Summary
Le poussin est un organisme modèle rentable, accessible et largement disponible pour une variété d’études. Ici, une série de protocoles est détaillée pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et à la régénération de l’oreille interne aviaire.
Abstract
L’oreille interne perçoit le son et maintient l’équilibre à l’aide de la cochlée et du vestibule. Il le fait en utilisant un type de cellule mécanosensorielle dédié connu sous le nom de cellule ciliée. La recherche fondamentale dans l’oreille interne a conduit à une compréhension approfondie du fonctionnement des cellules ciliées et de la façon dont la dérégulation peut entraîner une perte auditive et des vertiges. Pour cette recherche, la souris a été le système modèle prééminent. Cependant, les souris, comme tous les mammifères, ont perdu la capacité de remplacer les cellules ciliées. Ainsi, en essayant de comprendre les thérapies cellulaires pour restaurer la fonction de l’oreille interne, des études complémentaires chez d’autres espèces de vertébrés pourraient fournir des informations supplémentaires. L’épithélium auditif des oiseaux, la papille basilaire (BP), est une feuille d’épithélium composée de cellules ciliées mécanosensorielles (HC) intercalées par des cellules de soutien (SC). Bien que l’architecture anatomique de la papille basilaire et de la cochlée des mammifères diffère, les mécanismes moléculaires du développement de l’oreille interne et de l’audition sont similaires. Cela fait de la papille basilaire un système utile non seulement pour les études comparatives, mais aussi pour comprendre la régénération. Ici, nous décrivons les techniques de dissection et de manipulation pour l’oreille interne du poulet. La technique montre des méthodes génétiques et d’inhibition de petites molécules, qui offrent un outil puissant pour étudier les mécanismes moléculaires du développement de l’oreille interne. Dans cet article, nous discutons des techniques d’électroporation in ovo pour perturber génétiquement la papille basilaire en utilisant des délétions CRIPSR-Cas9, suivies d’une dissection de la papille basilaire. Nous démontrons également la culture d’organes BP et l’utilisation optimale des matrices de culture, pour observer le développement de l’épithélium et des cellules ciliées.
Introduction
L’oreille interne de tous les vertébrés est dérivée d’un épithélium simple connu sous le nom de placode otique 1,2. Cela donnera naissance à tous les éléments structurels et aux types de cellules nécessaires pour transduire les informations mécanosensorielles associées à la perception de l’audition et de l’équilibre. Les cellules ciliées (HC), le capteur cilié de l’oreille interne, sont entourées de cellules de soutien (SC). Les HC transmettent l’information au cerveau postérieur auditif par l’intermédiaire des neurones du huitième nerf crânien. Ceux-ci sont également générés à partir du placode otique3. La transduction primaire du son est réalisée à la surface apicale du HC auditif, à travers un faisceau pileux mécaniquement sensible4. Ceci est médié par des protubérances modifiées à base d’actine appelées stéréocils, qui sont disposées dans un modèle d’escalier gradué5. De plus, un cil primaire modifié, appelé kinocilium, organise la formation de faisceaux de cheveux et est adjacent à la plus haute rangée de stéréocils 6,7,8. L’architecture des stéréocils est essentielle pour ce rôle dans la conversion des stimuli mécaniques dérivés de l’énergie acoustique en signaux neuronaux électriques9. Les dommages causés au HC auditif par le vieillissement, une infection, un traumatisme otoacoustique ou un choc ototoxique peuvent entraîner une perte auditive partielle ou complète qui, chez les mammifères, est irréversible10.
Des thérapies de remplacement cellulaire ont été proposées qui pourraient réparer ces dommages11,12. L’approche de cette recherche a été de comprendre le développement normal de la cellule ciliée des mammifères et de se demander si les programmes de développement peuvent être réinitiés dans les cellules de type progéniteur qui peuvent exister dans l’oreille interne13. Une deuxième approche a consisté à regarder en dehors des mammifères, vers les vertébrés non mammifères chez lesquels une régénération robuste des cellules ciliées auditives a lieu, comme les oiseaux14,15. Chez les oiseaux, la régénération des cellules ciliées se produit principalement par la dédifférenciation d’une cellule de soutien à un état de progéniteur, suivie d’une division mitotique asymétrique pour générer une cellule ciliée et une cellule de soutien16. De plus, une différenciation directe d’une cellule de soutien pour générer une cellule ciliée a également été observée17.
Bien que les mécanismes du développement auditif aviaire présentent des similitudes significatives avec celui des mammifères, il existe des différences18. La différenciation HC et SC chez le poussin BP est apparente dès le jour embryonnaire (E) 7, devenant plus nette au fil du temps. Par E12, une papille basilaire (BP) bien structurée et bien polarisée peut être visualisée, et par E17, des cellules ciliées bien développées peuvent être vues19. Ces points temporels fournissent des fenêtres sur les mécanismes de différenciation, de modelage et de polarité, ainsi que sur la maturation des cellules ciliées. Il est important de comprendre si de tels mécanismes sont conservés ou divergents, car ils permettent de mieux comprendre l’homologie profonde des origines des cellules ciliées mécanosensorielles.
Ici, nous démontrons un éventail de techniques effectuées aux stades embryonnaires précoces et tardifs pour étudier les processus cellulaires tels que la prolifération, la spécification du destin, la différenciation, la structuration et le maintien tout au long du développement de l’organe de l’oreille interne. Cela complète d’autres protocoles sur la compréhension du développement de l’oreille interne dans la culture explant20,21,22. Nous discutons d’abord de l’introduction d’ADN ou d’ARN exogène dans les précurseurs de la PA dans l’otocyste E3.5 en utilisant l’électroporation in ovo. Bien que les manipulations génétiques puissent fournir des informations précieuses, les phénotypes ainsi générés peuvent être pléiotropes et par conséquent confondants. Cela est particulièrement vrai au cours du développement ultérieur de l’oreille interne, où des processus fondamentaux tels que le remodelage cytosquelettique jouent de multiples rôles dans la division cellulaire, la morphogenèse tissulaire et la spécialisation cellulaire. Nous présentons des protocoles d’inhibition pharmacologique dans les explants cultivés, qui offrent des avantages dans le contrôle de la posologie et du moment et de la durée du traitement, offrant une manipulation spatio-temporelle précise des mécanismes de développement.
Différentes méthodes de culture d’organes peuvent être utilisées en fonction de la durée du traitement des petits inhibiteurs. Nous démontrons ici deux méthodes de culture d’organes qui permettent de mieux comprendre la morphogenèse épithéliale et la spécialisation cellulaire. Une méthode de culture 3D utilisant le collagène comme matrice pour cultiver le canal cochléaire permet une culture robuste et une visualisation en direct de la PA en développement. Pour comprendre la formation des stéréocils, nous présentons une méthode de culture membranaire telle que le tissu épithélial est cultivé sur une matrice rigide permettant aux protubérances d’actine de se développer librement. Les deux méthodes permettent un traitement en aval tel que l’imagerie de cellules vivantes, l’immunohistochimie, la microscopie électronique à balayage (MEB), l’enregistrement cellulaire, etc. Ces techniques fournissent une feuille de route pour l’utilisation efficace du poussin comme système modèle pour comprendre et manipuler le développement, la maturation et la régénération de l’épithélium auditif aviaire.
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Protocol
Les protocoles impliquant l’achat, la culture et l’utilisation d’œufs de poule fécondés et d’embryons non éclos ont été approuvés par le Comité institutionnel d’éthique animale du Centre national des sciences biologiques, Bengaluru, Karnataka.
1. Électroporation in ovo de précurseurs auditifs de poussins
- Conception et clonage de sgRNA pour l’élimination du gène CRISPR/Cas9
- Pour créer des knockouts de gènes, la conception guide les ARN pour perturber les régions exon du gène, de préférence plus près de l’extrémité 5' de la région codante.
- Sélectionnez les ARN guides potentiels à l’aide d’un outil web CRISPOR23. Réglez les données du navigateur sur Gallus gallus et la séquence de motifs adjacents protospacer (PAM) sur 5'- NGG -3'. Le programme détermine les ARN guides à partir de la séquence d’entrée et attribue différents scores en fonction de l’activité sur cible et hors cible. Sélectionnez les quatre meilleurs guides pour d’autres études.
- Pour la conception d’oligos spécifiques au modèle pour la production guide d’ARN (g), supprimez la séquence PAM (5′- NGG -3′) de la sortie de l’outil de conception de l’ARNg. Il n’est pas nécessaire pour le ciblage, mais contient la séquence de reconnaissance de clivage Cas9. Synthétiser deux oligos complémentaires purifiés par HPLC avec un site de restriction BsmBI aux deux extrémités, pour chaque ARNg potentiel.
- Cloner la séquence guide dans le cadre avec un échafaudage tracrRNA d’un vecteur de choix (ici, pcU6_1sgRNA vecteur a été utilisé24).
- Dissoudre les oligonucléotides sgRNA à une concentration de 100 μM dans de l’eau exempte de DNase/RNase. Recuit des deux oligoguidages sens et antisens à l’aide d’un thermocycleur avec les paramètres suivants: 95 °C pendant 3 min, puis 37 °C pendant 15 min, puis diminuer à 4 °C.
- À l’aide des techniques standard de biologie moléculaire décrites aupoint 25, configurer la digestion de restriction des oligos recuits et du vecteur de clonage pcU6_1sgRNA avec l’enzyme BsmBI pendant la nuit. Configurez la ligature avec le vecteur pcU6_1sgRNA digéré par BsmBI linéaire purifié au gel et les oligos d’ARNg digérés. Transformez-la en une cellule compétente DH5-alpha et la séquence confirme le clone obtenu.
- Manipulation des œufs et fenêtrage
- Procurez-vous des œufs fraîchement pondus et nettoyez-les en les essuyant avec de l’éthanol à 70% pour éviter toute contamination. Incuber à 37-38 °C, avec 45% d’humidité pendant 3,5-4 jours.
- Après l’incubation, placez l’œuf sur le côté pendant au moins 5 minutes avant de l’ouvrir. Cela permet à l’embryon de se repositionner au sommet du jaune. Utilisez des pinces pour faire de petits trous au sommet et à l’extrémité émoussée de l’œuf de sorte qu’une aiguille 21G puisse passer à travers.
- Pour éviter les dommages pendant le fenêtrage, retirez l’albumine pour abaisser l’embryon loin de la coquille. Pour ce faire, utilisez une seringue de 5 mL et une aiguille de 21 G pour prélever soigneusement 2 mL d’albumine dans un trou situé à l’extrémité émoussée de l’œuf. Utilisez du ruban adhésif transparent pour couvrir le trou à l’extrémité émoussée.
- Pour créer la fenêtre de l’œuf, fixez du ruban adhésif transparent sur le dessus de la coquille d’œuf. Coupez une fenêtre d’environ 2 cm de long et 1,5 cm de large à l’aide de ciseaux à arc à ressort et exposez l’embryon. Utilisez des pinces pour ouvrir les membranes chorioniques recouvrant l’embryon, permettant ainsi l’accès à l’embryon.
- Microinjection de plasmides
- Pour l’expérience d’élimination génique, préparez deux solutions: le mélange knock-down contenant la protéine SpCas9 et le plasmide guide - pcU6_1sgRNA, et le mélange plasmidique traceur de T2K-eGFP (il s’agit d’un promoteur de la ß-actine de poussin entraînant une cassette GFP entourée par les sites de transposons de Tol2) avec la T2TP (la transposase Tol2 clonée dans Tol2 construit26,27). Le traceur est utilisé pour suivre l’efficacité de l’électroporation.
- Lors de l’électroporation de plusieurs plasmides, s’assurer que la concentration finale d’ADN est d’au moins 4 μg/μL. Mélanger les trois constructions, guider le plasmide - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP et T2TP, dans un rapport de 1:1:1 avec 1 μg de protéine SpCas9, 30% de saccharose et 0,1% de colorant vert rapide dans un volume final de 10 μL.
- Tirez des aiguilles pour microinjection à partir de capillaires en verre standard (longueur 3 po, OD 1,0 mm) à l’aide d’un extracteur de pipette vertical. Utilisez une pince fine pour briser l’extrémité capillaire après avoir tiré pour obtenir un diamètre d’extrémité d’environ 50 μm avec une extrémité effilée.
- Posez les embryons à E3.5 sur leur côté gauche avec la tête tournée vers la droite. De cette façon, seule la vésicule otique droite est accessible pour la micro-injection. Micro-injectez le mélange knock-down dans la vésicule otique. Injecter environ 200 nL de mélange de solution d’ADN pour remplir la vésicule otique.
- Déterminer l’efficacité du guide à l’aide d’un dosage de l’endonucléase T728.
- Électroporation
- Ajouter quelques gouttes de solution saline à 0,719% sur l’embryon avant l’électroporation pour réduire la résistance électrique et éviter la surchauffe de l’embryon.
- Placez l’électrode positive à travers le trou fait du côté émoussé de l’œuf lorsque l’albumine a été retirée. Manœuvrez l’électrode de manière à ce qu’elle soit sous le jaune. Placez l’électrode négative sur l’otocyste rempli.
- Utilisez l’électroporation pour transfecter les plasmides dans les cellules de l’embryon. Utilisez un générateur d’impulsions carré et appliquez cinq impulsions d’une durée de 25 V et 100 ms chacune, espacées de 50 ms. Déterminer les conditions empiriquement en fonction d’une configuration d’électroporation individuelle.
- Hydrater l’embryon après électroporation en ajoutant quelques gouttes de solution saline à 0,719%. Pour nettoyer l’albumine dénaturée de la surface des électrodes, rincez-la soigneusement à l’eau distillée. Refermez l’œuf avec du ruban adhésif transparent et retournez dans l’incubateur humidifié à 37-38 °C pour une incubation ultérieure.
REMARQUE: Les embryons peuvent être cultivés jusqu’à l’éclosion après l’électroporation, mais il y a une forte réduction de la viabilité.
2. Dissection de la papille basilaire
- Utilisez de l’éthanol à 70% pour désinfecter la table chirurgicale, la platine du microscope et la zone environnante. La chaleur ou l’alcool stérilisent l’équipement de microdissection qui comprend des ciseaux à ressort minimal, une micro-curette et deux paires de pinces fines.
- Préparez les plaques de dissection suivantes: une boîte de Petri en verre avec une base en silicium noir, une boîte de Petri en plastique de 90 mm et une boîte de Petri de 60 mm. Refroidir soit une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) pour les dissections.
- Casser doucement l’œuf dans la boîte de Petri de 90 mm. Identifiez l’oreille externe du poussin. Décapitater l’embryon en coupant le cou juste en dessous du niveau de la mâchoire inférieure à l’aide de ciseaux. Transférer la tête dans une boîte de Petri de 60 mm remplie de PBS glacé.
- Orientez l’embryon avec le haut du bec tourné vers l’expérimentateur et tenez le bec à l’aide de l’une des pinces #5. Retirez les yeux à l’aide de la deuxième pince #5. En passant de rostral à caudale, coupez le crâne le long de sa ligne médiane. Retirez le cerveau.
- Ajoutez plus de PBS ou HBSS glacé et localisez les deux structures brillantes, près du niveau du pavillon de l’oreille. Ce sont les otolithes de la lagène à l’extrémité du canal cochléaire et se trouvent près de la ligne médiane.
- Couper grossièrement entre les deux lagenas, et bien au-dessus et au-dessous de cette région pour isoler deux oreilles internes. Sous un éclairage oblique, visualisez le contour de l’oreille interne. Retirez les tissus étrangers et le vestibule.
- Transférer la cochlée isolée sur une plaque de base en silicone noir avec du PBS glacé. À l’aide d’une pince #5, retirez la capsule cochléaire cartilagineuse pour obtenir le canal cochléaire. Localisez la couche ondulée (tegmentum) du canal cochléaire et retirez-la à l’aide de la pince #55 pour exposer la PA. À l’aide de la pince #55, retirez la membrane tectoriale pour exposer les HC et les SC.
3. Culture d’explants de papilles basilaires
- Culture membranaire de la PA
- Prenez une plaque de culture tissulaire à six puits et disposez un insert de membrane de culture par puits.
- Recueillir la papille basilaire disséquée (explanter) dans une pipette de 200 μL avec 1x tampon HBSS et la transférer sur une membrane. Pour éviter que le tissu ne colle à la paroi de la pipette, aspirez un peu de média avant d’aspirer le tissu.
- Orientez l’explant de manière à ce que la papille basilaire soit orientée vers le haut, de sorte que les cheveux et les cellules de soutien soient visibles depuis les29 premiers. Une fois l’explant positionné, aspirer lentement le tampon HBSS de la surface de la membrane de culture. Dans ce processus, l’explant se fixera à la membrane de culture.
- Ajouter 1,2 mL de milieu de culture Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco entre l’insert membranaire et la paroi du puits pour remplir les puits de la plaque à six puits. Jusqu’à six explants peuvent être cultivés sur une seule membrane de culture de 30 mm.
- Culture de collagène du canal cochléaire
- Préparer le mélange de collagène en ajoutant 400 μL de collagène de queue de rat à 3 mg/mL, 50 μL de DMEM 10x, 30 μL de NaHCO3 à 7,5 % et 5 μL de HEPES dans une hotte de culture tissulaire.
- Prenez une assiette à quatre puits et ajoutez trois gouttes de mélange de collagène dans chaque puits. Transférer le canal cochléaire disséqué à chaque goutte de collagène. Incuber la plaque pendant 10 min à 37 °C, 5% de CO2 pour durcir la matrice de collagène.
- Traitement des cultures à petites molécules
- Préparer les milieux de culture (DMEM, supplément de N-2, pénicilline) avec le modulateur pharmacologique ou son solvant seul (à utiliser comme témoin). Remplacer le milieu de culture par 700 μL de milieu complété par l’inhibiteur. Culture des explants dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2.
- Remplacer 50% des milieux de culture chaque jour. Après un temps d’incubation approprié, retirer les milieux de culture et utiliser les explants pour les dosages en aval.
4. Imagerie et analyse
- Analyse immunofluorescente
- Retirer les milieux de culture des puits et laver les explants deux fois avec 1x HBSS. À l’aide d’une pipette, ajouter 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans le puits et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
- Retirez le PFA et lavez les explants trois fois avec 1x PBS à température ambiante. Pour recueillir les explants de la membrane de culture, faites une petite incision autour de la membrane contenant le morceau de tissu à l’aide de petits ciseaux à ressort et transférez le tissu avec la membrane dans une plaque de culture à 48 puits à l’aide d’une pince.
REMARQUE: Si les tissus flottent après la fixation, aspirez avec une pipette de 200 μL et transférez-les dans des plaques à 48 puits pour un traitement ultérieur. Évitez le détachement forcé du tissu de la membrane. - Pour la culture de gouttelettes de collagène, utilisez des pinces pour transférer toute la goutte de collagène sur une plaque de silicium. Ajouter 200 μL de 1x PBS et enlever le collagène à l’aide d’une pince, puis transférer le tissu dans une plaque de culture de 48 puits.
- Perméabiliser les explants avec 1 mL de 1x PBS supplémenté à 0,3% de Tween-20 (PBST) pendant 30 min à température ambiante. Incuber les explants avec 200 μL de tampon bloquant (10% sérum de chèvre + 1% albumine sérique bovine dans PBST) pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les explants avec 200 μL de solution d’anticorps primaires (1:300, dans un tampon de blocage) pendant une nuit à 4 °C. Retirer la solution d’anticorps primaires et laver soigneusement les explants 5 x 20 min avec PBST.
- Incuber les explants avec 200 μL de phalloïdine et une solution d’anticorps secondaire (dans un tampon de blocage) pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité. Retirer la phalloïdine et la solution d’anticorps secondaires et laver soigneusement les explants 5 x 20 min avec PBST.
REMARQUE : La concentration d’anticorps secondaires et la durée de lavage doivent être déterminées pour chaque application d’imagerie. Pour l’imagerie utilisant la microscopie à super résolution, nous augmentons généralement la concentration de l’anticorps secondaire de 1:500 à 1:200 et augmentons la concentration de phalloïdine de 1:400 à 1:200. - Incuber les explants avec une solution de DAPI (1:1000 dans PBST) pendant 15 min à température ambiante. Retirer la solution DAPI et laver les explants 3 x 5 min avec du PBST.
- Utilisez le support de montage pour monter les explants sur une glissière avec BP orienté vers le haut (contre la lamelle de couverture). Pour l’imagerie confocale, utilisez un support de montage antidécoloration. Laissez le support de montage sécher pendant la nuit à température ambiante dans l’obscurité. Imagez directement ou stockez les diapositives à 4 °C jusqu’à l’imagerie.
- Fixation OTOTO pour l’analyse SEM
- Préparez toutes les solutions fraîches et manipulez-les conformément aux directives de sécurité locales. Fixer les explants cultivés sur membrane (à partir de l’étape 4.1.4) dans du glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,3) avec 3 mM de CaCl2. Effectuer la fixation à 4 °C pendant 24 à 72 h avec un changement de fixateur toutes les 24 h.
- Retirer le fixateur et laver le mouchoir avec du cacodylate de sodium 0,1 M 3 x 5 min à température ambiante. Correction secondaire avec 1% OsO 4 (dilué à partir d’un stock d’OsO 4 à4% à l’aide d’un tampon cacodylate de sodium 0,1 M) pendant 1 h à température ambiante. Effectuez cette étape et les suivantes jusqu’à déshydratation dans une hotte.
- Rincer à l’aide d’un tampon cacodylate de sodium 0,1 M 3 x 5 min à température ambiante. Puis rincer à l’eau bidistillée ou ultrapure 3 x 5 min à température ambiante.
- Préparer une solution à 0,5% de thiocarbohydrazide (TCH) dans de l’eau ultrapure. Remuer à 75 °C pendant 10 min et filtrer la solution lorsqu’elle a refroidi à température ambiante.
REMARQUE: TCH est extrêmement dangereux. L’utilisation doit être approuvée par le comité de sécurité local et des précautions doivent être prises lors de la manipulation. - Retirer de l’eau ultrapure de l’échantillon et ajouter 0,5% TCH goutte à goutte. Si la solution brunit, arrêtez et rincez l’échantillon à l’eau ultrapure, avant d’ajouter soigneusement la solution de TCH à 0,5%. Une fois que la solution est claire, remplacez-la par 0,5% TCH. Incuber à température ambiante pendant 20 min30,31.
- Rincer l’échantillon à l’eau ultrapure 3 x 5 min à température ambiante. Répétez les étapes 4.2.2, 4.2.3 et 4.2.5 deux fois de plus en terminant par l’incubation d’OsO4 suivie d’un rinçage.
- Déshydrater les échantillons d’une série d’éthanol à 100% éthanol anhydre (EtOH). Incuber d’abord dans 25% ETOH pendant 10 min, puis 50% ETOH pendant 10 min, 75% EtOH pendant 10 min, 95% ETOH pendant 10 min, avant d’incuber pour un total de 3x pendant 10 min chacun dans 100% ETOH.
- Effectuer le séchage au point critique à l’aide de CO2 liquide. Montez immédiatement les échantillons sur un stub SEM avec du ruban adhésif carbone double face. Procéder à la pulvérisation pour fournir 5-10 nm de revêtement. Si ce n’est pas l’imagerie immédiate, conservez les échantillons dans un dessiccateur sous vide.
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Representative Results
Dans la configuration d’électroporation, le positionnement des électrodes peut jouer un rôle dans le domaine de la transfection. L’électrode positive est placée sous le jaune et le négatif au-dessus de l’embryon (Figure 1A). Il en résulte une expression plus élevée de la GFP dans une grande partie de l’oreille interne et des organes vestibulaires (Figure 1B) et de la papille basilaire auditive (Figure 1C, D), confirmant la transfection.
En évaluant le phénotype des CRISPR-knockdowns, nous avons conçu des ARN guides vers le facteur de transcription des cellules ciliées Atonal homologue 1 (Atoh1). Les mutants souris d’Atoh1 sont incapables de former des cellules ciliées32; après électroporation des ARN guides Atoh1 et incubation jusqu’à E10, nous constatons que le développement de HC est altéré par rapport au contrôle du plasmide vide témoin (Figure 2). Bien que l’électroporation soit une mosaïque (Figure 2E,F), les cellules électroporées de contrôle sont capables de former des cellules ciliées. Dans les échantillons électroporés d’ARNg Atoh1, les cellules GFP positives ne montrent jamais les marqueurs du développement de HC (Figure 2B).
La culture d’organes de la PA permet d’accéder au tissu. Les cultures dans une matrice 3D, comme le collagène, assurent une excellente conservation de la morphologie des tissus jusqu’à 5 jours. L’organisation de SC et de SC est maintenue dans ces conditions de culture (figure 3).
Les cultures d’organes sur membrane sont préférables pour l’imagerie des stéréocils. Ces cultures peuvent être cultivées jusqu’à 5 jours tout en maintenant l’intégrité du faisceau de cheveux. Cela peut être vu par la localisation de la protéine tip-link, protocadhérine 1533 (Pcdh15) (Figure 4). Pour interroger le développement du faisceau pileux, une imagerie à plus haute résolution est nécessaire, et de telles approches, utilisant soit la microscopie à super-résolution (Figure 4D), soit la microscopie électronique à balayage (Figure 4E), fournissent des informations plus complètes.
Graphique 1. L’expression de la GFP est visible à E10 après électroporation in ovo à E4. (A) Schéma de principe illustrant la microinjection in ovo et l’électroporation dans la vésicule otique de poussin à E4. La pipette d’injection est remplie de plasmides Tol2-eGFP (T2K-eGFP) et Tol2-transposases (T2TP), ainsi que d’un colorant vert rapide pour la visualisation. (B) Image de l’oreille interne électroporée à E10 à l’aide d’une lentille d’objectif à air 0,63x sur un stéréomicroscope. L’oreille interne gauche est le contrôle interne. La flèche rouge marque l’expression de la GFP dans le canal cochléaire de l’oreille interne droite, et l’astérisque rouge montre l’expression de la GFP dans les organes vestibulaires; La barre d’échelle est de 2 cm. (C) Image de fluorescence à grand champ d’une coupe transversale du conduit cochléaire droit utilisant un objectif d’air 20x de 0,5 NA. L’expression de la GFP est principalement confinée à l’épithélium sensoriel; La barre d’échelle est de 10 μm. (D) Image confocale de la papille basilaire entière de monture imagée à l’aide d’un objectif aérien 10x de 0,5 NA coloré avec de la phalloïdine conjuguée avec du fluorophore Alexa 647. L’expression de la GFP est observée de l’extrémité proximale à distale du côté neural de la PA; La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. L’électroporation ovo via ovo du gène Atoh1 médiée par CRISPR/Cas9 entraîne une perte de cellules ciliées (HC). Le plasmide guide du gène Atoh1 pcU6_1-Atoh1sgRNA et les plasmides traceurs Tol2-eGFP (T2K-eGFP) et Tol2-transposases (T2TP) avec la protéine SpCas9 sont microinjectés et électropolisés dans la vésicule otique de poussin à E4. Toutes les images proviennent de la papille basilaire du poussin E10 avec une barre d’échelle de 10 μm, capturées avec un objectif d’immersion dans l’huile 60x de 1,42 NA à l’aide d’un microscope confocal laser. Des encarts zoomés sont fournis pour toutes les images. (A,B,C,D) Le panneau de gauche contient la BP avec les cellules ciliées (HC), électroporée avec du pcU6_1sgRNA vide et T2K-eGFP, et la T2TP avec la protéine SpCas9. (E,F,G,H) Le panneau latéral droit contient la PA avec perte de HC, électroporée avec le guide Atoh1 (pcU6_1-Atoh1sgRNA) et T2K-eGFP, et T2TP avec la protéine SpCas9. (A,E) Image fusionnée montrant les cellules ciliées (HC) dans la papille basilaire. Ceux-ci sont immunoréactifs pour la myosine 7a (bleu); F-actine colorée à la phalloïdine conjuguée à Alexa 647 (rouge); L’expression de la GFP à partir des plasmides Tol2-eGFP est détectée à l’aide d’un anticorps anti-GFP (vert). La perte de HC est évidente à partir de l’immunoréactivité de la myosine 7a lorsque l’on compare les traitements avec des pcU6_1sgRNA vides (D) et pcU6_1-Atoh1sgRNA (H). L’imagerie F-actine des deux traitements met en évidence le faisceau pileux du HC (B, F). (C,G) T2K-eGFP et T2TP sont utilisés pour mesurer l’emplacement et l’efficacité de la transfection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. La culture d’organes du canal cochléaire en culture de gouttelettes de collagène 3D maintient l’organisation de l’épithélium sensoriel. La BP à E10 est cultivée dans une culture de gouttelettes de collagène 3D pendant 1 jour et imagée à l’aide d’un objectif d’immersion d’huile 60x de 1,42 NA à l’aide d’un microscope confocal laser. (A) Image d’une PA entière de E10 cultivée pendant 1 jour dans une gouttelette de collagène et colorée avec des anticorps dirigés contre l’antigène des cellules ciliées (HCA)34. La barre d’échelle est de 100 μm. (B) Image fusionnée montrant l’organisation préservée de l’épithélium sensoriel du côté distal de la PA colorée avec (C) phalloïdine (vert) et (D) HCA (bleu); La barre d’échelle est de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Faisceaux stéréociliaires de papilles basilaires au microscope électronique et optique. Des PA traitées au diméthylsulfoxyde (DMSO) à 0,1 % ont été explantées à E10 et cultivées pendant 3 jours in vitro (DIV) sur des inserts de culture membranaire. (A) Explant est imagé à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 60x de 1,42 NA avec un microscope confocal à balayage laser. L’image fusionnée montre l’expression de la protocadhérine 15 (Pcdh15) et des stéréocils marqués par la phalloïdine conjuguée avec Alexa 488 (vert). Des images monocanal de F-actine ( B ) et de Pcdh15 (C) sont montrées. La barre d’échelle est de 10 μm. (D) Image super-résolution de stéréocils colorés à la phalloïdine conjugués avec une coloration Alexa 488 en vert. L’image a été obtenue en utilisant un objectif d’immersion dans l’huile 63x de 1,42 NA en mode Airyscan du microscope confocal à balayage laser. La barre d’échelle est de 5 μm. (E) L’image MEB a été prise à un grossissement de 16340x en utilisant une tension haute tension électronique (EHT ) de 7 kV. L’astérisque rouge marque les kinocilia et les stéréocils rouges qui se complaissent. La luminosité et le contraste ont été ajustés en automatique et l’image a été affinée à l’aide de FIJI. La barre d’échelle est de 1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le poussin est un ajout rentable et pratique aux organismes modèles qu’un laboratoire peut utiliser pour faire des recherches sur l’oreille interne. Les méthodes décrites ici sont couramment utilisées dans notre laboratoire et complètent les recherches en cours dans l’oreille interne des mammifères. L’électroporation in ovo est utilisée pour introduire des manipulations génétiques dans le génome du poussin. L’électroporation peut également être utilisée pour introduire des constructions qui codent pour des protéines fluorescentes ciblant des organites ou des structures subcellulaires particuliers35,36. Bien qu’il s’agisse d’une procédure simple, la manipulation d’embryons in ovo a un impact sur la viabilité. Pour une électroporation efficace, les œufs doivent être achetés frais (peu de temps après la ponte). Une augmentation de la mortalité et/ou un développement anormal est fréquemment observé dans les œufs stockés depuis plus de 5 jours. L’utilisation d’une technique stérile, garantissant que l’ovule est correctement scellé afin qu’il ne perde pas d’humidité, et minimisant les manipulations effectuées sur l’embryon améliorent la viabilité.
Nous avons constaté que le ciblage de l’otocyste à E3,5 à E4 réduit le traumatisme auquel l’embryon est confronté, et l’utilisation d’électrodes soigneusement positionnées permet un bon ciblage des précurseurs sensoriels de la PA. Cependant, à ce stade, les précurseurs du ganglion acoustique-vestibulaire ont déjà migré loin de l’oreille interne37,38. Pour cibler ces cellules, des points temporels plus précoces pour l’électroporation des otocystes doivent être sélectionnés, et des aménagements doivent être faits pour la diminution correspondante de la viabilité. Une autre mise en garde est la possibilité de mosaïcisme chez les embryons électroporés. Toutes les cellules n’occupent pas tout le plasmide, et donc le mosaïcisme peut confondre l’interprétation. L’utilisation de plasmides traceurs aide à l’interprétation des données et permet un certain contrôle sur les effets de mosaïque possibles. L’utilisation de répétitions multiples, d’analyses minutieuses et de méthodes statistiques aidera à évaluer les phénotypes de mosaïque. Une autre approche consiste à utiliser des cailles génétiquement modifiées39. À l’heure actuelle, ces chiffres sont limités et ne sont pas toujours disponibles pour de nombreux laboratoires. Cependant, la disponibilité augmentera, et les embryons de caille, qui expriment de manière constitutive des protéines fluorescentes sous-cellulairement ciblées, sont une proposition attrayante pour les expériences d’imagerie.
Dans cette méthode, nous électroporons la protéine et l’ADN pour les knockdowns médiés par CRISPR par jointure d’extrémité non homologue (NHEJ)24. La génération médiée par CRISPR/Cas9 de constructions de fusion par réparation dirigée par homologie (HDR) reste inefficace dans ce paradigme particulier (Singh et al., observations non publiées). La méthode d’électroporation peut être adaptée pour être utilisée avec d’autres types de constructions d’ADN (celles-ci pourraient être des constructions codant pour des protéines de fusion), ainsi que pour l’ARN et les protéines. Il convient de noter qu’au cours du développement (et de la division cellulaire), les constructions d’expression basées sur l’ADN se dilueront à moins que le vecteur n’incorpore des sites qui interviennent dans l’insertion de l’ADN exogène dans le génome de ces cellules (par exemple, Tol2 ou PiggyBac). Cela permet une expression plus stable de la construction.
Après électroporation, les embryons sont généralement cultivés in ovo jusqu’au stade E10 pour la différenciation des cellules ciliées et les études de développement. Mais si nécessaire, la culture in ovo peut être poursuivie jusqu’à l’éclosion des œufs; Cependant, avec l’augmentation des durées d’incubation, il y a une baisse correspondante de la viabilité. Pour contourner ce problème, l’électroporation in ovo peut être combinée avec des dissections de PA suivies d’une culture ex ovo à long terme. La culture d’explants au sein d’une matrice 3D permet une bonne préservation de la morphologie tissulaire. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les changements dans la structuration des tissus, la polarité et la différenciation. La culture de la PA sur une membrane permet de visualiser la face apicale du tissu27, en particulier l’imagerie à haute résolution des stéréocils.
Dans certains cas, les limites de la modification génétique peuvent être surmontées en utilisant différents traitements à base de petites molécules. Les composés pharmacologiquement actifs agissent comme inhibiteurs ou agonistes pour les voies de signalisation ou les processus biologiques cellulaires. Leur application est particulièrement utile pour disséquer l’exigence temporelle. Cependant, les modes d’administration exacts et les concentrations optimales doivent être déterminés empiriquement, car dans certains cas, la normalisation effectuée dans les lignées cellulaires n’est pas comparable à la dose requise dans les tissus. L’accouchement dans l’embryon peut être problématique, et la quantité nécessaire combinée à l’impact sur d’autres systèmes organiques peut compromettre considérablement la viabilité. Une alternative prête est les méthodes de culture d’organes20,21,22. Cependant, la méthode de culture exacte dépend des types d’études et d’analyses qui sont prévus. Alors que la culture de collagène préserve la morphologie tissulaire de la PA, la culture membranaire est mieux adaptée à l’étude des faisceaux de poils apicaux du HC. Le tissu peut simplement être placé sur le dessus de la membrane pour visualiser la surface apicale en utilisant la microscopie électronique à balayage ou la microscopie à super-résolution. Les dissections pour la culture d’organes nécessitent de bonnes pratiques. Il s’agit notamment de maintenir un espace de travail stérile et d’utiliser des instruments affûtés. Ces outils de microdissection sont sensibles et nous trouvons que l’utilisation de boîtes en silicium est importante pour préserver l’intégrité des outils microchirurgicaux.
Ensemble, les techniques représentent des approches précieuses pour approfondir la compréhension du développement de l’oreille interne. Les connaissances en biologie comparative et en régénération offertes par les embryons de poussins peuvent fournir des informations importantes sur le développement et la fonction des cellules ciliées.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le NCBS, le TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB et le Royal National Institute for the Deaf. Nous tenons à remercier l’Organisation centrale de développement de la volaille et l’Institut de formation, Hesaraghatta, Bangalore. Nous sommes reconnaissants envers le CIFF et le soutien des installations et des laboratoires de la SEMU au NCBS. Nous remercions Yoshiko Takahashi et Koichi Kawakami pour les constructions Tol2-eGFP et T2TP, et Guy Richardson pour les anticorps HCA et G19 Pcdh15. Nous sommes reconnaissants envers les membres d’Earlab pour leur soutien constant et leurs précieux commentaires sur le protocole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
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