas con virus en la literatura científica a gran escala. Más comúnmente, los estudios evalúan el rendimiento de filtración de las cubiertas faciales después de repetidos lavados y secados, pero no evalúan la eficacia de la desinfección viral27,28. Por ejemplo, Clapp et al. evaluaron la eficiencia de filtración ajustada de máscaras de tela y máscaras de procedimiento modificadas y encontraron una amplia variación en el rendimiento, con modificaciones simples que proporcionan un mayor ajuste y eficiencia de filtración29. Otro estudio analizó la eficiencia de filtración de cuatro máscaras de tela de diferentes materiales30, centrándose nuevamente en el control de la fuente o la protección personal. Esto puede deberse a la falta de especialización tanto para la porción microbiana como para las pruebas mecánicas en el mismo laboratorio. El protocolo presentado aquí proporciona una evaluación de la eficacia de la desinfección, así como la degradación del material.
Ha habido una serie de métodos de descontaminación/desinfección para la protección respiratoria desechable (principalmente N95) publicados recientemente en la literatura científica31,32,33. El enfoque principal en los FFR (por ejemplo, N95) se debe a la protección respiratoria crítica que brindan a los trabajadores de la salud y otras ocupaciones de primera línea. Las tecnologías primarias para la descontaminación de respiradores incluyeron peróxido de hidrógeno vaporizado (VHP), radiación germicida ultravioleta (UVGI) y calor húmedo (vapor) para la inactivación del virus. Viscusi et al. evaluaron cinco métodos de descontaminación para FFR y UVGI; se encontró que el óxido de etileno y el VHP eran los métodos de descontaminación más prometedores31. Fischer et al. evaluaron cuatro métodos diferentes de descontaminación -luz UV, calor seco, etanol al 70% y VHP- por su capacidad para reducir la contaminación con SARS-CoV-2 y su efecto sobre la función del respirador N9532. Hay muchos estudios adicionales sobre tecnologías de descontaminación efectivas para FFR que se resumieron y publicaron en 202033. Sin embargo, estos métodos especializados no son accesibles ni están diseñados para ser utilizados de manera segura por el propietario promedio de una casa o pequeña empresa.
Este protocolo fue desarrollado usando Phi6, un bacteriófago envuelto que es similar al SARS-CoV-2, tiene proteínas de pico y es de tamaño similar (80-100 nm)34, para todas las pruebas. Dado que Phi6 no es un patógeno conocido, puede manipularse en un laboratorio de nivel 1 de bioseguridad microbiológica general (BSL-1). La eficacia contra Phi6 puede indicar la eficacia de otros virus envueltos, sin embargo, es necesaria la verificación empírica para cada virus de interés35. Mediante el uso de un agente viral no patógeno similar, se espera que este protocolo pueda repetirse en otros lugares y usarse para estudiar futuras epidemias / pandemias virales. La investigación futura puede incluir el uso de desinfectantes (p.ej., lejía) además de detergentes y un protocolo estandarizado para el lavado de manos y el secado de la línea.
Disclosures
No hay conflictos de intereses conocidos que revelar.
Acknowledgments
La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) a través de su Oficina de Investigación y Desarrollo dirigió la investigación descrita en este documento bajo EP-C-15-008 con Jacobs Technology Inc. Ha sido revisado por la Agencia, pero no refleja necesariamente las opiniones de la Agencia. No debe inferirse ningún respaldo oficial. La EPA no respalda la compra o venta de ningún producto o servicio comercial. Los autores desean agradecer a los contratistas de la EPA Denise Aslett por la supervisión de la microbiología RTP de la EPA, Brian Ford, Rachael Baartmans y Lesley Mendez Sandoval por su trabajo en este proyecto en el laboratorio de microbiología RTP de la EPA, Ramona Sherman por proporcionar la revisión de garantía de calidad de la EPA, y Worth Calfee y Shannon Serre por proporcionar revisiones técnicas de la EPA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freezer (- 80 °C) | ThermoFisher Scientific | FDE30086FA | |
| Hot Plate | VWR | 97042-714 | |
| Safety Pins (steel) | Singer | 319921 | |
| Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3525 | |
| SM buffer | Teknova, Hollister, CA | S0249 | |
| Syringe filter (0.2 μm) | Corning, Corning, NY | PES syringe filters, 431229 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Teknova, Hollister, CA | P0196, 10X PBS solution | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Autoclavable caps | DWK Life Sciences, Millville, NJ | KIM-KAP Caps, 73663-18 | |
| Autoclave | Steris | AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS | |
| Beef Extract | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA | P/N B4888-100g | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| Cell spreaders | Busse Hospital Disposables | 23600894 | |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004271 | Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge |
| Certified Timer | https://nist.time.gov/ | Not Applicable | |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Life Sciences | 352098 | Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AY509X33 | |
| Denim | Wrangler | Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW | |
| Detergent | Proctor and Gamble | Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068 | |
| Dextrose | Fisher | BP350 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Becton Dickinson | DF0819172 | |
| Dryer | Magic Chef | MCSDRY15W | |
| Face Coverings | Felina | Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4 | |
| Incubator (top agar) | Symphony | 414004-596 | |
| Laboratory Notebook | Scientific Notebook Company | 2001 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Media sterilization and dispensing system | Integra | Media Clave/Media Jet | |
| Petri Dishes (100 mm) | VWR | 25384-342 | |
| pH Meter | Orion/Oakton | STARA1110/EW-35634-35 | |
| pH Probe | Orion | 8157BNUMD | |
| pH Standards | Oakton | 00654-(00/04/08) | |
| Phi 6 and Pseudomonas syringae | Battelle Memorial Institute, Columbus, OH | Not Applicable | |
| Pipette & Tips | Rainin | (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382 | |
| Refrigerator | True Manufacturing Co., Inc. | GDM-33 | |
| Scrubs | Gogreen cool | PN: WS19100PT | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 57656 | |
| Stir Bar | Fisherbrand | 16-800-512 | |
| Tape Measure | Lufkin | PS3425 | |
| Test Tubes for Soft agar (14 mL) | Corning, Corning, NY | 352059 | |
| Thermometer | Fisherbrand | 14-983-19B | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T9410 | |
| Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags | STERIS | 62020TW | |
| Vortex (during the plating process) | Daigger Scientific, Inc | 3030A | Vortex Genie 2 |
| Vortex (for sample extraction) | Branson Ultrasonics | 58816-115 | Multi-Tube vortexer |
| Washer | Kuppet | KP1040600A | |
| Washer Sterilization | Steris | STERIS VHP ED1000 generator | |
| Yeast extract | Gibco | 212750 |
References
- Emanuel, E. J., et al. Fair allocation of scarce medical resources in the time of Covid-19. The New England Journal of Medicine. 382 (21), 2049-2055 (2020).
- Cohen, J., van der Meulen Rodgers, Y. Contributing factors to personal protective equipment shortages during the COVID-19 pandemic. Preventive Medicine. 141, 106263 (2020).
- Burki, T. Global shortage of personal protective equipment. The Lancet Infectious Diseases. 20 (7), 785-786 (2020).
- Optimizing Personal Protective Equipment (PPE) Supplies. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/ppe-strategy/index.html (2020).
- Livingston, E., Desai, A., Berkwits, M. Sourcing personal protective equipment during the COVID-19 pandemic. Jama. 323 (19), 1912-1914 (2020).
- Bloomfield, S. F., Exner, M., Signorelli, C., Nath, K. J., Scott, E. A. The infection risks associated with clothing and household linens in home and everyday life settings, and the role of laundry. International Scientific Forum on Home Hygiene. , (2011).
- Hall, C. B., Douglas, R. G., Geiman, J. M. Possible transmission by fomites of respiratory syncytial virus. Journal of Infectious Diseases. 141 (1), 98-102 (1980).
- Turner, R., Shehab, Z., Osborne, K., Hendley, J. O. Shedding and survival of herpes simplex virus from 'fever blisters'. Pediatrics. 70 (4), 547-549 (1982).
- Bean, B., et al. Survival of influenza viruses on environmental surfaces. Journal of Infectious Diseases. 146 (1), 47-51 (1982).
- Brady, M. T., Evans, J., Cuartas, J. Survival and disinfection of parainfluenza viruses on environmental surfaces. American Journal of Infection Control. 18 (1), 18-23 (1990).
- Sidwell, R. W., Dixon, G. J., Mcneil, E. Quantitative studies on fabrics as disseminators of viruses: I. Persistence of vaccinia virus on cotton and wool fabrics. Applied Microbiology. 14 (1), 55-59 (1966).
- Owen, L., Shivkumar, M., Laird, K. The stability of model human coronaviruses on textiles in the environment and during health care laundering. Msphere. 6 (2), 00316-00321 (2021).
- Sehulster, L., et al. Guidelines for environmental infection control in health-care facilities. Recommendations from CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (HICPAC). American Society for Healthcare Engineering/American Hospital Association. , (2004).
- Chen, H., et al. Influence of different inactivation methods on severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA copy number. Journal of Clinical Microbiology. 58 (8), e00958 (2020).
- Abney, S. E., Ijaz, M. K., McKinney, J., Gerba, C. P. Laundry hygiene and odor control-state of the science. Applied and Environmental Microbiology. 87 (14), 0300220 (2021).
- COVID-19 Cleaning and Disinfecting Your Home. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/disinfecting-you-home.html (2021).
- COVID-19 Your Guide to Masks - How to select, properly wear, clean, and store masks. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/about-face-coverings.html (2021).
- Walter, W. G., Schillinger, J. E.
- Blaser, M. J., Smith, P. F., Cody, H. J., Wang, W. -L. L., LaForce, F. M. Killing of fabric-associated bacteria in hospital laundry by low-temperature washing. Journal of Infectious Diseases. 149 (1), 48-57 (1984).
- Gerhardts, A., et al. Testing of the adhesion of herpes simplex virus on textile substrates and its inactivation by household laundry processes. Journal of Biosciences and Medicines. 4 (12), 111 (2016).
- Heinzel, M., Kyas, A., Weide, M., Breves, R., Bockmühl, D. P. Evaluation of the virucidal performance of domestic laundry procedures. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 213 (5), 334-337 (2010).
- Casanova, L. M., Weaver, S. R. Inactivation of an enveloped surrogate virus in human sewage. Environmental Science & Technology Letters. 2 (3), 76-78 (2015).
- Aquino de Carvalho, N., Stachler, E. N., Cimabue, N., Bibby, K. Evaluation of Phi6 persistence and suitability as an enveloped virus surrogate. Environmental Science & Technology. 51 (15), 8692-8700 (2017).
- Ye, Y., Chang, P. H., Hartert, J., Wigginton, K. R. Reactivity of enveloped virus genome, proteins, and lipids with free chlorine and UV254. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7698-7708 (2018).
- Bacteriology Culture Guide. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/resources/culture-guides/bacteriology-culture-guide (2022).
- Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Bacteriophages. , Springer. 69-76 (2009).
- Sankhyan, S., et al. Filtration performance of layering masks and face coverings and the reusability of cotton masks after repeated washing and drying. Aerosol and Air Quality Research. 21 (11), 210117 (2021).
- Kumar, A., Bhattacharjee, B., Sangeetha, D., Subramanian, V., Venkatraman, B. Evaluation of filtration effectiveness of various types of facemasks following with different sterilization methods. Journal of Industrial Textiles. , (2021).
- Clapp, P. W., et al. Evaluation of cloth masks and modified procedure masks as personal protective equipment for the public during the COVID-19 pandemic. JAMA Internal Medicine. 181 (4), 463-469 (2021).
- Lu, H., Yao, D., Yip, J., Kan, C. -W., Guo, H. Addressing COVID-19 spread: development of reliable testing system for mask reuse. Aerosol and air quality research. 20 (11), 2309-2317 (2020).
- Viscusi, D. J., Bergman, M. S., Eimer, B. C., Shaffer, R. E. Evaluation of five decontamination methods for filtering facepiece respirators. Annals of Occupational Hygiene. 53 (8), 815-827 (2009).
- Fischer, R. J., et al. Effectiveness of N95 respirator decontamination and reuse against SARS-CoV-2 virus. Emerging Infectious Diseases. 26 (9), 2253 (2020).
- Derraik, J. G., Anderson, W. A., Connelly, E. A., Anderson, Y. C. Rapid review of SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 viability, susceptibility to treatment, and the disinfection and reuse of PPE, particularly filtering facepiece respirators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (17), 6117 (2020).
- Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T., Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva microdroplets deposited on glass surfaces. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Calfee, M. W., et al. Virucidal efficacy of antimicrobial surface coatings against the enveloped bacteriophage Φ6. Journal of Applied Microbiology. 132 (3), 1813-1824 (2022).
