Summary
الفرخ هو كائن نموذجي فعال من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليه ومتاح على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من الدراسات. هنا ، يتم تفصيل سلسلة من البروتوكولات لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الأذن الداخلية للطيور وتجديدها.
Abstract
تدرك الأذن الداخلية الصوت وتحافظ على التوازن باستخدام القوقعة والدهليز. يقوم بذلك باستخدام نوع خلية حسية ميكانيكية مخصصة تعرف باسم خلية الشعر. أدت الأبحاث الأساسية في الأذن الداخلية إلى فهم عميق لكيفية عمل خلايا الشعر ، وكيف يمكن أن يؤدي عدم التنظيم إلى فقدان السمع والدوار. بالنسبة لهذا البحث ، كان الماوس هو النظام النموذجي البارز. ومع ذلك ، فقدت الفئران ، مثل جميع الثدييات ، القدرة على استبدال خلايا الشعر. وبالتالي ، عند محاولة فهم العلاجات الخلوية لاستعادة وظيفة الأذن الداخلية ، يمكن أن توفر الدراسات التكميلية في أنواع الفقاريات الأخرى مزيدا من الأفكار. الظهارة السمعية للطيور ، الحليمة القاعدية (BP) ، هي ورقة من الظهارة تتكون من خلايا شعرية حسية ميكانيكية (HCs) مقحمة بخلايا داعمة (SCs). على الرغم من اختلاف البنية التشريحية للحليمة القاعدية وقوقعة الثدييات ، إلا أن الآليات الجزيئية لتطور الأذن الداخلية والسمع متشابهة. هذا يجعل الحليمة القاعدية نظاما مفيدا ليس فقط للدراسات المقارنة ولكن أيضا لفهم التجديد. هنا ، نصف تقنيات التشريح والتلاعب للأذن الداخلية للدجاج. تظهر هذه التقنية طرق تثبيط الجزيئات الجينية والصغيرة ، والتي توفر أداة قوية لدراسة الآليات الجزيئية لتطور الأذن الداخلية. في هذه الورقة ، نناقش في تقنيات التثقيب الكهربائي للبيض لاضطراب الحليمة القاعدية وراثيا باستخدام حذف CRIPSR-Cas9 ، يليه تشريح الحليمة القاعدية. نوضح أيضا ثقافة أعضاء BP والاستخدام الأمثل لمصفوفات الثقافة ، لمراقبة تطور الظهارة وخلايا الشعر.
Introduction
الأذن الداخلية لجميع الفقاريات مشتقة من ظهارة بسيطة تعرف باسم placode 1,2. سيؤدي ذلك إلى ظهور جميع العناصر الهيكلية وأنواع الخلايا اللازمة لتحويل المعلومات الحسية الميكانيكية المرتبطة بإدراك السمع والتوازن. خلايا الشعر (HCs) ، المستشعر المهدبي للأذن الداخلية ، محاطة بخلايا داعمة (SCs). تنقل HCs المعلومات إلى الدماغ الخلفي السمعي من خلال الخلايا العصبية للعصب القحفي الثامن. يتم إنشاؤها أيضا من placode3 الأذنية. يتم تحقيق النقل الأولي للصوت على السطح القمي ل HC السمعي ، من خلال حزمة شعر حساسة ميكانيكيا4. يتم التوسط في ذلك من خلال نتوءات معدلة قائمة على الأكتين تسمى stereocilia، والتي يتم ترتيبها في نمط درجمتدرج 5. بالإضافة إلى ذلك ، ينظم الكيليوم الأولي المعدل ، المسمى kinocilium ، تكوين حزمة الشعر وهو مجاور لأطول صف من الأهداب المجسمة6،7،8. تعد بنية الأهداب الفراغية أمرا بالغ الأهمية لهذا الدور في تحويل المحفزات الميكانيكية المشتقة من الطاقة الصوتية إلى إشارات عصبية كهربائية9. يمكن أن يؤدي تلف HC السمعي من خلال الشيخوخة أو العدوى أو صدمة الأذن الصوتية أو الصدمة السامة للأذن إلى فقدان السمع الجزئي أو الكامل الذي لا رجعة فيه في الثدييات10.
تم اقتراح علاجات الاستبدال الخلوي التي قد تصلح مثل هذا الضرر11,12. كان نهج هذا البحث هو فهم التطور الطبيعي لخلية شعر الثدييات والسؤال عما إذا كان يمكن إعادة بدء برامج التطوير في الخلايا الشبيهة بالسلف التي قد تكون موجودة داخل الأذن الداخلية13. كان النهج الثاني هو النظر خارج الثدييات ، إلى الفقاريات غير الثديية التي يحدث فيها تجديد قوي لخلايا الشعر السمعية ، مثل الطيور14,15. في الطيور ، يحدث تجديد خلايا الشعر في الغالب من خلال إزالة تمايز الخلية الداعمة إلى حالة تشبه السلف ، يليها الانقسام الانقسامي غير المتماثل لتوليد خلية شعرية وخلية داعمة16. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أيضا التمايز المباشر للخلية الداعمة لتوليد خلية شعرية17.
في حين أن آليات التطور السمعي للطيور تظهر أوجه تشابه كبيرة مع تلك الخاصة بالثدييات ، إلا أن هناك اختلافات18. يظهر تمايز HC و SC في الفرخ BP من اليوم الجنيني (E) 7 ، ويصبح أكثر وضوحا بمرور الوقت. بواسطة E12 ، يمكن تصور الحليمة القاعدية ذات النمط الجيد والاستقطاب الجيد (BP) ، وبواسطة E17 يمكن رؤية خلايا الشعر المتطورةجيدا 19. توفر هذه النقاط الزمنية نوافذ على آليات التمايز والزخرفة والقطبية ، بالإضافة إلى نضوج خلايا الشعر. من المهم فهم ما إذا كانت هذه الآليات محفوظة أو متباينة ، لأنها توفر نظرة ثاقبة للتماثل العميق لأصول خلايا الشعر الحسية الميكانيكية.
هنا ، نعرض مجموعة من التقنيات التي يتم إجراؤها في المراحل الجنينية المبكرة والمتأخرة لدراسة العمليات الخلوية مثل الانتشار ، وتحديد مصير ، والتمايز ، والأنماط ، والصيانة طوال تطور عضو الأذن الداخلية. هذا يكمل البروتوكولات الأخرى لفهم تطور الأذن الداخلية في زراعة النباتات20،21،22. نناقش أولا إدخال الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الخارجي في سلائف BP داخل كيس الأذن E3.5 باستخدام التثقيب الكهربائي للبيض. على الرغم من أن التلاعب الجيني يمكن أن يوفر رؤى قيمة ، إلا أن الأنماط الظاهرية المتولدة على هذا النحو يمكن أن تكون متعددة الاتجاهات وبالتالي مربكة. هذا صحيح بشكل خاص أثناء تطور الأذن الداخلية في وقت لاحق ، حيث تلعب العمليات الأساسية مثل إعادة تشكيل الهيكل الخلوي أدوارا متعددة في انقسام الخلايا ، وتشكل الأنسجة ، والتخصص الخلوي. نقدم بروتوكولات للتثبيط الدوائي في النباتات المستزرعة ، والتي توفر مزايا في التحكم في الجرعة وتوقيت العلاج ومدته ، مما يوفر معالجة زمانية مكانية دقيقة لآليات النمو.
يمكن استخدام طرق زراعة الأعضاء المختلفة اعتمادا على مدة علاج المثبطات الصغيرة. نوضح هنا طريقتين لزراعة الأعضاء تسمح بإلقاء نظرة ثاقبة على التشكل الظهاري والتخصص الخلوي. طريقة لثقافة 3D باستخدام الكولاجين كمصفوفة لثقافة قناة القوقعة تمكن من زراعة قوية والتصور الحي ل BP النامية. لفهم تكوين الأهداب المجسمة ، نقدم طريقة زراعة الغشاء بحيث يتم استزراع الأنسجة الظهارية على مصفوفة صلبة تمكن نتوءات الأكتين من النمو بحرية. تسمح كلتا الطريقتين بالمعالجة النهائية مثل تصوير الخلايا الحية ، والكيمياء المناعية ، والمسح المجهري الإلكتروني (SEM) ، وتسجيل الخلايا ، وما إلى ذلك. توفر هذه التقنيات خارطة طريق للاستخدام الفعال للفرخ كنظام نموذجي لفهم ومعالجة تطور ونضج وتجديد ظهارة الطيور السمعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكولات التي تنطوي على شراء وزراعة واستخدام بيض الدجاج المخصب والأجنة غير المفرغة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية التابعة للمركز الوطني للعلوم البيولوجية ، بنغالورو ، كارناتاكا.
1. في التثقيب الكهربائي للبيض من السلائف السمعية الفرخ
- تصميم sgRNA واستنساخه للضربة القاضية الجينية CRISPR / Cas9
- لإنشاء ضربات قاضية للجينات ، صمم الحمض النووي الريبي التوجيهي لتعطيل مناطق إكسون من الجين ، ويفضل أن يكون أقرب إلى نهاية 5 'من منطقة الترميز.
- حدد دليل الحمض النووي الريبي المحتمل باستخدام أداة الويب CRISPOR23. اضبط بيانات المتصفح على Gallus gallus وتسلسل الشكل المجاور للمسافة الأولية (PAM) على 5'- NGG -3'. يحدد البرنامج توجيه الحمض النووي الريبي من تسلسل الإدخال ويعين درجات مختلفة بناء على النشاط المستهدف وغير المستهدف. حدد أفضل أربعة أدلة لمزيد من الدراسات.
- لتصميم oligos الخاصة بالقالب لإنتاج الدليل (g) RNA ، قم بإزالة تسلسل PAM (5′- NGG -3′) من إخراج أداة تصميم gRNA. هذا ليس ضروريا للاستهداف ، ولكنه يحتوي على تسلسل التعرف على الانقسام Cas9. توليف اثنين من oligos التكميلية المنقاة HPLC مع موقع تقييد BsmBI في كلا الطرفين ، لكل gRNA محتمل.
- استنساخ تسلسل الدليل في الإطار باستخدام سقالة tracrRNA لمتجه من الاختيار (هنا ، تم استخدام متجه pcU6_1sgRNA24).
- قم بإذابة قليل النيوكليوتيدات sgRNA بتركيز 100 ميكرومتر في الماء الخالي من DNase / RNase. قم بإجراء التلدين لدليلي oligo الحساسين والمضاد للحساسية باستخدام دراجة حرارية مع المعلمات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، ثم 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم تنخفض إلى 4 درجات مئوية.
- باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية كما هو موضح في25 ، قم بإعداد هضم تقييد oligos الملدن وناقل الاستنساخ pcU6_1sgRNA مع إنزيم BsmBI بين عشية وضحاها. ربط الإعداد باستخدام متجه pcU6_1sgRNA الخطي المهضوم BsmBI المنقى بالهلام و sgRNA oligos. تحول إلى خلية مختصة DH5-alpha وتسلسل يؤكد الاستنساخ الذي تم الحصول عليه.
- التعامل مع البيض والنوافذ
- قم بشراء البيض الطازج ونظفه عن طريق مسحه بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع التلوث. احتضان في 37-38 درجة مئوية ، مع رطوبة 45 ٪ لمدة 3.5-4 أيام.
- بعد الحضانة ، ضع البيضة على جانبها لمدة 5 دقائق على الأقل قبل الفتح. هذا يسمح للجنين بإعادة وضعه إلى أعلى صفار البيض. استخدم ملقط لعمل ثقوب صغيرة في الجزء العلوي ونهاية غير حادة للبيضة بحيث يمكن أن تمر إبرة 21G.
- لمنع التلف أثناء النوافذ ، قم بإزالة الألبومين لخفض الجنين بعيدا عن القشرة. للقيام بذلك ، استخدم حقنة سعة 5 مل وإبرة 21 جيجا لسحب 2 مل من الألبومين بعناية من ثقب في الطرف الحاد للبيضة. استخدم شريطا شفافا لتغطية الفتحة في النهاية الحادة.
- لجعل نافذة البيض ، قم بلصق شريط شفاف على الجزء العلوي من قشر البيض. قطع فتح نافذة ، طولها حوالي 2 سم وعرضها 1.5 سم ، باستخدام مقص القوس الربيع وفضح الجنين. استخدم ملقط لفتح الأغشية المشيمية التي تغطي الجنين ، مما يسمح بالوصول إلى الجنين.
- بلازميدات الحقن الدقيق
- بالنسبة لتجربة خروج المغلوب الجيني ، قم بإعداد حلين: مزيج الضربة القاضية الذي يحتوي على بروتين SpCas9 والبلازميد التوجيهي - pcU6_1sgRNA ، ومزيج البلازميد التتبع من T2K-eGFP (هذا هو مروج الفرخ ß-actin يقود كاسيت GFP محاطا بمواقع transposon الخاصة ب Tol2) جنبا إلى جنب مع T2TP (Tol2 transposase المستنسخ في Tol2 بناء26,27). يتم استخدام المقتفي لتتبع كفاءة التثقيب الكهربائي.
- عند تعبئة عدة بلازميدات بالكهرباء ، تأكد من أن التركيز النهائي للحمض النووي لا يقل عن 4 ميكروغرام / ميكرولتر. امزج التركيبات الثلاثة ، وقم بتوجيه البلازميد - pcU6_1sgRNA و T2K-eGFP و T2TP ، بنسبة 1: 1: 1 مع 1 ميكروغرام من بروتين SpCas9 ، و 30٪ سكروز ، و 0.1٪ صبغة خضراء سريعة في حجم نهائي يبلغ 10 ميكرولتر.
- سحب الإبر للحقن المجهري من الشعيرات الدموية الزجاجية القياسية (طول 3 بوصة ، OD 1.0 مم) باستخدام مجتذب ماصة عمودي. استخدم ملقط دقيق لكسر الطرف الشعري بعد السحب للحصول على قطر طرف يبلغ حوالي 50 ميكرومتر بنهاية مدببة.
- ضع الأجنة عند E3.5 على جانبها الأيسر بحيث يكون الرأس متجها لليمين. بهذه الطريقة فقط الحويصلة الأذنية الصحيحة يمكن الوصول إليها للحقن الدقيق. حقن دقيق مزيج ضربة قاضية في الحويصلة الأذنية. حقن حوالي 200 nL حجم من مزيج محلول الحمض النووي لملء الحويصلة الأذنية.
- تحديد كفاءة الدليل باستخدام مقايسة T7 endonuclease28.
- التثقيب الكهربائي
- أضف بضع قطرات من محلول ملحي بنسبة 0.719٪ فوق الجنين قبل التثقيب الكهربائي لخفض المقاومة الكهربائية ومنع ارتفاع درجة حرارة الجنين.
- ضع القطب الموجب من خلال الفتحة المصنوعة في الجانب الحاد من البيضة عند إزالة الألبومين. مناورة القطب بحيث يكون تحت صفار البيض. ضع القطب السالب فوق كيس الأذن المملوء.
- استخدم التثقيب الكهربائي لنقل البلازميدات إلى خلايا الجنين. استخدم مولد نبضات مربعة وقم بتطبيق خمس نبضات مدة كل منها 25 فولت و 100 مللي ثانية ، بمسافة 50 مللي ثانية. تحديد الظروف تجريبيا على أساس إعداد التثقيب الكهربائي الفردي.
- رطب الجنين بعد التثقيب الكهربائي بإضافة بضع قطرات من محلول ملحي 0.719٪. لتنظيف الألبومين المشوه من سطح الأقطاب الكهربائية ، اشطفه جيدا بالماء المقطر. أعد ختم البيضة بشريط شفاف وأعدها إلى الحاضنة المرطبة عند 37-38 درجة مئوية لمزيد من الحضانة.
ملاحظة: يمكن زراعة الأجنة حتى الفقس بعد التثقيب الكهربائي ، ولكن هناك انخفاض حاد في الصلاحية.
2. تشريح الحليمة القاعدية
- استخدم 70٪ من الإيثانول لتطهير الطاولة الجراحية ومرحلة المجهر والمنطقة المحيطة. تعمل الحرارة أو الكحول على تعقيم معدات التشريح المجهري التي تشمل مقص القوس الزنبركي البسيط ، والكوريت الصغير ، وزوجين من الملقط الناعم.
- قم بإعداد لوحات التشريح التالية: طبق بتري زجاجي بقاعدة سيليكون سوداء ، وطبق بتري بلاستيكي 90 مم ، وطبق بتري 60 مم. قم بتبريد إما محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو محلول هانكس الملحي المتوازن (HBSS) للتشريح.
- اكسر البيضة برفق في طبق بتري 90 مم. تحديد الأذن الخارجية للكتكوت. قطع رأس الجنين عن طريق قطع الرقبة أسفل مستوى الفك السفلي باستخدام المقص. انقل الرأس إلى طبق بتري 60 مم مملوء ببرنامج تلفزيوني بارد.
- قم بتوجيه الجنين مع مواجهة الجزء العلوي من المنقار نحو المجرب وأمسك المنقار باستخدام أحد ملقط # 5. استخرج العينين باستخدام ملقط # 5 الثاني. الانتقال من المنبر إلى الذيلية ، وقطع الجمجمة على طول خط الوسط. استخرج الدماغ.
- أضف المزيد من PBS أو HBSS المثلج وحدد موقع الهيكلين اللامعين ، بالقرب من مستوى صيوان الأذن. هذه هي otoliths من lagena في نهاية القناة القوقعة وتوجد بالقرب من خط الوسط.
- اقطع تقريبا بين اللاجينا ، وأعلى وأسفل هذه المنطقة لعزل أذنين داخليتين. تحت الإضاءة المائلة ، تصور الخطوط العريضة للأذن الداخلية. إزالة الأنسجة الدخيلة والدهليز.
- انقل القوقعة المعزولة إلى صفيحة قاعدة سيليكون سوداء مع PBS بارد مثلج. باستخدام ملقط #5 ، قشر كبسولة القوقعة الغضروفية للحصول على قناة القوقعة. حدد موقع الطبقة المتموجة (tegmentum) لقناة القوقعة الصناعية وقم بإزالتها باستخدام ملقط # 55 لفضح ضغط الدم. باستخدام ملقط # 55 ، قم بإزالة الغشاء التكتوري لفضح HCs و SCs.
3. ثقافة نباتات الحليمة القاعدية
- ثقافة الغشاء من BP
- خذ صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار وقم بترتيب إدراج غشاء زراعة واحد لكل بئر.
- اجمع الحليمة القاعدية المشرحة (explant) في ماصة 200 ميكرولتر مع 1x HBSS عازلة ونقلها إلى غشاء. لمنع الأنسجة من الالتصاق بجدار الماصة ، ارسم بعض الوسائط قبل استنشاق المنديل.
- قم بتوجيه الزرع بحيث تكون الحليمة القاعدية متجهة لأعلى ، بحيث يكون الشعر وخلايا الدعم مرئية من أعلى29. بمجرد وضع النبات ، قم بشفط المخزن المؤقت HBSS ببطء من سطح غشاء الثقافة. في هذه العملية ، سوف يعلق النبات على غشاء الثقافة.
- أضف 1.2 مل من وسائط استزراع النسر المتوسطة المعدلة (DMEM) من Dulbecco بين ملحق الغشاء وجدار البئر لملء آبار لوحة الآبار الستة. يمكن استزراع ما يصل إلى ستة نباتات خارجية على غشاء استزراع واحد 30 مم.
- زراعة الكولاجين في قناة القوقعة الصناعية
- تحضير خليط الكولاجين عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من 3 ملغ / مل من كولاجين ذيل الجرذ ، و 50 ميكرولتر من 10x DMEM ، و 30 ميكرولتر من 7.5٪ NaHCO3 ، و 5 ميكرولتر من HEPES في غطاء زراعة الأنسجة.
- خذ طبقا من أربعة آبار وأضف ثلاث قطرات من خليط الكولاجين في كل بئر. انقل قناة القوقعة الإلكترونية المشرحة إلى كل قطرة كولاجين. احتضان الطبق لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لعلاج مصفوفة الكولاجين.
- معالجة جزيء صغير من الثقافات
- تحضير وسائط الاستزراع (DMEM ، مكمل N-2 ، البنسلين) إما باستخدام المغير الدوائي أو مذيبته وحدها (لاستخدامها كعنصر تحكم). استبدل وسائط الثقافة ب 700 ميكرولتر من الوسائط المكملة بالمانع. استزراع النباتات في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
- استبدال 50٪ من وسائل الإعلام الثقافية كل يوم. بعد وقت الحضانة المناسب ، قم بإزالة وسائط الاستزراع واستخدم النباتات الخارجية لفحوصات المصب.
4. التصوير والتحليل
- تحليل الفلورسنت المناعي
- قم بإزالة وسائط الاستزراع من الآبار واغسل النباتات مرتين باستخدام 1x HBSS. باستخدام ماصة ، أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى البئر واحتضانه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة PFA واغسل النباتات ثلاث مرات باستخدام 1x PBS في درجة حرارة الغرفة. لجمع النباتات الخارجية من غشاء المزرعة ، قم بعمل قطع صغير حول الغشاء الذي يحتوي على قطعة من الأنسجة باستخدام مقص قوس زنبركي صغير وانقل الأنسجة مع الغشاء إلى صفيحة استزراع مكونة من 48 بئرا باستخدام الملقط.
ملاحظة: إذا كانت الأنسجة تطفو بعد التثبيت ، فقم بشفطها باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ونقلها إلى ألواح 48 بئرا لمزيد من المعالجة. تجنب الانفصال القوي للأنسجة عن الغشاء. - لزراعة قطرات الكولاجين ، استخدم الملقط لنقل قطرة الكولاجين بأكملها إلى صفيحة السيليكون. أضف 200 ميكرولتر من 1x PBS وقم بإزالة الكولاجين بمساعدة ملقط ، ثم انقل الأنسجة إلى لوحة ثقافة 48 بئرا.
- قم باختراق النباتات الخارجية باستخدام 1 مل من 1x PBS المكمل ب 0.3٪ Tween-20 (PBST) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. احتضان النباتات مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب (10٪ مصل الماعز + 1٪ ألبومين مصل الأبقار في PBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان النباتات الخارجية ب 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولي (1: 300 ، في مانع العازلة) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل النباتات جيدا لمدة 5 × 20 دقيقة باستخدام PBST.
- احتضان explants مع 200 ميكرولتر من phalloidin ومحلول الأجسام المضادة الثانوي (في مانع عازلة) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قم بإزالة القضيب ومحلول الأجسام المضادة الثانوي واغسل النباتات جيدا لمدة 5 × 20 دقيقة باستخدام PBST.
ملاحظة: يجب تحديد تركيز الأجسام المضادة الثانوي وطول الغسيل لكل تطبيق تصوير فردي. بالنسبة للتصوير باستخدام الفحص المجهري فائق الدقة ، نزيد عادة تركيز الجسم المضاد الثانوي من 1: 500 إلى 1: 200 ونزيد تركيز القضيب من 1: 400 إلى 1: 200. - احتضان النباتات بمحلول DAPI (1: 1000 في PBST) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول DAPI واغسل النباتات 3 × 5 دقائق باستخدام PBST.
- استخدم وسائط التركيب لتركيب explants على شريحة مع مواجهة BP في اتجاه تصاعدي (مقابل غطاء الغطاء). للتصوير متحد البؤر ، استخدم وسائط تركيب مضادة للتلاشي. اترك وسائط التركيب تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام. إما الصورة مباشرة أو تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية حتى التصوير.
- تثبيت OTOTO لتحليل SEM
- قم بإعداد جميع الحلول طازجة والتعامل معها وفقا لإرشادات السلامة المحلية. ثبت النباتات المستزرعة بالغشاء (من الخطوة 4.1.4) في 2.5٪ جلوتارالدهيد في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M (درجة الحموضة 7.3) مع 3 mM CaCl2. قم بإجراء التثبيت عند 4 درجات مئوية لمدة 24 إلى 72 ساعة مع تغيير المثبت كل 24 ساعة.
- قم بإزالة المثبت واغسل المنديل ب 0.1 متر كاكوديلات الصوديوم 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إصلاح ثانوي مع 1٪ OsO 4 (مخفف من مخزون 4٪ OsO4 باستخدام 0.1 M محلول كاكوديلات الصوديوم) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. نفذ هذا والخطوات اللاحقة حتى الجفاف في غطاء الدخان.
- شطف باستخدام 0.1 M كاكوديلات الصوديوم عازلة 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم شطف في الماء المقطر المزدوج أو فائق النقاء 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير محلول 0.5 ٪ من ثيوكاربوهيدرازيد (TCH) في الماء عالي النقاء. يقلب على حرارة 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ويصفى المحلول عندما يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: TCH خطير للغاية. يجب الموافقة على الاستخدام من قبل لجنة السلامة المحلية ، ويجب توخي الحذر عند المناولة. - قم بإزالة الماء عالي النقاء من العينة وأضف 0.5٪ TCH قطرة قطرة. إذا تحول المحلول إلى اللون البني ، فتوقف عن العينة واشطفها بماء عالي النقاء ، قبل إضافة محلول TCH 0.5٪ بعناية. بمجرد أن يصبح الحل واضحا ، استبدله ب 0.5٪ TCH. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة30،31.
- شطف العينة بالماء عالي النقاء 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوات 4.2.2 و 4.2.3 و 4.2.5 مرتين أخريين تنتهي بحضانة OsO4 متبوعة بالشطف.
- قم بتجفيف العينات في سلسلة الإيثانول إلى الإيثانول اللامائي بنسبة 100٪ (EtOH). احتضان أولا في 25٪ ETOH لمدة 10 دقائق ، ثم 50٪ ETOH لمدة 10 دقائق ، 75٪ EtOH لمدة 10 دقائق ، 95٪ ETOH لمدة 10 دقائق ، قبل الحضانة لما مجموعه 3x لمدة 10 دقائق لكل منها في 100٪ ETOH.
- قم بإجراء تجفيف النقطة الحرجة باستخدام سائل CO2. قم بتركيب العينات على الفور على كعب SEM بشريط لاصق من الكربون على الوجهين. انتقل إلى معطف الرش لتوفير 5-10 نانومتر من الطلاء. إذا لم يتم التصوير على الفور ، فقم بتخزين العينات في مجفف تحت الفراغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في إعداد التثقيب الكهربائي ، يمكن أن يلعب تحديد موضع القطب دورا في مجال النقل. يتم وضع القطب الموجب تحت صفار البيض ، والسالب فوق الجنين (الشكل 1 أ). ينتج عن هذا تعبير GFP أعلى في جزء كبير من الأذن الداخلية وكلا الجهازين الدهليزيين (الشكل 1B) ، والحليمة القاعدية السمعية (الشكل 1C ، D) ، مما يؤكد النقل.
عند تقييم النمط الظاهري لضربات كريسبر القاضية ، قمنا بتصميم توجيه الحمض النووي الريبي إلى عامل نسخ خلايا الشعر Atonal homolog 1 (Atoh1). طفرات الفئران من Atoh1 غير قادرة على تشكيل خلايا الشعر32 ؛ بعد التثقيب الكهربائي للحمض النووي الريبي الدليلي Atoh1 والحضانة حتى E10 ، نجد أن تطور HC ضعيف عند مقارنته بالتحكم ، التحكم في البلازميد الفارغ (الشكل 2). على الرغم من أن التثقيب الكهربائي عبارة عن فسيفساء (الشكل 2E ، F) ، إلا أن الخلايا الضابطة بالكهرباء قادرة على تكوين خلايا شعرية. في عينات Atoh1 gRNA الكهربائية ، لا تظهر الخلايا الإيجابية GFP أبدا علامات تطور HC (الشكل 2B).
توفر ثقافة الأعضاء في BP إمكانية الوصول إلى الأنسجة. توفر الثقافات في مصفوفة 3D ، مثل الكولاجين ، حفظا ممتازا لمورفولوجيا الأنسجة لمدة تصل إلى 5 أيام. يتم الحفاظ على تنظيم HC و SC في ظروف الاستزراع هذه (الشكل 3).
يفضل استخدام مزارع الأعضاء على الغشاء لتصوير الأهداب المجسمة. يمكن زراعة هذه الثقافات لمدة تصل إلى 5 أيام مع الحفاظ على سلامة حزمة الشعر. يمكن ملاحظة ذلك من خلال توطين بروتين رابط الطرف ، protocadherin 1533 (Pcdh15) (الشكل 4). لاستجواب تطور حزمة الشعر ، من الضروري التصوير عالي الدقة ، ومثل هذه الأساليب ، باستخدام الفحص المجهري فائق الدقة (الشكل 4D) أو المجهر الإلكتروني الماسح (الشكل 4E) ، توفر معلومات أكثر اكتمالا.
الشكل 1. يظهر تعبير GFP عند E10 بعد التثقيب الكهربائي للبيض عند E4. (أ) رسم تخطيطي يوضح الحقن المجهري للبيض والتثقيب الكهربائي في حويصلة الفرخ الأذنية عند E4. تمتلئ ماصة الحقن ببلازميدات Tol2-eGFP (T2K-eGFP) و Tol2-transposases (T2TP) ، جنبا إلى جنب مع صبغة خضراء سريعة للتصور. (B) صورة للأذن الداخلية المثقوبة بالكهرباء عند E10 باستخدام عدسة موجهة للهواء بمعدل 0.63x على مجهر مجسم. الأذن الداخلية اليسرى هي السيطرة الداخلية. يشير السهم الأحمر إلى تعبير GFP في القناة القوقعية للأذن الداخلية اليمنى ، وتظهر العلامة النجمية الحمراء تعبير GFP في الأعضاء الدهليزية. شريط المقياس 2 سم. (C) صورة مضان واسع المجال لمقطع عرضي لقناة القوقعة اليمنى باستخدام هدف هوائي 20x يبلغ 0.5 NA. يقتصر تعبير GFP في الغالب على الظهارة الحسية. شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. (د) صورة متحدة البؤر لحليمة قاعدية جبل كاملة تم تصويرها باستخدام هدف هوائي 10x من 0.5 NA ملطخة بالفالويدين المترافق مع فلوروفور Alexa 647. لوحظ تعبير GFP من النهاية القريبة إلى البعيدة على الجانب العصبي من BP ؛ شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2. يؤدي الضربة القاضية للجين Atoh1 بوساطة كريسبر / Cas9 عبر التثقيب الكهربائي للبيض إلى فقدان خلايا الشعر (HCs). يتم حقن البلازميد الإرشادي الجيني Atoh1 pcU6_1-Atoh1sgRNA والبلازميدات التتبعية Tol2-eGFP (T2K-eGFP) و Tol2-transposases (T2TP) مع بروتين SpCas9 وتسخينها بالكهرباء في حويصلة أذنية للكتكوت عند E4. جميع الصور مأخوذة من حليمة قاعدية الفرخ E10 مع شريط مقياس 10 ميكرومتر ، تم التقاطها بهدف غمر الزيت 60x من 1.42 NA باستخدام مجهر متحد البؤر بالليزر. يتم توفير إدخالات مكبرة لجميع الصور. (أ، ب، ج، د) تحتوي اللوحة اليسرى على BP مع خلايا الشعر (HCs) ، والكهرباء مع pcU6_1sgRNA الفارغة و T2K-eGFP ، و T2TP مع بروتين SpCas9. (ه، و، ز، ح) تحتوي اللوحة اليمنى على BP مع فقدان HCs ، والكهرباء مع دليل Atoh1 (pcU6_1-Atoh1sgRNA) و T2K-eGFP ، و T2TP مع بروتين SpCas9. (أ، ه) صورة مدمجة تظهر خلايا الشعر (HCs) في الحليمة القاعدية. هذه هي مناعية ل Myosin 7a (الأزرق) ؛ F-actin ملطخة مع phalloidin مترافق مع Alexa 647 (أحمر) ؛ تم الكشف عن تعبير GFP من بلازميدات Tol2-eGFP باستخدام جسم مضاد مضاد ل GFP (أخضر). يتضح فقدان HCs من النشاط المناعي Myosin 7a عند مقارنة العلاجات مع pcU6_1sgRNA الفارغة (D) و pcU6_1-Atoh1sgRNA (H). يسلط تصوير F-actin من كلا العلاجين الضوء على حزمة شعر HC (B ، F). (ج، ز) يتم استخدام T2K-eGFP و T2TP لقياس موقع النقل وكفاءته. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3. تحافظ ثقافة الأعضاء في قناة القوقعة في ثقافة قطرات الكولاجين 3D على تنظيم الظهارة الحسية. يتم استزراع BP في E10 في ثقافة قطرات الكولاجين ثلاثية الأبعاد لمدة يوم واحد ويتم تصويرها باستخدام هدف غمر الزيت 60x من 1.42 NA باستخدام مجهر متحد البؤر بالليزر. (أ ) صورة لضغط الدم الكامل ل E10 المزروع لمدة يوم واحد في قطرة كولاجين وملطخة بالأجسام المضادة ضد مستضد خلايا الشعر (HCA)34. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. ( ب ) صورة مدمجة توضح التنظيم المحفوظ للظهارة الحسية من الجانب البعيد من BP الملطخ ب (C ) phalloidin (أخضر) و (D) HCA ( أزرق) ؛ شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4. حزم مجسمة هدبية من الحليمة القاعدية تحت المجهر الإلكتروني والضوئي. تم زرع 0.1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) المعالج BP في E10 واستزراعه لمدة 3 أيام في المختبر (DIV) على إدخالات زراعة الغشاء. (أ) تم تصوير Explant باستخدام هدف غمر الزيت 60x من 1.42 NA مع مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. تظهر الصورة المدمجة تعبير البروتوكادهيرين 15 (Pcdh15) والأهداب المجسمة ب phalloidin مترافقة مع Alexa 488 (أخضر). يتم عرض صور أحادية القناة ل F-actin ( B) و Pcdh15 (C). شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. (د) صورة فائقة الدقة لأهداب مجسمة ملطخة بالقضيب مترافقة مع تلطيخ Alexa 488 باللون الأخضر. تم الحصول على الصورة باستخدام هدف غمر الزيت 63x من 1.42 NA في وضع Airyscan للمجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. شريط المقياس هو 5 ميكرومتر. ( E ) تم التقاط صورة SEM عند تكبير 16340x باستخدام جهد إلكترون عالي التوتر (EHT) 7 كيلو فولت. علامات النجمة الحمراء kinocilia وعلامات إسفين حمراء stereocilia. تم ضبط السطوع والتباين على تلقائي وتم شحذ الصورة باستخدام فيجي. شريط المقياس هو 1 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفرخ هو إضافة فعالة من حيث التكلفة ومريحة للكائنات النموذجية التي قد يستخدمها المختبر للبحث في الأذن الداخلية. تستخدم الطرق الموضحة هنا بشكل روتيني في مختبرنا وتكمل الأبحاث الجارية في الأذن الداخلية للثدييات. في التثقيب الكهربائي للبيض يستخدم لإدخال التلاعب الجيني في جينوم الفرخ. يمكن أيضا استخدام التثقيب الكهربائي لإدخال تركيبات تشفر بروتينات الفلورسنت التي تستهدف عضيات معينة أو هياكل تحت خلوية35,36. في حين أن هذا إجراء بسيط ، فإن التلاعب بالأجنة في البويضة يؤثر على البقاء. من أجل التثقيب الكهربائي الفعال ، يجب شراء البيض طازجا (بعد فترة وجيزة من وضعه). كثيرا ما يلاحظ ارتفاع في معدل الوفيات و / أو التطور غير الطبيعي في البيض الذي تم تخزينه لأكثر من 5 أيام. إن استخدام تقنية معقمة ، وضمان إغلاق البويضة بشكل صحيح حتى لا تفقد الرطوبة ، وتقليل التلاعب الذي يتم إجراؤه على الجنين يعزز البقاء.
وجدنا أن استهداف كيس الأذن في E3.5 إلى E4 يقلل من الصدمة التي يواجهها الجنين ، واستخدام الأقطاب الكهربائية الموضوعة بعناية يسمح باستهداف جيد للسلائف الحسية لضغط الدم. ومع ذلك ، في هذه المرحلة ، تكون سلائف العقدة الصوتية الدهليزية قد هاجرت بالفعل بعيدا عن الأذن الداخلية37,38. لاستهداف هذه الخلايا ، يجب تحديد نقاط زمنية مبكرة للتثقيب الكهربائي للكيس الأذني ، وإجراء التسهيلات للانخفاض المقابل في الجدوى. ملاحظة أخرى من الحذر هي إمكانية الفسيفساء في الأجنة الكهربائية. لا تستهلك جميع الخلايا كل البلازميد ، وبالتالي يمكن للفسيفساء أن تربك التفسير. يساعد استخدام بلازميدات التتبع في تفسير البيانات ويوفر بعض التحكم في تأثيرات الفسيفساء المحتملة. سيساعد استخدام التكرارات المتعددة والتحليلات الدقيقة والأساليب الإحصائية في تقييم الأنماط الظاهرية للفسيفساء. نهج بديل هو استخدام السمان المعدل وراثيا39. حاليا ، هذه الأرقام محدودة وليست متاحة دائما للعديد من المختبرات. ومع ذلك ، سيزداد التوافر ، وأجنة السمان ، التي تعبر بشكل أساسي عن البروتينات الفلورية المستهدفة دون الخلوية ، هي اقتراح جذاب لتجارب التصوير.
في هذه الطريقة ، نقوم بالكهرباء البروتين والحمض النووي لضربات قاضية بوساطة كريسبر من خلال الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ)24. لا يزال توليد كريسبر / كاس9 بوساطة تركيبات الاندماج من خلال الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) غير فعال في هذا النموذج بالذات (سينغ وآخرون ، ملاحظات غير منشورة). يمكن تكييف طريقة التثقيب الكهربائي للاستخدام مع أنواع أخرى من تركيبات الحمض النووي (يمكن أن تكون هذه تركيبات ترميز بروتينات الاندماج) ، وكذلك للحمض النووي الريبي والبروتين. وتجدر الإشارة إلى أنه أثناء التطور (وانقسام الخلايا) ، ستصبح تركيبات التعبير القائمة على الحمض النووي مخففة ما لم يشتمل الناقل على مواقع تتوسط في إدخال الحمض النووي الخارجي في جينوم هذه الخلايا (على سبيل المثال ، Tol2 أو PiggyBac). هذا يسمح بتعبير أكثر استقرارا للبناء.
بعد التثقيب الكهربائي ، عادة ما يتم زرع الأجنة في البويضات حتى مرحلة E10 لتمايز خلايا الشعر ودراسات التنمية. ولكن إذا لزم الأمر ، يمكن أن تستمر ثقافة البيض حتى يفقس البيض ؛ ومع ذلك ، مع زيادة أطوال الحضانة هناك انخفاض مماثل في الجدوى. للتحايل على هذا ، في التثقيب الكهربائي للبيض يمكن دمجه مع تشريح ضغط الدم متبوعا بثقافة خارج البويضة على المدى الطويل. زراعة explants داخل مصفوفة 3D يسمح الحفاظ على جيدة من مورفولوجيا الأنسجة. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة التغيرات في أنماط الأنسجة والقطبية والتمايز. تسمح ثقافة BP على الغشاء بتصور الجانب القمي للأنسجة27 ، وخاصة التصوير عالي الدقة للأهداب المجسمة.
في بعض الحالات ، يمكن التغلب على قيود التعديل الوراثي باستخدام علاجات مختلفة قائمة على الجزيئات الصغيرة. تعمل المركبات النشطة دوائيا كمثبطات أو ناهضات لمسارات الإشارات أو العمليات البيولوجية للخلية. تطبيقها مفيد بشكل خاص في تشريح المتطلبات الزمنية. ومع ذلك ، يجب تحديد طرق التسليم الدقيقة والتركيزات المثلى تجريبيا ، حيث أنه في بعض الحالات لا يمكن مقارنة التوحيد الذي يتم إجراؤه في خطوط الخلايا بالجرعة المطلوبة في الأنسجة. يمكن أن يكون التسليم داخل الجنين مشكلة ، وقد يؤدي المقدار المطلوب جنبا إلى جنب مع التأثير على أجهزة الأعضاء الأخرى إلى الإضرار بالبقاء بشكل كبير. البديل الجاهز هو طرق زراعة الأعضاء20،21،22. ومع ذلك ، فإن طريقة الاستزراع الدقيقة تعتمد على أنواع الدراسة والتحليلات المقصودة. بينما تحافظ زراعة الكولاجين على مورفولوجيا الأنسجة في BP ، فإن زراعة الأغشية مناسبة بشكل أفضل لدراسة حزم الشعر القمي ل HC. يمكن ببساطة وضع الأنسجة فوق الغشاء لتصور السطح القمي باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح أو الفحص المجهري فائق الدقة. يتطلب تشريح زراعة الأعضاء ممارسة جيدة. وتشمل هذه الحفاظ على مساحة عمل معقمة واستخدام أدوات حادة. أدوات التشريح المجهري هذه حساسة ، ونجد أن استخدام أطباق السيليكون مهم في الحفاظ على سلامة أدوات الجراحة المجهرية.
تمثل التقنيات معا أساليب قيمة لتعزيز فهم نمو الأذن الداخلية. يمكن أن توفر الأفكار في علم الأحياء المقارن والتجديد التي تقدمها أجنة الفرخ رؤى مهمة حول تطور خلايا الشعر ووظيفتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للكشف عنها.
Acknowledgments
نحن نعترف بامتنان بالدعم المقدم من NCBS و TIFR و Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant و DST-SERB والمعهد الوطني الملكي للصم. نود أن نشكر المنظمة المركزية لتنمية الدواجن ومعهد التدريب ، هيساراغاتا ، بنغالورو. نحن ممتنون لمرافق CIFF و EM ودعم المختبرات في NCBS. نشكر يوشيكو تاكاهاشي وكويتشي كاواكامي على بنيات Tol2-eGFP و T2TP ، وجاي ريتشاردسون على الجسم المضاد HCA و G19 Pcdh15. نحن ممتنون لأعضاء Earlab لدعمهم المستمر وملاحظاتهم القيمة على البروتوكول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
References
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
- Driver, E. C., Kelley, M. W.
- Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
- Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
- Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
- Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
- Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
- Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
- Edge, A. S., Chen, Z. Y.
- Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
- Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
- Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
- Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
- Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
- Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
- Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
- Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
- Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
- Funahashi, J., Nakamura, H.
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
- Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
- Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).
