Summary
Em resposta à pandemia de coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), um protocolo de laboratório foi desenvolvido para testar a eficácia da desinfecção viral da lavagem de água quente de coberturas faciais de pano, esfoliantes de algodão e calças jeans. O vírus Phi6 (bacteriófago) foi utilizado como organismo para testar a eficácia da desinfecção.
Abstract
Este protocolo fornece um exemplo de um processo laboratorial para a realização de estudos de lavagem que geram dados sobre a desinfecção viral. Embora o protocolo tenha sido desenvolvido para pesquisa durante a pandemia da doença do coronavírus 2019 (COVID-19), pretende-se que seja um quadro, adaptável a outros estudos de desinfecção do vírus; demonstra as etapas de preparação do vírus de teste, inoculação do material de teste, avaliação de alterações visuais e de integridade dos itens lavados devido ao processo de lavagem e quantificação da redução da carga viral. Além disso, o protocolo descreve as amostras de controle de qualidade necessárias para garantir que os experimentos não sejam tendenciosos por contaminação e medições/observações que devem ser registradas para rastrear a integridade do material dos itens de equipamentos de proteção individual (EPI) após vários ciclos de lavagem. Os resultados representativos apresentados com o protocolo usam o bacteriófago Phi6 inoculado em materiais de esfoliação de algodão, denim e algodão que cobrem o rosto e indicam que o processo de lavagem e secagem de água quente alcançou uma redução de 3 log (99,9%) na carga viral para todas as amostras (uma redução de 3 log é a métrica de desempenho de desinfetante na Diretriz de Teste de Desempenho de Produto 810.2200 da Agência de Proteção Ambiental dos EUA). A redução da carga viral foi uniforme nos diferentes locais dos itens de EPI. Os resultados deste protocolo de teste de eficácia de desinfecção viral devem ajudar a comunidade científica a explorar a eficácia da lavagem doméstica para outros tipos de vírus de teste e procedimentos de lavagem.
Introduction
A pandemia da doença do coronavírus 2019 (COVID-19) causou uma interrupção sem precedentes na cadeia de suprimentos global e levou a uma escassez crítica de muitos itens, incluindo equipamentos essenciais de proteção individual (EPI)1,2,3. Aqueles em ocupações de alto risco tiveram que se adaptar usando estratégias recomendadas de capacidade de crise e o público adotou o uso de itens não especializados, como coberturas faciais de material de pano, principalmente para controle de fontes, mas também para fornecer alguma proteção respiratória para os usuários. Nos Estados Unidos, a proteção respiratória especializada (ou seja, respiradores faciais filtrantes (FFRs), como N95s) foi reservada para algumas dessas ocupações de alto risco (por exemplo, cuidados de saúde) durante a escassez de suprimentos4. Quando pouco se sabia sobre a transmissão do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-Cov-2), uma variedade de outros tipos de materiais de vestuário também foram considerados como proteção de barreira no início da pandemia5. Com a diversidade de tecidos sendo utilizados para proteção do usuário, surgiram dúvidas sobre o uso, reutilização e desinfecção/descontaminação desses itens. Enquanto nos Estados Unidos era geralmente aceito que a lavagem rotineira de roupas faciais e outros itens de vestuário tornava os vírus nessas superfícies não infecciosos, existiam poucos dados para validar essa alegação, e havia uma falta de protocolos laboratoriais publicados para testes. O objetivo do protocolo de pesquisa aqui apresentado é fornecer um exemplo de um processo laboratorial para a realização de estudos de lavagem que geram dados sobre desinfecção viral. Embora o protocolo tenha sido desenvolvido para pesquisa durante a pandemia de COVID-19, pretende-se que seja uma estrutura adaptável a outros estudos de desinfecção de vírus.
O papel do vestuário na transmissão de doenças é um conceito difícil de quantificar. O Fórum Científico Internacional sobre Higiene Doméstica tentou essa tarefa desafiadora realizando uma revisão do papel do vestuário na disseminação de doenças infecciosas, juntamente com uma avaliação de risco das práticas de higiene doméstica6. Incluiu-se neste trabalho a revisão de diversos estudos científicos que examinaram a sobrevivência de diferentes cepas virais em diferentes tipos de tecidos, como lã e algodão 7,8,9,10,11. Cada estudo se concentrou em um tipo diferente de vírus, incluindo vaccinia, poliovírus, vírus sincicial respiratório, herpesvírus e vírus da gripe. Os tempos de sobrevivência dos diferentes vírus nos tecidos variaram de 30 min a 5 meses, dependendo da combinação vírus-material. Vários dos estudos também demonstraram a transferência de contaminação viral do material para as mãos. Como parte da publicação, a lavagem efetiva foi discutida como uma importante técnica de manejo para reduzir a transmissão, mas reconheceu que a magnitude do impacto da lavagem na redução da carga de doença era dependente do contaminante viral específico e difícil de quantificar 7,8,9,10,11.
O processo de lavagem destrói microrganismos usando processos de tratamento químico, físico e térmico. Por exemplo, sabões e detergentes podem separar os solos e podem transmitir alguma ação antimicrobiana mediada quimicamente. Fisicamente, a diluição e a agitação podem auxiliar na redução das cargas virais. Um estudo que examinou a persistência do coronavírus humano HCoV-OC43 em amostras de algodão usando ciclos de lavagem industrial e doméstica com e sem temperatura e detergente não encontrou vírus detectável ao lavar em água não aquecida sem detergente, mas que, na presença de uma carga de solo (saliva artificial), os ciclos de lavagem doméstica exigiam detergente para que as amostras tivessem cargas de vírus não detectáveis12. A própria água quente também pode fornecer um meio eficaz de destruir alguns microrganismos13,14.
Em publicação recente resumindo o estado das práticas atuais de lavanderia, muitos fatores como composição do tecido, condições de armazenamento, carga de sujeira, temperatura e tempo de lavagem e temperatura de secagem foram identificados como variáveis nas práticas globais de lavagem15. Embora a lavagem seja um método de limpeza comum para uma grande porcentagem da população, essa grande variação nas práticas existentes torna a emissão de orientações detalhadas sobre como fazer isso com segurança e eficácia, quando um item pode estar contaminado por um vírus, desafiadora e escassa. Durante a pandemia de COVID-19, os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) dos Estados Unidos emitiram orientações sobre como lavar itens para proprietários de imóveis16,17. Grande parte dessa orientação de lavagem foi baseada em vários estudos mais antigos sobre desinfecção bacteriana18,19 e apoiada por vários estudos de bancada que encontraram vírus envelopados inativados em água com detergentes20,21. A orientação pode ser resumida em: 1) siga as instruções do fabricante para o detergente, 2) use a configuração de água mais quente apropriada e 3) seque completamente os itens. A lógica dessas recomendações era que a lavagem no ciclo mais quente possível com detergente combinado com secagem completa (com calor, se possível) mataria o vírus SARS-CoV-2.
O grande número de possíveis variações no processo de lavagem requer um protocolo uniforme, como o aqui apresentado, para poder isolar variáveis e testar a eficácia da desinfecção viral de processos específicos. A intenção deste protocolo, juntamente com um vídeo instrutivo, é demonstrar um processo de lavagem de água quente baseado em laboratório para replicação em outros estudos de pesquisa. Além disso, os resultados desse teste de eficácia de desinfecção viral devem aumentar a confiança do consumidor na eficácia da lavagem doméstica durante pandemias baseadas em vírus.
Protocol
Phi6 foi recebido de um laboratório colaborador como uma alíquota congelada de ~1 mL e foi armazenado a -80 °C até o uso. Foi inicialmente utilizado para propagar mais existências de vírus que foram posteriormente armazenadas a -80 °C até à sua utilização. O Phi6 foi selecionado como o vírus de demonstração porque é comumente utilizado como um modelo de vírus envelopado, pode ser propagado para altos títulos e requer um laboratório de baixo nível de biossegurança para a realização do teste22,23,24.
1. Preparar a solução-mãe para vírus
- Propagar o bacteriófago Phi6 em Pseudomonas syringae do hospedeiro bacteriano usando uma preparação modificada de ágar de soja tríptica e método de sobreposição de ágar macio, conforme descrito abaixo.
- Preparar ágar de soja tríptico modificado pesando e misturando os ingredientes da Tabela 1 em água deionizada.
- Preparar uma cultura noturna de P. syringae adicionando uma alíquota de 1 mL de P. syringae com uma densidade óptica (OD 600) entre 0,9 a 1,5, a 100 mL de caldo de soja tríptico modificado (Tabela 1) e incubando em uma incubadora de agitação a ~260 rpm à temperatura ambiente (20-26 °C).
- Prepare tubos de ágar macio colocando ágar de soja tríptico modificado (~ 6 mL) em tubos de ensaio e cobrindo com uma tampa autoclavável. Conservar a 4 °C até à utilização. Tubos de ágar macio em autoclave a 121 °C durante 15 minutos para derreter o ágar. Manter a 48 °C até ao revestimento. O equilíbrio a 48 °C é importante, caso contrário, o vírus pode ser inativado no ensaio.
- Adicionar 1 mL de alíquota concentrada do vírus não diluído ao ágar mole e 100 μL de uma cultura de P. syringae em fase logarítmica (OD600 entre 0,9 a 1,5). Despeje ágar macio sobre a superfície de uma placa de ágar Tryptic Soy modificada de 100 mm de diâmetro solidificada. Para evitar bolhas e/ou derramamentos, gire as placas suavemente para distribuir uniformemente o ágar macio sobre a superfície do ágar sólido e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
- Raspe suavemente25 o conteúdo das três placas com um espalhador de células estéreis em um tubo cônico estéril de 50 mL contendo 15 mL de tampão SM. Tubos de vórtice na configuração máxima por 1-2 min para quebrar o ágar e, em seguida, centrifugar a 7.000 x g por 15 min.
- Remova o sobrenadante e filtre através de um filtro de seringa de 0,2 μm. Conservar alíquotas de 1 ml em criofrais a -80 °C até à utilização.
2. Realizar avaliação visual pré-teste do item EPI
- Coloque cada item de EPI em uma superfície limpa e lisa (por exemplo, uma bancada de laboratório coberta com um forro de papel descartável). Avalie cada item do EPI em triplicado.
- Garantir a iluminação adequada durante o exame de EPI. Meça e registre o comprimento e a largura dos itens não lavados em vários locais (Figura 1).
Figura 1. Locais de medição da avaliação pré-teste de EPIs. Denim, esfoliação e locais de cobertura facial onde o comprimento foi registrado para rastrear alterações de material do processo de lavagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Prepare cupons
- Faça cupons de teste de 2 cm x 4 cm cortando EPIs, prepare dois cupons por cobertura facial (três coberturas faciais foram testadas), cinco cupons por calça jeans (três calças jeans foram testadas) e três cupons por camisa esfoliante (três esfoliantes foram testados).
- Prepare um conjunto de cupons em branco processuais de 2 cm x 4 cm (um conjunto para um item de EPI de tamanho normal) para cada tipo de material que não será inoculado, mas será lavado. Prepare dois cupons para cada dia de experimentos de cobertura facial, cinco cupons para cada dia de experimentos de jeans e três cupons para cada dia de experimentos de esfoliação.
- Prepare um conjunto de cupons de controle positivo de 2 cm x 4 cm que serão inoculados, mas não lavados. Prepare dois cupons para cada dia de experimentos de cobertura facial (três coberturas faciais foram testadas), cinco cupons para cada dia de experimentos de denim (três calças jeans foram testadas) e três cupons para cada dia de experimentos de esfoliação (três esfoliantes foram testados) e três cupons de aço inoxidável.
Observação : números diferentes de replicações foram selecionados com base no tamanho do item. Por exemplo, é fisicamente difícil aderir cinco cupons na cobertura facial, e dois cupons representariam uma área limitada das calças jeans. Os locais foram selecionados para maximizar a cobertura e em zonas que podem ficar dobradas durante a lavagem e ser mais difíceis de limpar.
4. Realizar inoculação
- Preparar uma solução de extrato de carne bovina a 10% dissolvendo 1 g de extrato de carne bovina em um volume total de 10 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x. O filtro esteriliza todo o volume utilizando um filtro de seringa de 0,2 μm.
- Descongelar a solução-mãe para o vírus preparada no ponto 1 à temperatura ambiente. No dia de utilização, adicionar 100 μL da unidade populacional de Phi6 descongelada a 900 μL da solução de extracto de bovino a 10%.
- Inocular cupons de teste e cupons de controle positivo com ~107 PFU/amostra pipetando uma gota de solução de 10 μL no item EPI e espalhando a gota usando a ponta da pipeta. Dependendo do material do EPI, as gotículas se separarão e se reagregarão de forma diferente.
- Permita que os cupons inoculados sequem em um armário de biossegurança. Determinado tempo(s) de secagem através da observação de seus materiais específicos. Para os resultados aqui apresentados, foram utilizados os seguintes tempos: esfoliação = 30 min de tempo seco; cobertura facial = 60 min de tempo seco; denim = 30 min de tempo seco; aço inoxidável = 120 min de tempo seco.
- Anexe cupons inoculados a itens de EPI de tamanho normal de acordo com a Figura 2 usando pinos de segurança e técnicas assépticas.
Figura 2. Teste os locais dos cupons em jeans, esfoliantes e coberturas faciais. As letras A-D correspondem aos identificadores de cupom exclusivos para todos os experimentos de lavagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Realizar lavagem
- Prepare o detergente de lavagem da seguinte forma.
- Esterilize a água da torneira que será usada na máquina de lavar roupa e recolha 10 ml de água autoclavada para uma verificação da esterilidade. Para este protocolo, autoclave 7 L de água da torneira em um ciclo líquido de 60 minutos.
- Preparar a solução de lavagem de acordo com as instruções de diluição do fabricante. Para este protocolo, dissolver 1,54 mL de detergente em 3,5 L de água da torneira estéril. Aqueça a solução de lavagem a 50 °C usando uma placa quente e agite a barra. Medir e registar o pH e a temperatura da solução de lavagem. Recolher 10 ml de solução para verificação da esterilidade.
- Despeje a solução de lavagem em uma lavadora esterilizada (3,25 L). Pré-esterilizar arruelas usando um ciclo de 250 ppm-4 h de peróxido de hidrogênio vaporoso entre os testes.
- Coloque o(s) artigo(s) de EPI numa arruela esterilizada. Adicione uma calça jeans e uma camisa esfoliante por máquina de lavar. Adicione uma cobertura facial inoculada e quatro máscaras de enchimento não contaminadas por lavadora; As máscaras de preenchimento não tinham cupons anexados.
- Lave o item de EPI por 18 min (dois ciclos de lavagem de 9 min com agitação normal). Escorra a máquina de lavar roupa e triplice o enxágue com água da torneira à temperatura ambiente (5 L de cada vez) para remover a espuma. Adicione água da torneira esterilizada à temperatura ambiente na arruela (3,25 L) e realize um ciclo de enxágue de 9 minutos de duração.
- Mova o(s) item(ns) do EPI para o lado giratório da anilha e gire por 5 min. Deslocar o(s) artigo(s) EPI(s) para o secador e secar durante 80 minutos na regulação de calor elevado (93 °C).
- Mova os EPIs do secador para o espaço de trabalho estéril e remova assepticamente os cupons de cada item e coloque-os em tubos cônicos. Pré-encha os tubos com 10 mL de tampão de extração de caldo Dey-Engley a 10% e cubra com papel alumínio.
6. Extraia e enumere cargas virais em cupons
- Extraia cupons em 10 mL de caldo neutralizante Dey-Engley a 10% por vórtice por 2 min na configuração máxima do seu equipamento.
- Extratos de chapas utilizando um método convencional de sobreposição de ágar de capota macia26.
- Preparar tubos de ágar de soja tríptico modificado e macio e uma cultura de P. syringae , conforme descrito na secção 1. No dia do teste, autoclave os tubos de ágar macio a 121 °C por 15 min para derreter o ágar. Manter o ágar macio a 48 °C até ao revestimento. O equilíbrio a 48 °C é importante, caso contrário o vírus pode ser inactivado termicamente no ensaio.
- Preparar uma série de diluição de dez vezes em solução salina tamponada com fosfato 1x para cada amostra de ensaio utilizada no estudo de branqueamento. Use alíquotas diluídas em série (100 μL) e não diluídas (1 mL e 100 μL) para chapeamento.
- Adicionar alíquotas da amostra de teste ao tubo de ágar macio contendo 6 mL de ágar macio e 100 μL da cultura de P. syringae da fase logarítmica (OD600 entre 0,9-1,5). Despeje o ágar macio na superfície de uma placa de ágar Tryptic Soy modificada solidificada. Distribua uniformemente o ágar macio sobre a superfície do ágar sólido girando a placa.
- Incubar as placas durante a noite à temperatura ambiente e enumerar manualmente no dia seguinte, contando as unidades formadoras de placas em cada placa.
7. Realizar avaliação visual pós-teste do(s) item(ns) EPI(s)
- Documente o seguinte nos vários itens de EPI usados para o teste: sinais de desbotamento, descoloração e/ou danos (por exemplo, rasgo, alongamento); Odores; pequenos buracos, cortes ou rasgos (use uma pequena lanterna para procurar danos); separação de camadas, roscas em falta, áreas onde a ligação está danificada; danos a costuras ou zíperes; medir e registrar o alongamento do elástico.
Representative Results
Vários tipos diferentes de dados e resultados de controle de qualidade são gerados após a conclusão deste protocolo. As contagens de placas da unidade formadora de placas (PFU), juntamente com o volume de amostra extraído, permitem o cálculo do número de PFU por cupom de teste. A Tabela 2 é um exemplo de uma folha de registro de dados para resultados de diluição/chapeamento em série. Usando o fator de diluição, o volume da amostra e a contagem de placas da Tabela 1, a Tabela 3 mostra resultados de recuperação viral representativos para um teste de cobertura facial. Observe que esses dados incluem os cupons de teste e as amostras de controle de qualidade para o inóculo, cupons e água de lavagem (com e sem detergente). As amostras de controle de qualidade em branco e esterilidade do procedimento são importantes para confirmar que as soluções aquosas e os materiais de EPI não estavam contaminados com Phi6. A indicação de contaminação causaria cálculos errados da eficácia da desinfecção e exigiria que o teste fosse repetido. As amostras de controlo positivo destinam-se a verificar se a solução-mãe do vírus não se degradou ambientalmente/naturalmente durante as experiências, inflacionando assim o efeito do processo de branqueamento na redução da carga viral. Essas amostras devem permanecer dentro de 1 log PFU dos controles de inóculo para aceitar os resultados do cupom de teste. Uma grande redução na UFP das amostras de controle positivo também indica que todas as etapas da inoculação do cupom devem ser cuidadosamente revisadas para garantir que o analista esteja executando o protocolo com técnicas adequadas de pipetagem e espalhamento.
Esse protocolo também fornece informações para avaliação de alterações nas propriedades materiais dos itens de vestuário devido à lavagem e informações de controle de qualidade referentes ao protocolo (Tabela 4 e Figura 3). Esses dados são úteis por vários motivos. O registro das tendências nas medições dos itens de EPI permite a identificação de um item com um defeito de fabricação. Essa identificação pode ajudar a explicar dados microbianos atípicos e contextualizar a variação no comportamento do produto. Tomar notas de odores ou danos também pode fornecer uma indicação se a lavadora ou secadora estava operando de forma sub-ótima durante um experimento e se os testes devem ser repetidos ou o equipamento reparado. Além disso, se o plano de teste exigir vários ciclos de lavagem do mesmo item de EPI, os dados podem ajudar a determinar por quanto tempo os itens de EPI mantêm sua integridade para uso durante a lavagem. Manter um registo do pH da solução detergente fornece um alerta para alterações na fonte de água ou no produto detergente. Manter um registro de tempo das etapas de lavagem garante que o temporizador na lavadora e secadora não cause variações no protocolo experimental.
Em última análise, esses dados são usados para relatar a eficácia da desinfecção do procedimento de lavagem de água quente contra um substituto para patógenos virais. A eficácia da desinfecção por lavagem (Eqn. 1) é calculada pela subtração da média de recuperações de vírus log 10 do cupom de teste de EPI da média de recuperações de vírus log10 de resultados de controle positivo de EPI (Figura 4). Para resultados de cupom de teste que não são detectados, o log10 do limite de detecção é usado no cálculo da eficácia da desinfecção. É comum relatar a eficácia da desinfecção como valores logarítmicos para comparação com outras técnicas e padrões de desinfecção viral.
Eficácia da Desinfecção = Média log 10 (Controles Positivos) - Média log10 (Cupons de Teste) (Eqn. 1)
Figura 3. Alteração das dimensões dos EPI por localização. Δ = Medição pré-teste - medição pós-teste. Um valor Δ negativo corresponde ao alongamento do item no local especificado e um valor positivo corresponde ao encolhimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Eficácia da lavagem de água quente na desinfecção de materiais de coberturas faciais, jeans e esfoliação de EPIs de Phi6. As estrelas denotam que a desinfecção completa ocorreu (não detecta nos cupons de teste). As barras de erro indicam desvio padrão (n = 3). As letras de localização correspondem ao posicionamento representado na Figura 2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Receitas de solução. Ingredientes e quantidades necessárias para preparar ágar tríptico de soja, caldo de soja tríptico e soluções de extrato de carne bovina. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2. Uma parte de exemplo de uma folha de resultados de diluição/chapeamento em série. Modelo para relatar dados microbianos brutos. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 3. Resultados microbianos de cobertura facial. Exemplo de folha de resumo para dados de unidade formadora de placa (PFU) processada. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 4. Controle de qualidade de esfoliantes e registro de avaliação de materiais. Modelo para relatar calibração de sonda de pH, pH de solução detergente, medições pré e pós-lavagem e tempos de ciclo de lavagem. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Discussion
Este protocolo foi desenvolvido para executar testes laboratoriais sistemáticos para avaliar a eficácia de lavagem da desinfecção viral de itens de EPI/vestuário de tamanho normal. Os procedimentos descrevem as etapas críticas para preparar o vírus, inocular o material de teste, avaliar as alterações nos itens devido ao processo de lavagem e quantificar a redução da carga viral como resultado do processo de lavagem (lavagem e secagem à máquina). Além disso, o protocolo descreve as amostras de controle de qualidade necessárias para garantir que os experimentos não sejam tendenciosos por contaminação e medições/observações que devem ser registradas para rastrear a integridade do material dos itens de EPI após vários ciclos de lavagem. Os resultados utilizando Phi6 indicam que o processo de lavagem de água quente utilizado neste protocolo alcançou uma redução superior a 3 log na carga viral para todas as amostras (cobertura facial, esfoliantes e calças jeans). A redução da carga viral também foi uniforme em diferentes locais nos EPI/itens de vestuário. Para demonstrar a redução de 3 toras, este protocolo requer o uso de uma alta carga viral e um agente estabilizador (extrato de carne bovina) que pode não ser representativo da carga do solo para todas as situações.
Mini lavadoras e secadoras compactas foram selecionadas para otimizar o número de experimentos replicados que poderiam ser conduzidos em um ambiente com espaço restrito e para manter a esterilização do equipamento e do volume de água usado durante os experimentos gerenciável para a equipe do laboratório. Como resultado do uso da mini lavadora, as etapas de enxágue foram manuais em comparação com a maioria das aplicações de lavagem doméstica que são totalmente automatizadas. Também é importante lembrar que a lavagem à máquina predomina nos países desenvolvidos, mas a lavagem das mãos ainda é praticada em todo o mundo15. Além disso, alguns podem não ter acesso a água quente para lavagem, e outros secam manualmente roupas ao ar em vez de secagem à máquina. Essas diferenças nas práticas de lavagem não foram abordadas neste protocolo atual, mas poderiam ser facilmente investigadas com pequenas modificações, como a substituição das etapas de lavagem e secagem pelo uso de um balde e uma linha fechada.
Tem havido um foco mínimo na limpeza / desinfecção de coberturas faciais contaminadas por vírus e roupas de rua na literatura científica em grande escala. Mais comumente, estudos avaliam o desempenho filtratório de coberturas faciais após lavagem e secagem repetidas, mas não avaliam a eficácia da desinfecção viral27,28. Por exemplo, Clapp et al. avaliaram a eficiência de filtração ajustada de máscaras de pano e máscaras de procedimento modificadas e encontraram grande variação no desempenho, com modificações simples proporcionando maior ajuste e eficiência de filtração29. Outro estudo analisou a eficiência de filtragem de quatro máscaras de pano de diferentes materiais30, novamente com foco no controle da fonte ou proteção pessoal. Isso pode ser devido à falta de especialização tanto para a porção microbiana quanto para os testes mecânicos no mesmo laboratório. O protocolo aqui apresentado fornece uma avaliação da eficácia da desinfecção, bem como da degradação do material.
Existem vários métodos de descontaminação/desinfecção para proteção respiratória descartável (principalmente N95s) publicados recentemente na literatura científica31,32,33. O foco principal nos FFRs (por exemplo, N95s) é devido à proteção respiratória crítica que eles fornecem para os profissionais de saúde e outras ocupações da linha de frente. As principais tecnologias para a descontaminação do respirador envolveram peróxido de hidrogênio vaporizado (VHP), radiação germicida ultravioleta (UVGI) e calor úmido (vapor) para inativação do vírus. Viscusi et al. avaliaram cinco métodos de descontaminação para FFRs e UVGI; o óxido de etileno e o VHP foram os métodos de descontaminação mais promissores31. Fischer et al. avaliaram quatro diferentes métodos de descontaminação - luz UV, calor seco, etanol a 70% e VHP - por sua capacidade de reduzir a contaminação por SARS-CoV-2 e seu efeito na função do respirador N9532. Existem muitos estudos adicionais sobre tecnologias eficazes de descontaminação para FFRs que foram resumidos e publicados em 202033. No entanto, esses métodos especializados não são acessíveis ou projetados para serem usados com segurança pelo proprietário médio da casa ou da pequena empresa.
Este protocolo foi desenvolvido utilizando Phi6, um bacteriófago envelopado que é semelhante ao SARS-CoV-2, possui proteínas spike e é de tamanho semelhante (80-100 nm)34, para todos os testes. Como o Phi6 não é um patógeno conhecido, ele pode ser manipulado em um laboratório microbiológico geral de Nível 1 (BSL-1). A eficácia contra o Phi6 pode indicar a eficácia de outros vírus envelopados, no entanto, a verificação empírica para cada vírus de interesse é necessária35. Usando um agente viral semelhante e não patogênico, espera-se que este protocolo possa ser repetido em outros lugares e usado para estudar futuras epidemias/pandemias virais. Pesquisas futuras podem incluir o uso de desinfetantes (por exemplo, água sanitária), além de detergentes e um protocolo padronizado para lavagem das mãos e secagem de linha.
Disclosures
Não há conflitos de interesse conhecidos a serem divulgados.
Acknowledgments
A Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA), por meio de seu Escritório de Pesquisa e Desenvolvimento, dirigiu a pesquisa aqui descrita no EP-C-15-008 com a Jacobs Technology Inc. Foi revisto pela Agência, mas não reflecte necessariamente os pontos de vista da Agência. Nenhum endosso oficial deve ser inferido. A EPA não endossa a compra ou venda de quaisquer produtos ou serviços comerciais. Os autores gostariam de agradecer aos contratados da EPA Denise Aslett pela supervisão da microbiologia da EPA RTP, Brian Ford, Rachael Baartmans e Lesley Mendez Sandoval por seu trabalho neste projeto no laboratório de microbiologia da EPA RTP, Ramona Sherman por fornecer a revisão de garantia de qualidade da EPA e Worth Calfee e Shannon Serre por fornecerem revisões técnicas da EPA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freezer (- 80 °C) | ThermoFisher Scientific | FDE30086FA | |
| Hot Plate | VWR | 97042-714 | |
| Safety Pins (steel) | Singer | 319921 | |
| Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3525 | |
| SM buffer | Teknova, Hollister, CA | S0249 | |
| Syringe filter (0.2 μm) | Corning, Corning, NY | PES syringe filters, 431229 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Teknova, Hollister, CA | P0196, 10X PBS solution | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Autoclavable caps | DWK Life Sciences, Millville, NJ | KIM-KAP Caps, 73663-18 | |
| Autoclave | Steris | AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS | |
| Beef Extract | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA | P/N B4888-100g | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| Cell spreaders | Busse Hospital Disposables | 23600894 | |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004271 | Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge |
| Certified Timer | https://nist.time.gov/ | Not Applicable | |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Life Sciences | 352098 | Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AY509X33 | |
| Denim | Wrangler | Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW | |
| Detergent | Proctor and Gamble | Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068 | |
| Dextrose | Fisher | BP350 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Becton Dickinson | DF0819172 | |
| Dryer | Magic Chef | MCSDRY15W | |
| Face Coverings | Felina | Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4 | |
| Incubator (top agar) | Symphony | 414004-596 | |
| Laboratory Notebook | Scientific Notebook Company | 2001 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Media sterilization and dispensing system | Integra | Media Clave/Media Jet | |
| Petri Dishes (100 mm) | VWR | 25384-342 | |
| pH Meter | Orion/Oakton | STARA1110/EW-35634-35 | |
| pH Probe | Orion | 8157BNUMD | |
| pH Standards | Oakton | 00654-(00/04/08) | |
| Phi 6 and Pseudomonas syringae | Battelle Memorial Institute, Columbus, OH | Not Applicable | |
| Pipette & Tips | Rainin | (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382 | |
| Refrigerator | True Manufacturing Co., Inc. | GDM-33 | |
| Scrubs | Gogreen cool | PN: WS19100PT | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 57656 | |
| Stir Bar | Fisherbrand | 16-800-512 | |
| Tape Measure | Lufkin | PS3425 | |
| Test Tubes for Soft agar (14 mL) | Corning, Corning, NY | 352059 | |
| Thermometer | Fisherbrand | 14-983-19B | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T9410 | |
| Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags | STERIS | 62020TW | |
| Vortex (during the plating process) | Daigger Scientific, Inc | 3030A | Vortex Genie 2 |
| Vortex (for sample extraction) | Branson Ultrasonics | 58816-115 | Multi-Tube vortexer |
| Washer | Kuppet | KP1040600A | |
| Washer Sterilization | Steris | STERIS VHP ED1000 generator | |
| Yeast extract | Gibco | 212750 |
References
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