Summary
Her præsenterer vi en protokol til isolering af murine intestinal mesenchym, herunder telocytter. Disse kan bruges til flere applikationer, såsom samkultur med mus eller menneskeafledte organoider, for at understøtte vækst og bedre afspejle situationen i det oprindelige væv.
Abstract
Den murin tyndtarmen, eller kolon mesenchyme, er meget heterogen, der indeholder forskellige celletyper, herunder blod og lymfatisk endotel, nerver, fibroblaster, myofibroblaster, glatte muskelceller, immunceller, og den nyligt identificerede celletype, telocytter. Telocytter er unikke mesenkymale celler med lange cytoplasmatiske processer, der når en afstand på titusinder til hundreder af mikron fra cellekroppen. Telocytter er for nylig opstået som en vigtig tarmstamcellenichekomponent, der giver Wnt-proteiner, der er afgørende for stam- og stamcelleproliferation.
Selvom protokoller om, hvordan man isolerer mesenchym fra musetarmen, er tilgængelige, er det ikke klart, om disse procedurer tillader effektiv isolering af telocytter. Isolering af telocytter effektivt kræver specielle protokoljusteringer, der muliggør dissociation af den stærke celle-cellekontakt mellem telocytter og naboceller uden at påvirke deres levedygtighed. Her blev tilgængelige intestinale mesenchymeisoleringsprotokoller justeret for at understøtte den vellykkede isolering og dyrkning af mesenchyme, der indeholder et relativt højt udbytte af levedygtige enkeltcelle-telocytter.
Den opnåede enkeltcellesuspension kan analyseres ved flere teknikker, såsom immunfarvning, cellesortering, billeddannelse og mRNA-eksperimenter. Denne protokol giver mesenchym med tilstrækkeligt konserverede antigene og funktionelle egenskaber af telocytter og kan bruges til flere applikationer. For eksempel kan de bruges til samkultur med muse- eller menneskeafledte organoider for at understøtte organoidvækst uden vækstfaktortilskud for bedre at afspejle situationen i det oprindelige væv.
Introduction
Både tyndtarmen og tyktarmen er stærkt regenerative væv på grund af tilstedeværelsen af stamceller, som formerer sig og brænder regenerering1. Mesenchymet omkring epitelet giver strukturel og funktionel støtte ved at udskille ekstracellulære matrixproteiner og signalmolekyler2, som modulerer responsen af epitelceller. Telocytter er store mesenkymale celler, hovedsageligt beskrevet hidtil ved elektronmikroskopi som celler med lange cytoplasmatiske processer kaldet telopoder, som overlapper hinanden for at skabe et labyrintisk netværk 3,4,5,6,7. For nylig er intestinale telocytter, der udtrykker transkriptionsfaktoren FOXL1, opstået som en vigtig stamcellenichekomponent, der leverer Wnt-proteiner, som er afgørende for stam- og stamcellefunktion. Intestinale telocytter udtrykker høje niveauer af vigtige signalvejsproteiner såsom Wnt, Bmp, Tgfb og Shh samt mange vækstfaktorer8.
Da telocytter er en kritisk stamcellenichekomponent in vivo, vil udvikling af protokoller til isolering og dyrkning af dem ex vivo gøre det muligt at anvende dem som en kilde til signalmolekyler og vækstfaktorer for at understøtte vækst og differentiering ex vivo. Ved hjælp af veletablerede protokoller kan kolon- eller tarmepitelkrypter isoleres og danne 3D-strukturer kendt som organoider 9,10,11. Tredimensionelle organoider repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at undersøge både fysiologien og patologien i tarmepitelet ex vivo. I et ex vivo-system er organoider afhængige af eksogent tilskud af faktorer for overlevelse og vækst10. Isoleret mesenchyme kan dyrkes med både mus og humanafledte organoider og anvendes som en kilde til vækstfaktorer i stedet for eksogent tilskud for bedre at afspejle situationen i det oprindelige væv. Undersøgelse af telocytter ex vivo har adskillige fordele ved at undersøge normal eller patologisk cellulær adfærd, mekanismer for vævshomeostase og celle-celleinteraktioner mere detaljeret.
Selvom protokoller, der beskriver, hvordan man isolerer mesenchym fra musetarmen, er tilgængelige, er det ikke klart, om disse procedurer resulterer i effektiv isolering af telocytter. Vellykket isolering af telocytter kræver særlige protokoljusteringer, der muliggør dissociation af den stærke celle-cellekontakt mellem telocytterne og nabocellerne uden at påvirke deres levedygtighed. For at overvinde disse begrænsninger præsenterer dette papir en modificeret protokol, der konsekvent giver en meget levedygtig, enkeltcellesuspension indeholdende en relativt høj mængde telocytter med tilstrækkeligt konserverede antigene og funktionelle egenskaber. Disse telocytter kan bruges til flere applikationer, herunder samkultur med muse- eller humanafledte organoider, for at understøtte vækst uden vækstfaktortilskud. Dette afspejler igen bedre situationen i det oprindelige væv.
Vi brugte FOXL1-Cre: Rosa-mTmG-musemodel8, hvor telocytter er mærket med en membranbundet version af grønt fluorescerende protein (GFP) i grønt, hvilket gør det muligt for efterforskeren at følge telocytter i deres helhed; alle de andre mesenkymale celler er mærket med en membranbundet tdTomat i rødt. Den nuværende protokol blev ændret fra en protokol, der isolerer intestinal mesenchyme12 for at forbedre telocytudbyttet og levedygtigheden.
Protocol
Alle procedurer beskrevet nedenfor blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved det hebraiske universitet i Jerusalem.
1. Fremstilling af reagenser og buffere
- Forvarm et vandbad til 37 °C.
- Forbered alle opløsningerne i tabel 1.
2. Intestinal mesenchymeisolering
- Aflive musen ved CO2 indånding, umiddelbart efterfulgt af cervikal dislokation.
- Placer musen i liggende stilling og spray maven med 70% EtOH. Løft mavehuden og skær i længderetningen langs midterlinjen for at blotlægge bughulen (se figur 1 I, II).
- Find maven, skåret fra spiserøret, og træk langsomt tarmen ud af bughulen. Rens overskydende fedt og bindevæv ved hjælp af tang. Tyndtarmen beskattes fra tolvfingertarmen til ca. 0,5 cm fra cecum (figur 1 III, IV).
- Vask tarmen i en petriskål, der indeholder koldt sterilt PBS. Brug en kuglespidssaks til at åbne tarmrøret i længderetningen og vaske afføringen ud (figur 1 V). Overfør tarmen til en ny skål, der indeholder frisk kold PBS og vask igen.
- Skær tyndtarmen i 1 cm lange segmenter og overfør til et 15 ml konisk rør fyldt med 8 ml PBS. Ryst slangen manuelt i en eller to cyklusser/s i 1 min.
- Overfør segmenterne med pincet til et 50 ml konisk rør fyldt med 20 ml frisklavet opløsning A (se tabel 1). Rørene anbringes i en orbital shaker-inkubator ved 37 °C i 20 min. Efter inkubation rystes røret kraftigt med hånden i fire eller fem cyklusser/s i 1 minut for at adskille epitelet.
- Gentag trin 2.6 én gang.
- Overfør segmenterne til et nyt 50 ml rør fyldt med 10 ml sterilt PBS, og vend røret på en eller to cyklusser/s i 1 min.
- Overfør segmenterne til et nyt 15 ml rør fyldt med 10 ml sterilt PBS, og vip forsigtigt op og ned i en eller to cyklusser/s i 2 minutter.
- Under et biosikkerhedsskab skal du bruge tang til at placere segmenterne på en steril laboratorieserviet for at tørre dem ud. Når de er tørret, skæres segmenterne yderligere i stykker på 0,5 cm.
- Overfør de små segmenter ved hjælp af tang til en 6-brønds plade fyldt med 4 ml forvarmet fordøjelsesopløsning pr. Brønd. Der inkuberes ved 37 °C i 50 min. Ryst forsigtigt pladen i hånden hvert 20. minut.
- Overfør segmenterne ved hjælp af en Pasteur-pipette til et 15 ml konisk rør fyldt med 4 ml DMEM. Ryst røret manuelt i fire eller fem cyklusser / s i 1 minut for at få en enkeltcellesuspension.
- Filtrer suspensionen gennem en 100 μm sil i et 50 ml konisk rør. Filtratet centrifugeres ved 700 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres ved aspiration og cellepellet resuspenderes i 5 ml 2% FBS/PBS. Suspensionen centrifugeres ved 700 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres ved aspiration, cellepelletsen resuspenderes med 12 ml dyrkningsmedium, og der sås 1 ml pr. hul på to plader med 6 huller. Den følgende dag vaskes og aspireres eventuelle døende celler og erstattes med det brugte medium med frisk medium.
BEMÆRK: For optimal vedligeholdelse af kulturen anbefales det at skifte medium hver 2. dag. Afhængigt af musestammen, den genetiske baggrund og alderen er der brug for 4 dage til 2 uger for mesenchymet at være klar til co-kultureksperimenter. For yderligere co-kultur eksperimenter bør mesenchyme nå sammenløb, der viser flad og fuldt strakt cellulær morfologi som vist i figur 2. Generelt er celler med rund morfologi ikke levedygtige eller funktionelle.
Figur 1: Dissektion af mus . (I) Placer musen i liggende stilling og spray maven med 70% EtOH. Løft maveskindet. (II) Åbn bughulen i længderetningen langs midterlinjen. (III) Mens du forsigtigt trækker maven, skal du afskære spiserøret. (IV) Klem maven og træk langsomt tarmen ud. (V) Sæt spidsen af kuglesaksen i lumen, og åbn tarmrøret i længderetningen. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Mesenchyme resuspension til passaging eller co-kultur
- Resuspender mesenchymet med 2 ml 0,25% trypsin-0,5 mM EDTA / brønd i en 6-brønds plade. Der inkuberes i 5 minutter ved 37 °C. Efter inkubation, hvis flere celler ikke allerede er begyndt at løsne sig fra skålen, inkuberes i yderligere 2 minutter.
- Brug en celleskraber til forsigtigt at skrabe overfladen af brønden. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør. Tilsæt 2 ml DMEM-F12/brønd, og pipetter forsigtigt suspensionen op og ned.
BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at overfylde røret med mere end 50% af rørets volumen. Det anbefales derfor at bruge et 15 ml konisk rør fyldt med 8 ml suspension for hver to huller. - Tæl cellerne.
BEMÆRK: En fuldt flydende brønd giver mellem 2 × 10 6 celler og 2,5 × 106 celler. - Fortynd cellesuspensionen for at opnå en såtæthed på 3-5 × 105 celler/ml. Der centrifugeres i 5 minutter ved 500 × g ved 4 °C, og supernatanten kasseres ved omhyggelig aspiration.
BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne så meget væske som muligt. - Resuspender cellepelleten i forvarmet dyrkningsmedium og plade.
4. Flowcytometrianalyse til telocytoprensning
- Få mesenkymalcellepellet (trin 2.14). Resuspender cellepillen i 1 ml FACS-buffer og filtrer gennem en 40 μm si.
- Inkuber cellesuspensionen med allophycocyanin (APC)-konjugerede CD326 (1:100), CD45 (1:400) og CD31 (1:250) antistoffer i 400 μL FACS-buffer i 15 minutter ved stuetemperatur for at udelukke henholdsvis epitel-, immun- og endotelceller fra sorteringen.
- Cellerne vaskes ved at tilsætte 1 ml FACS-buffer og centrifugeres ned ved 700 × g i 5 minutter ved 4 °C. Der resuspenderes i 400 μL FACS-buffer, og der tilsættes 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 5 mg/ml, 1:1.000) til flowcytometrianalyser. Gate de enkelte celler i henhold til SSC-højden efter SSC-område. Gate DAPI- live-cellerne og gate out CD45+/CD31+/CD326+ for at sortere GFP+ telocytterne, som vist i figur 3.
Representative Results
Ovennævnte intestinale mesenchymisolationsprotokol blev modificeret fra protokoller beskrevet i både Wu et al.12 og Shoshkes-Carmel et al.8. Protokollen beskrevet i Wu et al. er for tyktarmen, og den af Shoshkes-Carmel et al. er for tyndtarmen, således at fordøjelsestilstanden er forskellig i enzymkombination, arbejdskoncentration og inkubationstid mellem disse to protokoller. Her er den beskrevne protokol med succes blevet anvendt til at isolere og dyrke intestinale mesenkymale celler, herunder telocytter. Kort fortalt dissekerede vi tyndtarmen fra tolvfingertarmen til ileum ved hjælp af en FOXL1-Cre: Rosa-mTmG mus model8, hvor telocytterne blev mærket med membran-GFP (grøn), mens andre mesenkymale celler blev mærket med membran-tdTomat (rød). Vi dissocierede vævet ved hjælp af fordøjende enzymer og frøede mesenchymet i en 6-brønds plade. Efter dissociation mister telocytter deres cellulære egenskaber og viser rund cellulær morfologi (figur 2A), hvilket afspejles i underkvantificeringen af GFP + celler på dag 1 sammenlignet med de følgende dage (figur 2F). Efter et par dage udviser telocytter en lille strakt cellemorfologi med korte cellulære processer (figur 2B, C). Imidlertid genvinder telocytter 7-10 dage efter såning deres cellulære egenskaber og viser stor strakt cellemorfologi med lange cytoplasmatiske processer (figur 2D, E) og er klar til at blive brugt i samkultur med organoider og understøtter deres vækst.
Figur 2: Dyrket mesenchyme isoleret fra FOXL1Cre: Rosa-mTmG musetarm. FOXL1+ telocytter er mærket med GFP, mens andre mesenkymale celler er tdTomato+. (A-E) Repræsentative billeder af dyrket mesenchyme isoleret ved hjælp af den aktuelle protokol, belagt i en 6-brønds plade og afbildet efter 1 (A), 4 (B, C) og 7 (D, E) kulturdage. Skalastænger = 100 μm. (F) Kvantificering af GFP/tdTomatcelleforholdet pr. synsfelt (procent) på dag 1, 4 og 7 i kulturen. Forkortelser: FOXL1 = Gaffelhovedkasse L1-protein; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at evaluere denne isolationsprotokol og afsløre cellesammensætningen analyserede vi den opnåede cellesuspension ved flowcytometri (figur 3). Samlet set var 69% af de isolerede celler levedygtige baseret på DAPI-farvning (figur 3 III); ud af de levende celler repræsenterede 60,9% epitelkontaminering og immun- og endotelceller (CD326+, CD45+ og CD31+; Figur 3 IV). Telocytfraktionen (GFP +) spredt over henholdsvis 100k og 70k FSC og SSC (figur 3 VI) og repræsenterede næsten 10% fra det lukkede mesenchym (live CD45-, CD326-, CD31-) (figur 3 V).
Figur 3: Flowcytometrigatingstrategi til sortering af telocytter fra isoleret voksent musetarmmesenchym. (I) Sidespredningshændelser på lavt niveau blev udelukket. (II) Enkeltceller blev lukket i henhold til SSC-højde efter SSC-areal. (III) DAPI+ hændelser blev lukket ud for at udelukke døde celler fra sorteringen. (IV) DAPI- CD45+/CD326+/CD31+ hændelser blev lukket ud for at udelukke henholdsvis immun-, epitel- og endotelceller. (V) GFP+ telocytter tegnede sig for 10,3% af DAPI-CD45-/CD326-/CD31-cellerne. (VI) Back-gating-analyse afslørede koordinaterne for GFP+ telocytter i et FSC-A/SSC-A-plot. Forkortelser: SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; SSC-H = sidespredning-tophøjde; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; GFP = grønt fluorescerende protein; APC = allophycocyanin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Parallelt isolerede vi også mesenchym fra en vildtype (WT) C57Bl6 musetarm, hvor telocytfraktionen blev evalueret ved hjælp af en kombination af overflademarkører, der tidligere var analyseret på mesenchym isoleret fra en FOXL1Cre: Rosa-mTmG-musemodel, hvor telocytfraktionen var GFP-mærket. Vi fandt ud af, at en delmængde af telocytterne kan defineres ved en positiv farvning til CD201 og podoplanin (GP38) (figur 4). Desuden bekræftede brugen af disse markører i immunfarvning 1 dag efter isolering og kultur, at selvom cellerne endnu ikke udviste deres cellulære egenskaber, opnåede de ekspressionen af disse molekylære markører, der viste farvning i 70% -80% af GFP + telocytterne (figur 5).
Telocytfraktionen defineret af overflademarkører er ikke identisk med den, der opnås ved anvendelse af den FOXL1-drevne reportermus; Telocytten er meget heterogen og indeholder flere undergrupper. Det er nødvendigt at kombinere overflademarkøren med FOXL1-mærkning til telocytdefinition. I tyndtarmen i FOXL1Cre: Rosa-mTmG-musen er 60% -70% af GFP + -cellerne CD201-positive, og 65% -80% er positive for GP38. Ved brug af overflademarkører er det vigtigt at bemærke, at uhensigtsmæssig opbevaring og gentagne fryse-optøningscyklusser af antistoffer reducerer bindingseffektiviteten. Derudover kan enzymatisk fordøjelse forstyrre overflademarkørekspression. Vi observerede, at ekspressionen af CD138, en transmembranproteoglycan udtrykt på mesenkymale celler, blev forstyrret og stærkt reduceret med dissociation.
Figur 4: FACS-analyse af enkeltcellet mesenchymesuspension isoleret fra FOXL1Cre: Rosa-mTmG musetyndtarmen ved hjælp af den aktuelle protokol. FACS-analyse af (I-II) enkeltceller, (III) DAPI-, (IV-VI) Lin-(CD45-, CD326-, CD31-) GFP+-celler, der viser, at (VII) 65,3 % af GFP+ og 31,2 % af Tomat+ er positive for GP38, mens (VIII) 60,5 % af GFP+ og 22,6 % af Tomat+ er positive for CD201. Forkortelser: SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; SSC-H = sidespredning-tophøjde; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; GFP = grønt fluorescerende protein; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Dag et dyrket mesenchyme, fastgjort og farvet til mesenkymale markører. (A-D) Repræsentative billeder af dyrket mesenchyme farvet til GP38. (F-I) Repræsentative billeder af kultiveret mesenchyme farvet til CD201. Skalastænger = 100 μm. (E) Kvantificering af tomat+ GP38+ og tomat+ CD201+ dobbeltpositiv fra total tomat+. (J) Kvantificering af GFP+ GP38+ og GFP+ CD201+ dobbelt-positive fra total GFP+. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Løsning A: | HBSS suppleret med 2% FBS, 1 mM DL-dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA (pH 8,0). | |||
| Suppleret medium 1640 (CM1640): | RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS, Pen/Strep (100 enheder penicillin/ml, 100 μg streptomycin/ml). | |||
| Fordøjelse løsning: | 100 E/ml collagenase type VIII, 75 mg/ml DNase I i 4 ml forvarmet CM1640. Bemærk: Tilsæt collagenase og DNase I lige før fordøjelsesproceduren starter. | |||
| Kulturmedier: | DMEM-F12 medier suppleret med 10 μg/ml gentamicin, 10 mM HEPES, glutamin, Pen/Strep (100 enheder penicillin/ml, 100 μg streptomycin/ml). | |||
| FACS-buffer: | PBS suppleret med 5% FBS og 1 mM EDTA. | |||
Tabel 1: Sammensætning af alle de opløsninger, der anvendes i protokollen.
Supplerende tabel S1: De vigtigste forskelle mellem den nuværende protokol og de to referenceprotokoller er anført her. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Her udviklede vi en protokol til at isolere mesenchyme fra musetyndtarmen ved hjælp af FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG-musemodellen, som gør det muligt for forskere at skelne telocytter fra andre mesenkymale celler. Der er nogle kritiske trin, der skal følges i denne protokol. For det første er det vigtigt at ryste røret kraftigt ved fire eller fem cyklusser / s for at kassere størstedelen af epitelceller under mesenkymisolering. Inkubationstiden for enzymatisk fordøjelse skal optimeres baseret på fordøjelseseffektivitet. Under inkubationen skal pladerne forsigtigt rystes vandret i nogle få sekunder hvert 20. minut. Når vævet bliver filamentlignende, skal inkubationen stoppes ved at fortsætte til protokoltrin 2.12. Udsættelse af vævet for lange fordøjelsestider kan resultere i lav cellelevedygtighed og udbytte. Efter enzymatisk fordøjelse skal røret rystes mekanisk for at frigive flere enkeltceller i suspension; Ideelt set skal opløsningen se overskyet ud, og ingen vævsfragmenter skal være synlige. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du forlænge den enzymatiske fordøjelse til 60 min.
At holde sterile forhold og undgå potentiel bakteriel kontaminering er et af de kritiske trin, når man arbejder med primær vævskultur. Der skal anvendes sterile dissekeringsværktøjer, reagenser og buffere; Handsker skal ændres, og arbejdsområdet skal rengøres, når der arbejdes med dyr. Når cellesuspensionen er opnået, skal arbejdet udføres under en laminær biologisk hætte. Efter plettering skal cellerne inkuberes natten over uden forstyrrelser, da dette kan påvirke vedhæftningen. Derudover er det vigtigt at udskifte dyrkningsmediet en dag efter såning, da ikke-klæbende celler kan påvirke dyrkningens levedygtighed.
Overflademarkører, der anvendes i denne protokol, reagerede stærkt med deres epitoper; Det er dog muligt, at enzymatisk fordøjelse kan påvirke bindingsreaktivitet og derfor FACS-analyseresultater. En anden begrænsning af denne protokol er underrepræsentationen af muskulaturen. For at forbedre effektiviteten af muskellagscelleisolering anbefaler vi mekanisk adskillelse af musklen fra slimhindelagene og separat enzymatisk fordøjelse for hvert af lagene. Til dissociering af epitelet fra stromaen kan enten mekaniske separations- eller chelateringsmidler (EDTA eller DTT) anvendes; Imidlertid er enzymatisk fordøjelse til opnåelse af enkeltceller blevet optimeret i denne protokol.
Isolering af intestinal mesenchym er tidligere beskrevet8; skrabning af villi med en coverslip ville medføre tab af noget mesenchyme sammen med villus, især villus tip mesenkymale celler såsom Lgr5 + villus tip telocytter13. I denne protokol bruger vi collagenase type VIII i stedet for dispase II og trypsin i kombination med DNase I, da collagenase mere effektivt frigiver mesenkymale celler fra matrixen. Selvom det forlænger behandlingstiden (>90 min vs. 35 min), gav de to protokoller lignende cellelevedygtighedshastigheder; Den nuværende protokol forbedrede udbyttet af mesenkymale celler generelt og mere specifikt af telocytfraktionen. Den nuværende protokol gav ca. 10% GFP+ telocytter, bekræftet både ved visualisering og ved FACS-analyse, mens den tidligere protokol gav 2% GFP+ telocytter. De væsentligste forskelle mellem den nuværende protokol og de to referenceprotokoller er anført i supplerende tabel S1.
Identifikationen af FOXL1+GFP+ celler som subepitelocytter er baseret på in vivo studier. Behovet for at udvikle og modificere tilgængelige mesenchymeisolationsprotokoller for at producere højere udbytter af telocytter og viden om, hvordan man opnår dette, var baseret på vores forståelse af strukturen og funktionen af FOXL1+ telocytter in vivo, som store celler med lange cellulære fremspring tæt knyttet til epitelceller.
Interessant nok udviser ex vivo GFP + telocytter cellulære egenskaber svarende til deres egenskaber in vivo i tarmen og foreslås derfor at tjene som en ideel støtte til organoidvækst. Selvom denne protokol hovedsageligt diskuterer telocytisolering fra tyndtarmen, kan en lignende protokol med mindre modifikation anvendes og let anvendes til kolon mesenkymale celler, såsom den nyligt beskrevne MAP3K2-regulerede intestinale stromale celle (MRISC)12.
Når mesenkymale celler har strakt sig og nået sammenløb, kan de bruges til flere yderligere applikationer, såsom 3D-cokultur med mus- eller menneskeafledte organoider ved hjælp af vækstfaktorfri Matrigel. Mesenchymet danner typisk et netværk, der fuldt ud understøtter organoid dannelse og vækst uden eksogent vækstfaktortilskud. Tarmstroma har iboende 3D-funktioner, der kan give epitelet mekanisk støtte14. Derfor kan denne protokol også bruges til at isolere mesenchyme, der skal integreres i et 3D bio-printet stillads og bruges til yderligere xenografteksperimenter.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Israel Science Foundation (MSC personlig bevilling) og det fælles program mellem Israel Science Foundation og National Natural Science Foundation of China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
| APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
| APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
| APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
| Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
| DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
| DNase I | Sigma | DN25-1G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
| FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
| Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
| Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |
References
- Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., Näthke, I. Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).
- Kinchen, J., et al. Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease. Cell. 175 (2), 372-386 (2018).
- Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -S. TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).
- Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. Telocytes in endocardium: electron microscope evidence. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).
- Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. Telocytes in human skin—are they involved in skin regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).
- Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy. Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).
- Popescu, L. M., et al.
- Shoshkes-Carmel, M., et al. Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts. Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Wu, N., et al. MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche. Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).
- Bahar Halpern, K., et al. Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip. Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).
- Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G.
