Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung des murinen intestinalen Mesenchyms, einschließlich Telozyten, vor. Diese können für verschiedene Anwendungen verwendet werden, z. B. für die Kokultur mit Organoiden aus der Maus oder vom Menschen, um das Wachstum zu unterstützen und die Situation im ursprünglichen Gewebe besser widerzuspiegeln.
Abstract
Der murine Dünndarm oder Dickdarmmesenchym ist sehr heterogen und enthält verschiedene Zelltypen, darunter Blut- und Lymphendothel, Nerven, Fibroblasten, Myofibroblasten, glatte Muskelzellen, Immunzellen und den kürzlich identifizierten Zelltyp Telozyten. Telozyten sind einzigartige mesenchymale Zellen mit langen zytoplasmatischen Prozessen, die eine Entfernung von zehn bis Hunderten von Mikrometern vom Zellkörper erreichen. Telozyten haben sich in jüngster Zeit zu einer wichtigen Nischenkomponente der intestinalen Stammzellen entwickelt und liefern Wnt-Proteine, die für die Proliferation von Stamm- und Vorläuferzellen unerlässlich sind.
Obwohl Protokolle zur Isolierung von Mesenchym aus dem Mäusedarm verfügbar sind, ist nicht klar, ob diese Verfahren eine effiziente Isolierung von Telozyten ermöglichen. Die effiziente Isolierung von Telozyten erfordert spezielle Protokollanpassungen, die eine Dissoziation des starken Zell-Zell-Kontakts zwischen Telozyten und benachbarten Zellen ermöglichen, ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Hier wurden die verfügbaren intestinalen Mesenchym-Isolationsprotokolle angepasst, um die erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von Mesenchym mit einer relativ hohen Ausbeute an lebensfähigen einzelligen Telozyten zu unterstützen.
Die erhaltene Einzelzellsuspension kann durch verschiedene Techniken wie Immunfärbung, Zellsortierung, Bildgebung und mRNA-Experimente analysiert werden. Dieses Protokoll liefert Mesenchym mit ausreichend konservierten antigenen und funktionellen Eigenschaften von Telozyten und kann für verschiedene Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel können sie für die Kokultur mit Organoiden aus der Maus oder dem Menschen verwendet werden, um das Wachstum von Organoiden ohne Wachstumsfaktor-Supplementierung zu unterstützen, um die Situation im ursprünglichen Gewebe besser widerzuspiegeln.
Introduction
Sowohl der Dünndarm als auch der Dickdarm sind aufgrund des Vorhandenseins von Stammzellen, die sich vermehren und die Regeneration fördern, hochgradig regenerative Gewebe1. Das Mesenchym, das das Epithel umgibt, bietet strukturelle und funktionelle Unterstützung, indem es extrazelluläre Matrixproteine und Signalmoleküle2 sezerniert, die die Reaktion von Epithelzellen modulieren. Telozyten sind große mesenchymale Zellen, die bisher hauptsächlich durch Elektronenmikroskopie als Zellen mit langen zytoplasmatischen Prozessen, Telopoden genannt, beschrieben wurden, die sich überlappen, um ein labyrinthisches Netzwerkzu bilden 3,4,5,6,7. In jüngster Zeit haben sich intestinale Telozyten, die den Transkriptionsfaktor FOXL1 exprimieren, als wichtige Stammzell-Nischenkomponente herausgestellt, die Wnt-Proteine liefert, die für die Funktion von Stamm- und Vorläuferzellen entscheidend sind. Intestinale Telozyten exprimieren hohe Konzentrationen wichtiger Signalwegproteine wie Wnt, Bmp, Tgfb und Shh sowie viele Wachstumsfaktoren8.
Angesichts der Tatsache, dass Telozyten in vivo eine kritische Nischenkomponente für Stammzellen sind, wird die Entwicklung von Protokollen, um sie ex vivo zu isolieren und zu kultivieren, ihre Verwendung als Quelle für Signalmoleküle und Wachstumsfaktoren ermöglichen, um das Wachstum und die Differenzierung ex vivo zu unterstützen. Mit Hilfe etablierter Protokolle können Dickdarm- oder Darmepithelkrypten isoliert werden und 3D-Strukturen bilden, die als Organoidebekannt sind 9,10,11. Dreidimensionale Organoide stellen ein leistungsfähiges Werkzeug dar, um sowohl die Physiologie als auch die Pathologie des Darmepithels ex vivo zu untersuchen. In einem Ex-vivo-System sind Organoide auf exogene Supplementierung von Überlebens- und Wachstumsfaktoren angewiesen10. Isoliertes Mesenchym kann sowohl mit Organoiden aus der Maus als auch aus dem Menschen kultiviert und anstelle einer exogenen Supplementierung als Quelle für Wachstumsfaktoren verwendet werden, um die Situation im ursprünglichen Gewebe besser widerzuspiegeln. Die Untersuchung von Telozyten ex vivo hat zahlreiche Vorteile bei der genaueren Untersuchung normaler oder pathologischer zellulärer Verhaltensweisen, Mechanismen der Gewebehomöostase und Zell-Zell-Interaktionen.
Obwohl Protokolle zur Verfügung stehen, die beschreiben, wie Mesenchym aus dem Darm der Maus isoliert werden kann, ist nicht klar, ob diese Verfahren zu einer effizienten Isolierung von Telozyten führen. Die erfolgreiche Isolierung von Telozyten erfordert spezielle Protokollanpassungen, die eine Dissoziation des starken Zell-Zell-Kontakts zwischen den Telozyten und benachbarten Zellen ermöglichen, ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wird in dieser Arbeit ein modifiziertes Protokoll vorgestellt, das konsistent eine hochgradig lebensfähige Einzelzellsuspension ergibt, die eine relativ hohe Menge an Telozyten mit ausreichend konservierten antigenen und funktionellen Eigenschaften enthält. Diese Telozyten können für verschiedene Anwendungen verwendet werden, einschließlich der Kokultur mit Organoiden aus der Maus oder dem Menschen, um das Wachstum ohne Supplementierung mit Wachstumsfaktoren zu unterstützen. Dies wiederum spiegelt die Situation im ursprünglichen Gewebe besser wider.
Wir verwendeten das FOXL1-Cre: Rosa-mTmG-Mausmodell8, bei dem Telozyten mit einer membrangebundenen Version des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in Grün markiert sind, was es dem Forscher ermöglicht, Telozyten in ihrer Gesamtheit zu verfolgen; alle anderen mesenchymalen Zellen sind mit einer membrangebundenen tdTomate in Rot markiert. Das aktuelle Protokoll wurde von einem Protokoll zur Isolierung des intestinalen Mesenchyms12 modifiziert, um die Telozytenausbeute und -lebensfähigkeit zu verbessern.
Protocol
Alle unten beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Hebräischen Universität Jerusalem genehmigt.
1. Herstellung von Reagenzien und Puffern
- Ein Wasserbad auf 37 °C vorheizen.
- Bereiten Sie alle Lösungen in Tabelle 1 vor.
2. Intestinale Mesenchym-Isolierung
- Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Inhalation, unmittelbar gefolgt von einer Zervixluxation.
- Legen Sie die Maus in Rückenlage und besprühen Sie den Bauch mit 70% EtOH. Heben Sie die Bauchhaut an und schneiden Sie in Längsrichtung entlang der Mittellinie, um die Bauchhöhle freizulegen (siehe Abbildung 1 I,II).
- Lokalisieren Sie den Magen, schneiden Sie ihn aus der Speiseröhre und ziehen Sie den Darm langsam aus der Bauchhöhle. Reinigen Sie überschüssiges Fett und Bindegewebe mit einer Pinzette. Schneiden Sie den Dünndarm aus dem Zwölffingerdarm auf etwa 0,5 cm aus dem Blinddarm heraus (Abbildung 1 III, IV).
- Waschen Sie den Darm in einer Petrischale, die kaltes steriles PBS enthält. Öffnen Sie den Darmschlauch mit einer Kugelschere in Längsrichtung und waschen Sie den Kot aus (Abbildung 1 V). Übertragen Sie den Darm in eine neue Schüssel mit frischem kaltem PBS und waschen Sie ihn erneut.
- Schneiden Sie den Dünndarm in 1 cm lange Segmente und geben Sie ihn in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das mit 8 ml PBS gefüllt ist. Schütteln Sie das Röhrchen manuell mit einem oder zwei Zyklen/s für 1 Minute.
- Die Segmente werden mit einer Pinzette in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt, das mit 20 ml frisch hergestellter Lösung A gefüllt ist (siehe Tabelle 1). Legen Sie die Röhrchen für 20 Minuten in einen Orbital-Schüttel-Inkubator bei 37 °C. Schütteln Sie das Röhrchen nach der Inkubation 1 Minute lang mit vier oder fünf Zyklen/s kräftig von Hand, um das Epithel zu dissoziieren.
- Wiederholen Sie Schritt 2.6 einmal.
- Übertragen Sie die Segmente in ein neues 50-ml-Röhrchen, das mit 10 ml sterilem PBS gefüllt ist, und drehen Sie das Röhrchen 1 Minute lang mit einem oder zwei Zyklen/s um.
- Übertragen Sie die Segmente in ein neues 15-ml-Röhrchen, das mit 10 ml sterilem PBS gefüllt ist, und kippen Sie sie 2 Minuten lang sanft mit einem oder zwei Zyklen/s nach oben und unten.
- Legen Sie die Segmente unter einer Sicherheitswerkbank mit einer Pinzette auf ein steriles Labortuch, um sie zu trocknen. Schneiden Sie die Segmente nach dem Trocknen weiter in 0,5 cm große Stücke.
- Übertragen Sie die kleinen Segmente mit einer Pinzette in eine 6-Well-Platte, die mit 4 ml vorgewärmter Aufschlusslösung pro Well gefüllt ist. Bei 37 °C 50 min inkubieren. Schütteln Sie den Teller alle 20 Minuten vorsichtig von Hand.
- Übertragen Sie die Segmente mit einer Pasteurpipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das mit 4 ml DMEM gefüllt ist. Schütteln Sie das Röhrchen manuell mit vier oder fünf Zyklen/s für 1 Minute, um eine einzellige Suspension zu erhalten.
- Die Suspension wird durch ein 100-μm-Sieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen filtriert. Das Filtrat wird bei 700 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Der Überstand wird durch Aspiration verworfen und das Zellpellet in 5 ml 2% FBS/PBS resuspendiert. Die Suspension wird bei 700 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Entsorgen Sie den Überstand durch Aspiration, resuspendieren Sie das Zellpellet mit 12 ml Kulturmedium und säen Sie 1 ml pro Vertiefung auf zwei 6-Well-Platten. Waschen und aspirieren Sie am nächsten Tag alle absterbenden Zellen und ersetzen Sie das verbrauchte Medium durch frisches Medium.
HINWEIS: Für eine optimale Aufrechterhaltung der Kultur wird empfohlen, das Medium alle 2 Tage zu wechseln. Je nach Mausstamm, genetischem Hintergrund und Alter werden 4 Tage bis 2 Wochen benötigt, bis das Mesenchym für Co-Kultur-Experimente bereit ist. Für weitere Co-Kultur-Experimente sollte das Mesenchym eine Konfluenz erreichen und eine flache und vollständig gestreckte Zellmorphologie aufweisen, wie in Abbildung 2 gezeigt. Im Allgemeinen sind Zellen mit runder Morphologie nicht lebensfähig oder funktionsfähig.
Abbildung 1: Dissektion der Maus. (I) Legen Sie die Maus in Rückenlage und besprühen Sie den Bauch mit 70% EtOH. Heben Sie die Bauchhaut an. (II) Öffnen Sie die Peritonealhöhle in Längsrichtung entlang der Mittellinie. (III) Während Sie sanft am Magen ziehen, trennen Sie die Speiseröhre. (IV) Kneifen Sie den Magen und ziehen Sie den Darm langsam heraus. (V) Führen Sie die Spitze der Kugelschere in das Lumen ein und öffnen Sie den Darmschlauch in Längsrichtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Mesenchym-Resuspension für die Passage oder Co-Kultur
- Resuspendieren Sie das Mesenchym mit 2 ml 0,25% Trypsin-0,5 mM EDTA/Well in einer 6-Well-Platte. 5 min bei 37 °C inkubieren. Wenn sich nach der Inkubation noch nicht mehrere Zellen von der Schale gelöst haben, inkubieren Sie weitere 2 Minuten.
- Kratzen Sie mit einem Zellschaber vorsichtig die Oberfläche des Bohrlochs ab. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 2 ml DMEM-F12/Well hinzu und pipettieren Sie die Suspension vorsichtig auf und ab.
HINWEIS: Es ist wichtig, das Röhrchen nicht mit mehr als 50% des Röhrchenvolumens zu überfüllen. Es wird daher empfohlen, für jeweils zwei Vertiefungen ein konisches 15-ml-Röhrchen zu verwenden, das mit 8 ml Suspension gefüllt ist. - Zählen Sie die Zellen.
HINWEIS: Eine vollständig konfluente Vertiefung ergibt zwischen 2 × 106 Zellen und 2,5 × 106 Zellen. - Verdünnen Sie die Zellsuspension, um eine Aussaatdichte von 3-5 × 105 Zellen/ml zu erreichen. 5 min bei 500 × g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand durch vorsichtiges Absaugen verwerfen.
HINWEIS: Es ist wichtig, so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. - Resuspendieren Sie das Zellpellet in vorgewärmtem Kulturmedium und Platte.
4. Durchflusszytometrische Analyse zur Telozytenreinigung
- Erhalten Sie das mesenchymale Zellpellet (Schritt 2.14). Das Zellpellet wird in 1 ml FACS-Puffer resuspendiert und durch ein 40-μm-Sieb filtriert.
- Inkubieren Sie die Zellsuspension mit Allophycocyanin (APC)-konjugierten CD326 (1:100), CD45 (1:400) und CD31 (1:250) Antikörpern in 400 μl FACS-Puffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur, um Epithel-, Immun- bzw. Endothelzellen von der Sorte auszuschließen.
- Waschen Sie die Zellen unter Zugabe von 1 ml FACS-Puffer und schleudern Sie sie bei 700 × g für 5 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie 400 μl FACS-Puffer und fügen Sie 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 5 mg/ml, 1:1.000) für Durchflusszytometrie-Analysen hinzu. Gate die einzelnen Zellen entsprechend der SSC-Höhe nach SSC-Fläche. Gate der DAPI-Live-Zellen und Gate aus CD45+/CD31+/CD326+, um die GFP+-Telozyten zu sortieren, wie in Abbildung 3 gezeigt.
Representative Results
Das obige intestinale Mesenchym-Isolationsprotokoll wurde von Protokollen modifiziert, die sowohl in Wu et al.12 als auch in Shoshkes-Carmel et al.8 beschrieben sind. Das in Wu et al. beschriebene Protokoll ist für den Dickdarm, und das von Shoshkes-Carmel et al. ist für den Dünndarm, daher unterscheidet sich die Verdauungsbedingung in der Enzymkombination, der Arbeitskonzentration und der Inkubationszeit zwischen diesen beiden Protokollen. Hier wurde das beschriebene Protokoll erfolgreich verwendet, um intestinale mesenchymale Zellen, einschließlich Telozyten, zu isolieren und zu kultivieren. Kurz gesagt, wir präparierten den Dünndarm vom Zwölffingerdarm bis zum Ileum mit einem FOXL1-Cre: Rosa-mTmG-Mausmodell8, bei dem die Telozyten mit Membran-GFP (grün) markiert waren, während andere mesenchymale Zellen mit membran-tdTomato (rot) markiert wurden. Wir dissoziierten das Gewebe mit Hilfe von Verdauungsenzymen und säten das Mesenchym in eine 6-Well-Platte. Nach der Dissoziation verlieren die Telozyten ihre zellulären Eigenschaften und zeigen eine runde zelluläre Morphologie (Abbildung 2A), was sich in der Unterquantifizierung der GFP+-Zellen an Tag 1 im Vergleich zu den folgenden Tagen widerspiegelt (Abbildung 2F). Nach einigen Tagen zeigen die Telozyten eine kleine gestreckte Zellmorphologie mit kurzen zellulären Fortsätzen (Abbildung 2B,C). 7-10 Tage nach der Aussaat erlangen die Telozyten jedoch ihre zellulären Eigenschaften zurück und zeigen eine große, gestreckte Zellmorphologie mit langen zytoplasmatischen Prozessen (Abbildung 2D, E) und sind bereit, in Kokultur mit Organoiden verwendet zu werden und ihr Wachstum zu unterstützen.
Abbildung 2: Kultiviertes Mesenchym, isoliert aus FOXL1Cre: Rosa-mTmG-Mausdarm. FOXL1+-Telozyten sind mit GFP markiert, während andere mesenchymale Zellen tdTomato+ sind. (A-E) Repräsentative Bilder von kultiviertem Mesenchym, das mit dem aktuellen Protokoll isoliert, in einer 6-Well-Platte plattiert und nach 1 (A), 4 (B, C) und 7 (D, E) Kulturtagen abgebildet wurde. Maßstabsbalken = 100 μm. (F) Quantifizierung des GFP/tdTomatenzellverhältnisses pro Sichtfeld (Prozentsätze) an den Tagen 1, 4 und 7 der Kultur. Abkürzungen: FOXL1 = Forkhead box L1 Protein; GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Um dieses Isolationsprotokoll auszuwerten und die Zellzusammensetzung aufzudecken, analysierten wir die erhaltene Zellsuspension mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 3). Insgesamt waren 69% der isolierten Zellen auf der Grundlage der DAPI-Färbung lebensfähig (Abbildung 3 III); Von den lebenden Zellen stellten 60,9 % eine Epithelkontamination sowie Immun- und Endothelzellen dar (CD326+, CD45+ und CD31+; Abbildung 3 IV). Die Telozytenfraktion (GFP+) streute über 100k bzw. 70k FSC bzw. SSC (Abbildung 3 VI) und repräsentierte fast 10% des Gated Mesenchyms (lebendes CD45-, CD326-, CD31-) (Abbildung 3 V).
Abbildung 3: Durchflusszytometrie-Gating-Strategie zur Sortierung von Telozyten aus isoliertem intestinalogischem Mesenchym adulter Mäuse. (I) Low-Level-Seitenstreuereignisse wurden ausgeschlossen. (II) Einzelne Zellen wurden nach SSC-Höhe nach SSC-Fläche gesteuert. (III) DAPI+-Ereignisse wurden ausgeschlossen, um tote Zellen von der Sortierung auszuschließen. (IV) DAPI-CD45+/CD326+/CD31+-Ereignisse wurden ausgeschlossen, um Immun-, Epithel- bzw. Endothelzellen auszuschließen. (V) GFP+-Telozyten machten 10,3% der DAPI-, CD45-/CD326-/CD31-Zellen aus. (VI) Die Back-Gating-Analyse ergab die Koordinaten von GFP+-Telozyten in einem FSC-A/SSC-A-Diagramm. Abkürzungen: SSC-A = side scatter-peak area; FSC-A = Vorwärts-Streu-Peak-Fläche; SSC-H = seitliche Streupeakhöhe; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; GFP = grün fluoreszierendes Protein; APC = Allophycocyanin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Parallel dazu isolierten wir Mesenchym aus einem Wildtyp-(WT) C57Bl6-Mausdarm, in dem die Telozytenfraktion unter Verwendung einer Kombination von Oberflächenmarkern bewertet wurde, die zuvor an Mesenchym analysiert wurden, das aus einem FOXL1Cre: Rosa-mTmG-Mausmodell isoliert wurde, in dem die Telozytenfraktion GFP-markiert war. Wir fanden heraus, dass eine Untergruppe der Telozyten durch eine positive Färbung von CD201 und Podoplanin (GP38) definiert werden kann (Abbildung 4). Darüber hinaus bestätigte die Verwendung dieser Marker bei der Immunfärbung 1 Tag nach der Isolierung und Kultur, dass die Zellen, obwohl sie ihre zellulären Eigenschaften noch nicht aufwiesen, die Expression dieser molekularen Marker erhielten und eine Färbung in 70%-80% der GFP+ -Telozyten zeigten (Abbildung 5).
Der durch Oberflächenmarker definierte Telozytenanteil ist nicht identisch mit dem, der mit der FOXL1-gesteuerten Reportermaus erhalten wird. Der Telozyten ist sehr heterogen und enthält mehrere Untergruppen. Für die Telozytendefinition ist es notwendig, den Oberflächenmarker mit der FOXL1-Markierung zu kombinieren. Im Dünndarm der FOXL1Cre: Rosa-mTmG-Maus sind 60%-70% der GFP+ -Zellen CD201-positiv und 65%-80% positiv für GP38. Bei der Verwendung von Oberflächenmarkern ist zu beachten, dass unsachgemäße Lagerung und wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen von Antikörpern die Bindungseffizienz verringern. Darüber hinaus kann die enzymatische Verdauung die Expression von Oberflächenmarkern stören. Wir beobachteten, dass die Expression von CD138, einem Transmembranproteoglykan, das auf mesenchymalen Zellen exprimiert wird, gestört war und mit der Dissoziation stark abnahm.
Abbildung 4: FACS-Analyse einer einzelligen Mesenchym-Suspension, die aus FOXL1Cre: Rosa-mTmG-Maus-Dünndarm unter Verwendung des aktuellen Protokolls isoliert wurde. FACS-Analyse an (I-II) Einzelzellen, (III) DAPI-, (IV-VI) Lin-(CD45-, CD326-, CD31-) GFP+-Zellen, die zeigt, dass (VII) 65,3 % der GFP+ und 31,2 % der Tomate+ positiv für GP38 sind, während (VIII) 60,5 % der GFP+ und 22,6 % der Tomato+ positiv für CD201 sind. Abkürzungen: SSC-A = side scatter-peak area; FSC-A = Vorwärts-Streu-Peak-Fläche; SSC-H = seitliche Streupeakhöhe; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; GFP = grün fluoreszierendes Protein; APC = Allophycocyanin; PE = Phycoerythrin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Kultiviertes Mesenchym am ersten Tag, fixiert und gefärbt für mesenchymale Marker. (A-D) Repräsentative Bilder von kultiviertem Mesenchym, das für GP38 gefärbt wurde. (F-I) Repräsentative Bilder von kultiviertem Mesenchym, gefärbt für CD201. Maßstabsbalken = 100 μm. (E) Quantifizierung von Tomate+ GP38+ und Tomate+ CD201+ doppelt positiv aus der gesamten Tomate+. (J) Quantifizierung von GFP+ GP38+ und GFP+ CD201+ doppelt positiv aus dem gesamten GFP+. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Lösung A: | HBSS ergänzt mit 2% FBS, 1 mM DL-Dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA (pH 8,0). | |||
| Ergänzt mittel 1640 (CM1640): | RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10% FBS, Pen/Streptokokken (100 Einheiten Penicillin/ml, 100 μg Streptomycin/ml). | |||
| Aufschlusslösung: | 100 U/ml Kollagenase Typ VIII, 75 mg/ml DNase I in 4 ml vorgewärmtem CM1640. Hinweis: Fügen Sie Kollagenase und DNase I hinzu, bevor der Verdauungsvorgang beginnt. | |||
| Nährmedien: | DMEM-F12-Medien ergänzt mit 10 μg/ml Gentamicin, 10 mM HEPES, Glutamin, Pen/Streptokokken (100 Einheiten Penicillin/ml, 100 μg Streptomycin/ml). | |||
| FACS-Puffer: | PBS ergänzt mit 5% FBS und 1 mM EDTA. | |||
Tabelle 1: Zusammensetzung aller im Protokoll verwendeten Lösungen.
Ergänzende Tabelle S1: Die wichtigsten Unterschiede zwischen dem aktuellen Protokoll und den beiden Referenzprotokollen sind hier aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Hier haben wir ein Protokoll entwickelt, um Mesenchym aus dem Dünndarm der Maus mit dem Mausmodell FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG zu isolieren, das es Forschern ermöglicht, Telozyten von anderen mesenchymalen Zellen zu unterscheiden. Es gibt einige wichtige Schritte, die in diesem Protokoll zu befolgen sind. Zunächst ist es wichtig, das Röhrchen mit vier oder fünf Zyklen/s kräftig zu schütteln, um die Mehrheit der Epithelzellen während der Mesenchymisolierung zu verwerfen. Die Inkubationszeit für den enzymatischen Aufschluss muss auf der Grundlage der Verdauungseffizienz optimiert werden. Während der Inkubation sind die Platten alle 20 Minuten für einige Sekunden horizontal leicht zu schütteln. Sobald das Gewebe filamentartig wird, muss die Inkubation gestoppt werden, indem mit Protokollschritt 2.12 fortgefahren wird. Das Aussetzen des Gewebes für lange Verdauungszeiten kann zu einer niedrigen Zellviabilitätsrate und Ausbeute führen. Nach der enzymatischen Verdauung muss das Röhrchen mechanisch geschüttelt werden, um mehr Einzelzellen in Suspension freizusetzen. Idealerweise sollte die Lösung trüb aussehen und keine Gewebefragmente sichtbar sein. Ist dies nicht der Fall, verlängern Sie den enzymatischen Aufschluss auf 60 min.
Die Aufrechterhaltung steriler Bedingungen und die Vermeidung einer möglichen bakteriellen Kontamination ist einer der entscheidenden Schritte bei der Arbeit mit primären Gewebekulturen. Es müssen sterile Präparierwerkzeuge, Reagenzien und Puffer verwendet werden. Handschuhe müssen gewechselt werden und der Arbeitsbereich muss gereinigt werden, wenn mit Tieren gearbeitet wird. Sobald die Zellsuspension erhalten ist, sollte die Arbeit unter einer laminaren biologischen Haube durchgeführt werden. Nach der Beschichtung sollten die Zellen über Nacht ohne Störungen inkubiert werden, da dies die Adhärenz beeinträchtigen kann. Darüber hinaus ist es wichtig, das Nährmedium einen Tag nach der Aussaat auszutauschen, da nicht adhärente Zellen die Lebensfähigkeit der Kultur beeinträchtigen können.
Oberflächenmarker, die in diesem Protokoll verwendet wurden, reagierten stark mit ihren Epitopen; Es ist jedoch möglich, dass der enzymatische Aufschluss die Bindungsreaktivität und damit die FACS-Analyseergebnisse beeinflussen kann. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist die Unterrepräsentation der Muskelschicht. Um die Effizienz der Zellisolierung der Muskelschicht zu verbessern, empfehlen wir die mechanische Trennung des Muskels von den Schleimhautschichten und die getrennte enzymatische Verdauung für jede der Schichten. Zur Dissoziation des Epithels vom Stroma können entweder mechanische Trenn- oder Chelatbildner (EDTA oder DTT) verwendet werden; Die enzymatische Verdauung zur Gewinnung einzelner Zellen wurde jedoch in diesem Protokoll optimiert.
Die Isolierung des intestinalen Mesenchyms wurde bereits beschrieben8; Das Abkratzen der Zotten mit einem Deckglas würde den Verlust eines Teils des Mesenchyms neben den Zotten verursachen, insbesondere der mesenchymalen Zellen der Zottenspitze wie Lgr5+ Zottenspitzen-Telozyten13. In diesem Protokoll verwenden wir Kollagenase Typ VIII anstelle von Dispase II und Trypsin in Kombination mit DNase I, da Kollagenase Mesenchymzellen effizienter aus der Matrix freisetzt. Obwohl es die Verarbeitungszeit verlängert (>90 min vs. 35 min), ergaben die beiden Protokolle ähnliche Zellviabilitätsraten; Das aktuelle Protokoll verbesserte die Ausbeute der mesenchymalen Zellen im Allgemeinen und der Telozytenfraktion im Besonderen. Das aktuelle Protokoll ergab etwa 10 % GFP+-Telozyten, was sowohl durch Visualisierung als auch durch FACS-Analyse bestätigt wurde, während das frühere Protokoll 2 % GFP+-Telozyten ergab. Die Hauptunterschiede zwischen dem aktuellen Protokoll und den beiden Referenzprotokollen sind in der ergänzenden Tabelle S1 aufgeführt.
Die Identifizierung von FOXL1+GFP+ -Zellen als subepitheliale Telozyten basiert auf in vivo Studien. Die Notwendigkeit, verfügbare Mesenchym-Isolationsprotokolle zu entwickeln und zu modifizieren, um höhere Ausbeuten an Telozyten zu erzielen, und das Wissen, wie dies erreicht werden kann, basierte auf unserem Verständnis der Struktur und Funktion von FOXL1+ -Telozyten in vivo als große Zellen mit langen zellulären Projektionen, die eng mit Epithelzellen verbunden sind.
Interessanterweise weisen ex vivo GFP+-Telozyten zelluläre Eigenschaften auf, die ihren Merkmalen in vivo im Darm ähneln, und werden daher als ideale Unterstützung für das Wachstum von Organoiden vorgeschlagen. Obwohl in diesem Protokoll hauptsächlich die Telozytenisolierung aus dem Dünndarm behandelt wird, kann ein ähnliches Protokoll mit geringfügigen Modifikationen verwendet und leicht auf Dickdarm-Mesenchymzellen angewendet werden, wie z. B. die kürzlich beschriebene MAP3K2-regulierte Darmstromazelle (MRISC)12.
Sobald sich die mesenchymalen Zellen gedehnt haben und die Konfluenz erreicht haben, können sie für verschiedene zusätzliche Anwendungen verwendet werden, wie z. B. die 3D-Kokultur mit Organoiden aus der Maus oder dem Menschen, wobei wachstumsfaktorfreies Matrigel verwendet wird. Das Mesenchym bildet typischerweise ein Netzwerk, das die Bildung und das Wachstum von Organoiden ohne exogene Wachstumsfaktor-Supplementierung vollständig unterstützt. Das intestinale Stroma weist intrinsische 3D-Merkmale auf, die das Epithel mechanisch stützen können14. Daher kann dieses Protokoll auch verwendet werden, um Mesenchym zu isolieren, um es in ein 3D-Bio-gedrucktes Gerüst zu integrieren und für weitere Xenograft-Experimente zu verwenden.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Israel Science Foundation (MSC Personal Grant) und das gemeinsame Programm der Israel Science Foundation und der National Natural Science Foundation of China unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
| APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
| APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
| APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
| Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
| DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
| DNase I | Sigma | DN25-1G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
| FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
| Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
| Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |
References
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