Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד mesenchyme המעי murine, כולל telocytes. אלה יכולים לשמש למספר יישומים, כגון תרבות משותפת עם עכבר או אורגנואידים שמקורם בבני אדם, כדי לתמוך בצמיחה ולשקף טוב יותר את המצב ברקמה המקורית.
Abstract
המעי הדק של מורין, או מזנכימה של המעי הגס, הוא הטרוגני מאוד, ומכיל סוגי תאים נפרדים כולל אנדותל דם ולימפה, עצבים, פיברובלסטים, מיופיברובלסטים, תאי שריר חלק, תאי מערכת החיסון, וסוג התא שזוהה לאחרונה, טלוציטים. טלוציטים הם תאים מזנכימליים ייחודיים בעלי תהליכים ציטופלזמיים ארוכים, המגיעים למרחק של עשרות עד מאות מיקרונים מגוף התא. טלוציטים התגלו לאחרונה כמרכיב נישה חשוב של תאי גזע במעי, המספק חלבוני Wnt החיוניים להתרבות תאי גזע ותאי אב.
למרות פרוטוקולים על איך לבודד mesenchyme מן המעי העכבר זמינים, לא ברור אם הליכים אלה מאפשרים בידוד יעיל של telocytes. בידוד יעיל של טלוציטים דורש התאמות פרוטוקול מיוחדות שיאפשרו דיסוציאציה של המגע החזק בין תא לתא בין טלוציטים לתאים שכנים מבלי להשפיע על יכולת הקיום שלהם. כאן, פרוטוקולים זמינים לבידוד מזנכימה במעי הותאמו כדי לתמוך בבידוד מוצלח ובתרבית של מזנכימה המכילה תפוקה גבוהה יחסית של טלוציטים חד-תאיים בני קיימא.
ניתן לנתח את התרחיף החד-תאי המתקבל באמצעות מספר טכניקות, כגון צביעת חיסון, מיון תאים, הדמיה וניסויי mRNA. פרוטוקול זה מניב מזנכימה עם תכונות אנטיגניות ותפקודיות שמורות מספיק של טלוציטים, וניתן להשתמש בו למספר יישומים. לדוגמה, הם יכולים לשמש לתרבות משותפת עם אורגנואידים שמקורם בעכבר או בבני אדם כדי לתמוך בצמיחת אורגנואידים ללא תוספת גורמי גדילה, כדי לשקף טוב יותר את המצב ברקמה המקורית.
Introduction
הן המעי הדק והן המעי הגס הם רקמות רגנרטיביות מאוד בשל נוכחותם של תאי גזע, אשר מתרבים ודלקים התחדשות1. המזנכימה המקיפה את האפיתל מספקת תמיכה מבנית ותפקודית על ידי הפרשת חלבוני מטריצה חוץ-תאיים ומולקולות איתות2, המווסתות את התגובה של תאי אפיתל. טלוציטים הם תאים מזנכימליים גדולים, שתוארו עד כה בעיקר במיקרוסקופ אלקטרונים כתאים בעלי תהליכים ציטופלזמיים ארוכים הנקראים טלופודים, החופפים ליצירת רשת מבוכית 3,4,5,6,7. לאחרונה, טלוציטים במעי המבטאים את גורם השעתוק FOXL1 התגלו כמרכיב נישה חשוב של תאי גזע המספק חלבוני Wnt, החיוניים לתפקוד תאי גזע ותאי אב. טלוציטים במעי מבטאים רמות גבוהות של חלבוני מסלול איתות מרכזיים כגון Wnt, Bmp, Tgfb ו-Shh, כמו גם גורמי גדילה רבים8.
בהתחשב בכך שטלוציטים הם מרכיב קריטי בנישה של תאי גזע in vivo, פיתוח פרוטוקולים לבידוד ולתרבית שלהם ex vivo יאפשר את השימוש בהם כמקור למולקולות איתות וגורמי גדילה, כדי לתמוך בגדילה ובהתמיינות ex vivo. באמצעות פרוטוקולים מבוססים היטב, ניתן לבודד קריפטות אפיתל של המעי הגס או המעי וליצור מבנים תלת-ממדיים המכונים אורגנואידים 9,10,11. אורגנואידים תלת מימדיים מייצגים כלי רב עוצמה לחקור הן את הפיזיולוגיה והן את הפתולוגיה של אפיתל המעי ex vivo. במערכת ex vivo, אורגנואידים מסתמכים על תוספת אקסוגנית של גורמים להישרדות וצמיחה10. ניתן לתרבית מזנכימה מבודדת הן עם אורגנואידים עכבריים והן עם אורגנואידים שמקורם בבני אדם ולהשתמש בהם כמקור לגורמי גדילה, במקום תוספת אקסוגנית, כדי לשקף טוב יותר את המצב ברקמה המקורית. לחקר telocytes ex vivo יש יתרונות רבים בחקירת התנהגויות תאיות נורמליות או פתולוגיות, מנגנונים של הומאוסטזיס רקמות, ואינטראקציות תא-תא בפירוט רב יותר.
למרות שקיימים פרוטוקולים המתארים כיצד לבודד מזנכימה ממעי העכבר, לא ברור אם הליכים אלה מביאים לבידוד יעיל של טלוציטים. בידוד מוצלח של טלוציטים דורש התאמות פרוטוקול מיוחדות שיאפשרו דיסוציאציה של המגע החזק בין התא לתאים השכנים, מבלי להשפיע על יכולת הקיום שלהם. כדי להתגבר על מגבלות אלה, מאמר זה מציג פרוטוקול שונה המניב באופן עקבי תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר המכיל כמות גבוהה יחסית של טלוציטים בעלי תכונות אנטיגניות ופונקציונליות שמורות מספיק. ניתן להשתמש בטלוציטים אלה למספר יישומים, כולל תרבות משותפת עם אורגנואידים שמקורם בעכבר או בבני אדם, לתמיכה בגדילה ללא תוספת גורמי גדילה. זה בתורו משקף טוב יותר את המצב ברקמה המקורית.
השתמשנו במודל8 של עכבר FOXL1-Cre: Rosa-mTmG, שבו הטלודיטים מסומנים בגרסה קשורה לקרום של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בירוק, המאפשר לחוקר לעקוב אחר הטלוציטים בשלמותם; כל התאים המזנכימליים האחרים מסומנים ב-tdTomato הקשור לקרום באדום. הפרוטוקול הנוכחי שונה מפרוטוקול בידוד מזנכימי מעיים12 כדי לשפר את תפוקת הטלוציטים ואת הכדאיות שלהם.
Protocol
כל הנהלים המתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטה העברית בירושלים.
1. הכנת ריאגנטים ומאגרים
- מחממים אמבט מים ל 37 מעלות צלזיוס.
- הכינו את כל הפתרונות בטבלה 1.
2. בידוד מזנכימה במעיים
- יש להרדים את העכבר על ידי שאיפתCO2 , ומיד אחריה נקע צוואר הרחם.
- הניחו את העכבר במצב שכיבה ורססו את הבטן ב-70% EtOH. הרימו את עור הבטן וחתכו לאורך קו האמצע כדי לחשוף את חלל הצפק (ראו איור 1 , I,II).
- אתר את הבטן, לחתוך מן הוושט, ולאט לאט למשוך את המעי מתוך חלל הצפק. נקו עודפי שומן ורקמת חיבור באמצעות מלקחיים. הוציאו את המעי הדק מהתריסריון לכ-0.5 ס"מ מהצקום (איור 1 , III,IV).
- לשטוף את המעי בכלי פטרי המכיל PBS סטרילי קר. בעזרת מספריים עם קצה כדורי, פתחו את צינור המעי לאורכו ושטפו את הצואה (איור 1 V). מעבירים את המעי לכלי חדש המכיל PBS קר טרי ושוטפים שוב.
- חותכים את המעי הדק למקטעים באורך 1 ס"מ ומעבירים לצינור חרוטי 15 מ"ל מלא 8 מ"ל PBS. נערו את הצינור ידנית במחזור אחד או שניים למשך דקה.
- מעבירים את המקטעים באמצעות מלקחיים לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל מלא ב-20 מ"ל של תמיסה A טרייה (ראה טבלה 1). הניחו את הצינורות באינקובטור שייקר מסלולי, בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, נערו את הצינור במרץ ביד בארבעה או חמישה מחזורים לשנייה למשך דקה אחת כדי לנתק את האפיתל.
- חזור על שלב 2.6 פעם אחת.
- מעבירים את המקטעים לצינור חדש של 50 מ"ל מלא ב-10 מ"ל PBS סטרילי, והופכים את הצינור במחזור אחד או שניים למשך דקה אחת.
- העבירו את המקטעים לצינור חדש של 15 מ"ל מלא ב-10 מ"ל PBS סטרילי, והטו למעלה ולמטה בעדינות במחזור אחד או שניים למשך 2 דקות.
- מתחת לארון בטיחות ביולוגית, השתמשו במלקחיים כדי להניח את המקטעים על מגבון מעבדה סטרילי כדי לייבש אותם. לאחר הייבוש, חותכים את הפלחים עוד יותר לחתיכות 0.5 ס"מ.
- מעבירים את המקטעים הקטנים בעזרת מלקחיים לצלחת בת 6 בארות מלאה ב-4 מ"ל של תמיסת עיכול שחוממה מראש לכל באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 50 דקות. נערו בעדינות את הצלחת ביד כל 20 דקות.
- מעבירים את המקטעים באמצעות פיפטה של פסטר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל מלא 4 מ"ל DMEM. נערו את הצינור ידנית בארבעה או חמישה מחזורים לשנייה למשך דקה אחת כדי לקבל מתלה חד-תאי.
- סנן את המתלה דרך מסננת 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה את התסנין ב 700 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי שאיפה ולהשהות מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של 2% FBS/PBS. צנטריפוגה את המתלה ב 700 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- להשליך את supernatant על ידי שאיפה, להשעות מחדש את גלולת התא עם 12 מ"ל של מדיום תרבית, וזרע 1 מ"ל לכל באר על שתי צלחות 6 באר. למחרת, לשטוף ולשאוף כל תאים גוססים ולהחליף את המדיום בילה עם מדיום טרי.
הערה: לתחזוקה אופטימלית של התרבית, מומלץ להחליף את המדיום כל יומיים. בהתאם לזן העכבר, הרקע הגנטי והגיל, נדרשים 4 ימים עד שבועיים כדי שהמזנכימה תהיה מוכנה לניסויים בתרבית משותפת. עבור ניסויים נוספים בתרביות משותפות, מזנכימה צריכה להגיע למפגש, ולהציג מורפולוגיה תאית שטוחה ומתוחה במלואה כפי שמוצג באיור 2. באופן כללי, תאים עם מורפולוגיה עגולה אינם קיימא או פונקציונליים.
איור 1: דיסקציה של עכבר . (I) הניחו את העכבר במצב שכיבה ורססו את הבטן ב-70% EtOH. הרימו את עור הבטן. (II) פתח את חלל הצפק לאורכו לאורך קו האמצע. (III) תוך כדי משיכה עדינה של הקיבה, יש לנתק את הוושט. (IV) צבטו את הקיבה ומשכו לאט את המעי. (V) הכניסו את קצה המספריים של קצה הכדור ללומן ופתחו את צינור המעי לאורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
3. השעיית מזנכימה למעבר או לתרבות משותפת
- להשעות מחדש את mesenchyme עם 2 מ"ל של 0.25% trypsin-0.5 mM EDTA / באר בצלחת 6 באר. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C. לאחר הדגירה, אם מספר תאים עדיין לא החלו להתנתק מהמנה, יש לדגור במשך 2 דקות נוספות.
- באמצעות מגרד התא, בעדינות לגרד את פני השטח של הבאר. מעבירים את תרחיף התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. מוסיפים 2 מ"ל של DMEM-F12/well ומקפצים בעדינות את המתלים למעלה ולמטה.
הערה: חשוב לא למלא את הצינור ביותר מ-50% מנפח הצינור. לכן מומלץ להשתמש בצינור חרוטי 15 מ"ל מלא 8 מ"ל תרחיף לכל שתי בארות. - ספור את התאים.
הערה: באר מתמזגת לחלוטין מניבה בין 2 × 10 6 תאים ו- 2.5 × 106 תאים. - לדלל את תרחיף התא כדי להשיג צפיפות זריעה של 3-5 × 105 תאים / מ"ל. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 500 × גרם ב 4 ° C ולהשליך את supernatant על ידי שאיפה זהירה.
הערה: חשוב להסיר כמה שיותר נוזלים. - משעים מחדש את כדורית התא בתרבית שחוממה מראש ובצלחת.
4. ניתוח ציטומטריית זרימה לטיהור טלוציטים
- השג את גלולת התא המזנכימלי (שלב 2.14). השהה מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של חיץ FACS וסנן דרך מסננת של 40 מיקרומטר.
- לדגור על תרחיף התא עם אלופיקוציאנין (APC) מצומד CD326 (1:100), CD45 (1:400) ו- CD31 (1:250) נוגדנים ב 400 μL של חיץ FACS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להוציא תאי אפיתל, חיסון ואנדותל, בהתאמה, מהמיון.
- שטפו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר FACS וסובבו כלפי מטה ב-700 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C. יש להשהות מחדש ב-400 מיקרוליטר של חיץ FACS ולהוסיף 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 5 mg/mL, 1:1,000) לניתוח ציטומטריית זרימה. שער התאים הבודדים לפי גובה SSC לפי שטח SSC. שער את התאים החיים של DAPI ושער החוצה CD45+/CD31+/CD326+ כדי למיין את הטלוציטים של GFP+, כפי שמוצג באיור 3.
Representative Results
פרוטוקול בידוד המזנכימה במעי הנ"ל שונה מהפרוטוקולים המתוארים הן ב- Wu et al.12 והן ב- Shoshkes-Carmel et al.8. הפרוטוקול המתואר ב- Wu et al. הוא עבור המעי הגס, וזה של Shoshkes-Carmel et al. הוא עבור המעי הדק, ולכן מצב העיכול שונה בשילוב אנזימים, ריכוז עבודה, וזמן הדגירה בין שני פרוטוקולים אלה. כאן, הפרוטוקול המתואר שימש בהצלחה כדי לבודד ולגדל תאים מזנכימליים במעי, כולל טלוציטים. בקצרה, ניתחנו את המעי הדק מהתריסריון לאילאום באמצעות עכבר FOXL1-Cre: Rosa-mTmG מודל8, שבו הטלוציטים סומנו בממברנה-GFP (ירוק), בעוד שתאים מזנכימליים אחרים סומנו בקרום-tdTomato (אדום). ניתקנו את הרקמה באמצעות אנזימים מעכלים וזרענו את המזנכימה בצלחת של 6 בארות. בעקבות הדיסוציאציה, הטלוציטים מאבדים את המאפיינים התאיים שלהם, מה שמראה מורפולוגיה תאית עגולה (איור 2A) אשר משתקפת בתת-כימות של תאי GFP+ ביום הראשון בהשוואה לימים הבאים (איור 2F). לאחר כמה ימים, הטלוציטים מציגים מורפולוגיית תא קטנה ומתוחה עם תהליכים תאיים קצרים (איור 2B,C). אולם 7-10 ימים לאחר הזריעה, הטלוציטים חוזרים למאפיינים התאיים שלהם, ומראים מורפולוגיה גדולה של תאים מתוחים עם תהליכים ציטופלזמיים ארוכים (איור 2D,E), והם מוכנים לשימוש בתרבית משותפת עם אורגנואידים ולתמוך בגדילה שלהם.
איור 2: מזנכימה בתרבית שבודדה מ-FOXL1Cre: Rosa-mTmG מעי עכבר. טלוציטים FOXL1+ מסומנים ב-GFP, בעוד שתאים מזנכימליים אחרים מסומנים ב-tdTomato+. (א-ה) תמונות מייצגות של מזנכימה מתורבתת שבודדה באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, מצופה בלוח בן 6 בארות, ומצולמת לאחר 1 (A), 4 (B,C) ו-7 (D,E) ימי תרבית. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (F) כימות יחס תאי GFP/tdTomato לשדה ראייה (אחוזים) בימים 1, 4 ו-7 של תרבית. קיצורים: FOXL1 = חלבון קופסת מזלג L1; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
כדי להעריך את פרוטוקול הבידוד הזה ולחשוף את הרכב התא, ניתחנו את תרחיף התא שהתקבל על-ידי ציטומטריית זרימה (איור 3). בסך הכל, 69% מהתאים שבודדו היו בני קיימא בהתבסס על צביעת DAPI (איור 3 III); מתוך התאים החיים, 60.9% ייצגו זיהום אפיתל ותאי חיסון ואנדותל (CD326+, CD45+ ו- CD31+; תרשים 3 IV). מקטע הטלוציטים (GFP+) התפזר מעל 100k ו-70k FSC ו-SSC, בהתאמה (איור 3 VI), וייצג כמעט 10% מהמזנכימה המגודרת (CD45-, CD326-, CD31-) (איור 3 V).
איור 3: אסטרטגיית ציטומטריית זרימה למיון טלוציטים ממזנכימת מעיים מבודדת של עכבר בוגר. (I) אירועי פיזור צד ברמה נמוכה לא נכללו. (II) תאים בודדים גודרו לפי גובה SSC לפי שטח SSC. (III) אירועי DAPI+ גודרו כדי להוציא תאים מתים מהמיון. (IV) אירועי DAPI- CD45+/CD326+/CD31+ הוצאו מגדריים כדי להוציא תאי חיסון, אפיתל ואנדותל, בהתאמה. (V) טלוציטים GFP+ היוו 10.3% מתאי DAPI- CD45-/CD326-/CD31. (VI) ניתוח Back-gating גילה את הקואורדינטות של טלוציטים GFP+ בתרשים FSC-A/SSC-A. קיצורים: SSC-A = אזור פיזור-שיא צד; FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי; SSC-H = גובה שיא פיזור בצד; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; APC = allophycocyanin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
במקביל, בודדנו גם מזנכימה ממעי עכבר מסוג פרא (WT) C57Bl6, שבו מקטע הטלוציטים הוערך באמצעות שילוב של סמני פני שטח שנותחו בעבר על מזנכימה שבודדה ממודל עכבר FOXL1Cre: Rosa-mTmG, שבו חלק הטלוציטים היה מסומן GFP. מצאנו שניתן להגדיר תת-קבוצה של הטלוציטים על-ידי צביעה חיובית ל-CD201 ולפודופלנין (GP38) (איור 4). יתר על כן, שימוש בסמנים אלה בצביעת מערכת החיסון יום אחד לאחר הבידוד והתרבית אישר שאף על פי שהתאים עדיין לא הציגו את המאפיינים התאיים שלהם, הם קיבלו את הביטוי של הסמנים המולקולריים האלה, והראו צביעה ב-70%-80% מהטלוציטים GFP+ (איור 5).
מקטע הטלוציטים המוגדר על ידי סמני פני השטח אינו זהה לזה המתקבל באמצעות עכבר הכתב המונע על ידי FOXL1; הטלוציט הוא הטרוגני מאוד ומכיל מספר תת-קבוצות. יש צורך לשלב את סמן פני השטח עם תיוג FOXL1 להגדרת טלוציטים. במעי הדק של עכבר FOXL1Cre: Rosa-mTmG, 60%-70% מתאי GFP+ חיוביים ל-CD201, ו-65%-80% חיוביים ל-GP38. בעת שימוש בסמנים על פני השטח, חשוב לציין כי אחסון לא מתאים ומחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים של נוגדנים מפחיתים את יעילות הקשירה. בנוסף, עיכול אנזימטי עלול לשבש את ביטוי סמן פני השטח. ראינו שהביטוי של CD138, פרוטאוגליקן טרנסממברנה המתבטא בתאים מזנכימליים, שובש ופחת מאוד עם הדיסוציאציה.
איור 4: ניתוח FACS של תרחיף מזנכימה חד-תאי שבודד מ-FOXL1Cre: Rosa-mTmG עכבר המעי הדק באמצעות הפרוטוקול הנוכחי. ניתוח FACS על (I-II) תאים בודדים, (III) DAPI-, (IV-VI) לין-(CD45-, CD326-, CD31-) תאי GFP+, מראה כי (VII) 65.3% מה- GFP+ ו- 31.2% מה- Tomato+ חיוביים ל- GP38, בעוד (VIII) 60.5% מה- GFP+ ו- 22.6% מה- Tomato+ חיוביים ל- CD201. קיצורים: SSC-A = אזור פיזור-שיא צד; FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי; SSC-H = גובה שיא פיזור בצד; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מזנכימה מתורבתת ביום הראשון, קבועה ומוכתמת עבור סמנים מזנכימליים. (A-D) תמונות מייצגות של מזנכימה מתורבתת מוכתמת עבור GP38. (פ-י) תמונות מייצגות של מזנכימה מתורבתת מוכתמת עבור CD201. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (E) כימות של Tomato+ GP38+ ו- Tomato+ CD201+ חיובי כפול מסך Tomato+. (J) כימות של GFP+ GP38+ ו-GFP+ CD201+ חיובי כפול מסך GFP+. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| פתרון א': | HBSS בתוספת FBS 2%, 1 mM DL-dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA (pH 8.0). | |||
| בינוני משלים 1640 (CM1640): | RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS, Pen/Strep (100 יחידות פניצילין/מ"ל, 100 מיקרוגרם סטרפטומיצין/מ"ל). | |||
| פתרון עיכול: | 100 U/mL collagenase סוג VIII, 75 מ"ג/מ"ל DNase I ב-4 מ"ל CM1640 שחומם מראש. הערה: יש להוסיף collagenase ו-DNase I ממש לפני תחילת תהליך העיכול. | |||
| מדיה תרבותית: | מדיה DMEM-F12 בתוספת 10 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין, 10 mM HEPES, גלוטמין, Pen / Strep (100 יחידות פניצילין/מ"ל, 100 מיקרוגרם סטרפטומיצין/מ"ל). | |||
| מאגר FACS: | PBS בתוספת FBS 5% ו- 1 mM EDTA. | |||
טבלה 1: הרכב כל הפתרונות המשמשים בפרוטוקול.
טבלה משלימה S1: ההבדלים העיקריים בין הפרוטוקול הנוכחי לבין שני פרוטוקולי הייחוס מפורטים כאן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
כאן, פיתחנו פרוטוקול לבידוד מזנכימה מהמעי הדק של עכבר באמצעות מודל העכבר FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG, המאפשר לחוקרים להבחין בין טלוציטים לתאים מזנכימליים אחרים. ישנם כמה שלבים קריטיים שיש לבצע בפרוטוקול זה. ראשית, חשוב לנער את הצינור במרץ בארבעה או חמישה מחזורים לשנייה, כדי להשליך את רוב תאי האפיתל במהלך בידוד מזנכימה. זמן הדגירה לעיכול אנזימטי חייב להיות אופטימלי בהתבסס על יעילות העיכול. במהלך הדגירה, יש לנער את הצלחות בעדינות אופקית למשך מספר שניות כל 20 דקות. ברגע שהרקמה הופכת להיות דמוית חוט להט, יש לעצור את הדגירה על ידי המשך שלב פרוטוקול 2.12. חשיפת הרקמה לזמני עיכול ארוכים עלולה לגרום לשיעור כדאיות ותנובה נמוכים של התא. לאחר עיכול אנזימטי, יש לנער את הצינור באופן מכני כדי לשחרר יותר תאים בודדים להשעיה; באופן אידיאלי, הפתרון צריך להיראות מעונן, ולא שברי רקמות צריך להיות גלוי. אם זה לא המקרה, להאריך את העיכול האנזימטי ל 60 דקות.
שמירה על תנאים סטריליים והימנעות מזיהום חיידקי פוטנציאלי היא אחד השלבים הקריטיים בעבודה עם תרבית רקמה ראשונית. יש להשתמש בכלי ניתוח סטריליים, ריאגנטים וחוצצים; יש להחליף כפפות, ולנקות את אזור העבודה כאשר העבודה עם בעלי חיים נעשתה. לאחר קבלת תרחיף התא, העבודה צריכה להתבצע תחת מכסה מנוע ביולוגי למינרי. לאחר הציפוי, יש לדגור על התאים למשך הלילה ללא הפרעות, שכן הדבר עלול להשפיע על ההיצמדות. בנוסף, חשוב להחליף את מדיום התרבית יום אחד לאחר הזריעה, שכן תאים שאינם דבקים עלולים להשפיע על כדאיות התרבית.
סמני פני השטח המשמשים בפרוטוקול זה הגיבו בחוזקה עם האפיטופים שלהם; עם זאת, ייתכן כי עיכול אנזימטי עשוי להשפיע על תגובתיות הקשירה, ולכן, תוצאות ניתוח FACS. מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא תת-ייצוג של שכבת השרירים. כדי לשפר את יעילות בידוד תאי שכבת השריר, אנו ממליצים על הפרדה מכנית של השריר משכבות הרירית, ועיכול אנזימטי נפרד לכל אחת מהשכבות. עבור ניתוק אפיתל מן stroma, או הפרדה מכנית או סוכני chelating (EDTA או DTT) ניתן להשתמש; עם זאת, עיכול אנזימטי להשגת תאים בודדים עבר אופטימיזציה בפרוטוקול זה.
בידוד של מזנכימת מעיים תואר בעבר8; גירוד הווילי עם כיסוי יגרום לאובדן של חלק מהמזנכימה לצד הווילוס, במיוחד תאים מזנכימליים של קצה וילוס כגון Lgr5+ וילוס טיפ טלוציטים13. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים ב-collagenase type VIII במקום dispase II ו-trypsin בשילוב עם DNase I, שכן collagenase משחרר תאים מזנכימליים בצורה יעילה יותר מהמטריצה. למרות שהוא מאריך את זמן העיבוד (>90 דקות לעומת 35 דקות), שני הפרוטוקולים הניבו שיעורי כדאיות תאים דומים; הפרוטוקול הנוכחי שיפר את התפוקה של התאים המזנכימליים בכלל, ובפרט של מקטע הטלוציטים. הפרוטוקול הנוכחי הניב כ-10% טלוציטים GFP+, שאושרו הן על ידי הדמיה והן על ידי ניתוח FACS, בעוד שהפרוטוקול הקודם הניב 2% טלוציטים GFP+. ההבדלים העיקריים בין הפרוטוקול הנוכחי לבין שני פרוטוקולי הייחוס מפורטים בטבלה משלימה S1.
הזיהוי של תאי FOXL1+GFP+ כטלוציטים תת-אפיתליאליים מבוסס על מחקרי in vivo . הצורך לפתח ולשנות פרוטוקולים זמינים לבידוד מזנכימה כדי לייצר תפוקות גבוהות יותר של טלוציטים, והידע כיצד להשיג זאת התבססו על הבנתנו את המבנה והתפקוד של טלוציטים FOXL1+ in vivo, כתאים גדולים עם הקרנות תאיות ארוכות הקשורות קשר הדוק לתאי אפיתל.
באופן מעניין, לטלוציטים מסוג GFP+ ex vivo יש מאפיינים תאיים הדומים לתכונות שלהם in vivo במעי, ולכן הם מוצעים לשמש כתמיכה אידיאלית לצמיחת אורגנואידים. למרות שפרוטוקול זה דן בעיקר בבידוד טלוציטים מהמעי הדק, פרוטוקול דומה עם שינויים קלים יכול לשמש ומיושם בקלות עבור תאים מזנכימליים של המעי הגס, כגון תא סטרומה מווסת מעיים MAP3K2 (MRISC)12 שתואר לאחרונה.
לאחר שהתאים המזנכימליים נמתחו והגיעו למפגש, הם יכולים לשמש למספר יישומים נוספים, כגון תרבית משותפת תלת-ממדית עם אורגנואידים שמקורם בעכבר או בבני אדם, באמצעות מטריג'ל ללא גורמי גדילה. המזנכימה יוצרת בדרך כלל רשת התומכת באופן מלא בהיווצרות אורגנואידים ובגדילה ללא תוספת של גורם גדילה אקסוגני. סטרומה המעי יש תכונות 3D מהותי שיכול לספק את אפיתל עם תמיכה מכנית14. לכן, פרוטוקול זה יכול לשמש גם לבידוד מזנכימה שתשולב בפיגום מודפס ביולוגית תלת-ממדית ותשמש לניסויים נוספים בקסנוגרפט.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (MSC מענק אישי) והתוכנית המשותפת בין הקרן הלאומית למדע והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
| APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
| APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
| APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
| Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
| DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
| DNase I | Sigma | DN25-1G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
| FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
| Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
| Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |
References
- Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., Näthke, I. Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).
- Kinchen, J., et al. Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease. Cell. 175 (2), 372-386 (2018).
- Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -S. TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).
- Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. Telocytes in endocardium: electron microscope evidence. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).
- Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. Telocytes in human skin—are they involved in skin regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).
- Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy. Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).
- Popescu, L. M., et al.
- Shoshkes-Carmel, M., et al. Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts. Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Wu, N., et al. MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche. Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).
- Bahar Halpern, K., et al. Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip. Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).
- Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G.
