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Developmental Biology

ओवो और एक्स ओवो विधियों में एवियन इनर कान के विकास का अध्ययन करने के लिए

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64172
Automatic Translation
*1,2, *1, *1, *1, 1
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2The University of Trans-Disciplinary Health Sciences and Technology
* These authors contributed equally

Summary

चूजा विभिन्न अध्ययनों के लिए एक लागत प्रभावी, सुलभ और व्यापक रूप से उपलब्ध मॉडल जीव है। यहां, एवियन आंतरिक कान के विकास और पुनर्जनन के अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला विस्तृत है।

Abstract

आंतरिक कान ध्वनि को समझता है और कोक्ले और वेस्टिब्यूल का उपयोग करके संतुलन बनाए रखता है। यह एक समर्पित मेकेनोसेंसरी सेल प्रकार का उपयोग करके ऐसा करता है जिसे हेयर सेल के रूप में जाना जाता है। आंतरिक कान में बुनियादी शोध ने इस बात की गहरी समझ पैदा की है कि बाल कोशिका कैसे कार्य करती है, और कैसे डिसरेग्यूलेशन से सुनवाई हानि और चक्कर आ सकता है। इस शोध के लिए, माउस पूर्व-प्रतिष्ठित मॉडल प्रणाली रहा है। हालांकि, चूहों, सभी स्तनधारियों की तरह, बालों की कोशिकाओं को बदलने की क्षमता खो चुके हैं। इस प्रकार, आंतरिक कान समारोह को बहाल करने के लिए सेलुलर उपचारों को समझने की कोशिश करते समय, अन्य कशेरुक प्रजातियों में पूरक अध्ययन आगे अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। पक्षियों का श्रवण उपकला, बेसिलर पैपिला (बीपी), एपिथेलियम की एक शीट है जो मेकेनोसेंसरी हेयर सेल (एचसी) से बना होता है जो सहायक कोशिकाओं (एससी) द्वारा परस्पर जुड़ा होता है। यद्यपि बेसिलर पैपिला और स्तनधारी कोक्लेया की शारीरिक वास्तुकला भिन्न होती है, आंतरिक कान के विकास और सुनवाई के आणविक तंत्र समान होते हैं। यह बेसिलर पैपिला को न केवल तुलनात्मक अध्ययन के लिए बल्कि पुनर्जनन को समझने के लिए एक उपयोगी प्रणाली बनाता है। यहां, हम चिकन आंतरिक कान के लिए विच्छेदन और हेरफेर तकनीकों का वर्णन करते हैं। तकनीक आनुवंशिक और छोटे अणु निषेध विधियों को दिखाती है, जो आंतरिक कान के विकास के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है। इस पेपर में, हम सीआरआईपीआर-सीएएस 9 विलोपन का उपयोग करके बेसिलर पैपिला को आनुवंशिक रूप से परेशान करने के लिए ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीकों में चर्चा करते हैं, इसके बाद बेसिलर पैपिला का विच्छेदन करते हैं। हम एपिथेलियम और बाल कोशिकाओं के विकास का निरीक्षण करने के लिए बीपी अंग संस्कृति और संस्कृति मैट्रिक्स के इष्टतम उपयोग का भी प्रदर्शन करते हैं।

Introduction

सभी कशेरुकियों के आंतरिक कान एक साधारण उपकला से प्राप्त होते हैं जिन्हें ओटिक प्लाकोड 1,2 के रूप में जाना जाता है। यह सुनवाई और संतुलन धारणा से जुड़े मेकेनोसेंसरी जानकारी को ट्रांसड्यूस करने के लिए आवश्यक सभी संरचनात्मक तत्वों और सेल प्रकारों को जन्म देगा। बाल कोशिकाएं (एचसी), आंतरिक कान का सिलिएटेड सेंसर, सहायक कोशिकाओं (एससी) से घिरे होते हैं। एचसी आठवें कपाल तंत्रिका के न्यूरॉन्स के माध्यम से श्रवण हिंडब्रेन को जानकारी रिले करते हैं। ये ओटिक प्लाकोड3 से भी उत्पन्न होते हैं। ध्वनि का प्राथमिक पारगमन श्रवण एचसी की एपिकल सतह पर, यांत्रिक रूप से संवेदनशील बाल बंडल 4 के माध्यम से प्राप्त कियाजाता है। यह स्टीरियोसिलिया नामक संशोधित एक्टिन-आधारित प्रोट्रूशियंस के माध्यम से मध्यस्थ होता है, जिसे एक वर्गीकृत, सीढ़ी पैटर्न 5 में व्यवस्थित किया जाताहै। इसके अलावा, एक संशोधित प्राथमिक सिलियम, जिसे किनोसिलियम कहा जाता है, बाल बंडल गठन को व्यवस्थित करता है और स्टीरियोसिलिया 6,7,8 की सबसे ऊंची पंक्ति से सटा हुआ है। स्टीरियोसिलिया की वास्तुकला ध्वनिक ऊर्जा से प्राप्त यांत्रिक उत्तेजनाओं को विद्युततंत्रिका संकेतों में परिवर्तित करने में इस भूमिका के लिए महत्वपूर्ण है। उम्र बढ़ने, संक्रमण, ओटोएकोस्टिक आघात, या ओटोटॉक्सिक सदमे के माध्यम से श्रवण एचसी को नुकसान आंशिक या पूर्ण सुनवाई हानि का परिणाम हो सकता है, जो स्तनधारियोंमें अपरिवर्तनीय है।

सेलुलर प्रतिस्थापन उपचार प्रस्तावित किए गए हैं जो इस तरह के नुकसान की मरम्मत कर सकतेहैं 11,12. इस शोध का दृष्टिकोण स्तनधारी बाल कोशिका के सामान्य विकास को समझना और यह पूछना है कि क्या विकास कार्यक्रमों को पूर्वज जैसी कोशिकाओं में फिर से शुरू किया जा सकता है जो आंतरिक कान13 के भीतर मौजूद हो सकते हैं। एक दूसरा दृष्टिकोण स्तनधारियों के बाहर देखने के लिए रहा है, गैर-स्तनधारी कशेरुकियों के लिए जिसमें श्रवण बाल कोशिकाओं का मजबूत उत्थान होता है, जैसे कि पक्षी14,15। पक्षियों में, बाल कोशिका पुनर्जनन मुख्य रूप से एक सहायक कोशिका के पूर्वज जैसी स्थिति में डी-भेदभाव के माध्यम से होता है, इसके बाद बाल कोशिका उत्पन्न करने और सेल16 का समर्थन करने के लिए असममित माइटोटिक विभाजन होता है। इसके अलावा, बाल कोशिका उत्पन्न करने के लिए एक सहायक कोशिका का प्रत्यक्षविभेदन भी देखा गया है।

जबकि एवियन श्रवण विकास के तंत्र स्तनधारियों के साथ महत्वपूर्ण समानताएं दिखाते हैं, मतभेद हैं18. चूजा बीपी में एचसी और एससी भेदभाव भ्रूण के दिन (ई) 7 से स्पष्ट है, जो समय के साथ अधिक विशिष्ट हो जाता है। ई 12 द्वारा, एक अच्छी तरह से पैटर्न और अच्छी तरह से ध्रुवीकृत बेसिलर पैपिला (बीपी) की कल्पना की जा सकती है, और ई 17 द्वारा अच्छी तरह से विकसित बाल कोशिकाओंको 19 देखा जा सकता है। ये समय बिंदु भेदभाव, पैटर्निंग और ध्रुवीयता के तंत्र के साथ-साथ बाल कोशिका परिपक्वता में खिड़कियां प्रदान करते हैं। यह समझना कि क्या ऐसे तंत्र संरक्षित या भिन्न हैं, महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे मेकेनोसेंसरी बाल कोशिकाओं की उत्पत्ति के गहरे होमोलॉजी में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

यहां, हम आंतरिक कान के अंग के विकास के दौरान प्रसार, भाग्य विनिर्देश, भेदभाव, पैटर्निंग और रखरखाव जैसी सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रारंभिक और देर से भ्रूण चरणों में की गई तकनीकों की एक सरणी का प्रदर्शन करते हैं। यह एक्सप्लेंट कल्चर20,21,22 में आंतरिक कान के विकास को समझने पर अन्य प्रोटोकॉल का पूरक है। हम पहले ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके ई 3.5 ओटोसिस्ट के भीतर बीपी अग्रदूतों में बहिर्जात डीएनए या आरएनए की शुरूआत पर चर्चा करते हैं। यद्यपि आनुवंशिक जोड़तोड़ मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, इस प्रकार उत्पन्न फेनोटाइप प्लियोट्रोपिक हो सकते हैं और परिणामस्वरूप भ्रमित हो सकते हैं। यह बाद के आंतरिक कान के विकास के दौरान विशेष रूप से सच है, जहां साइटोस्केलेटल रीमॉडेलिंग जैसी मौलिक प्रक्रियाएं कोशिका विभाजन, ऊतक मोर्फोजेनेसिस और सेलुलर विशेषज्ञता में कई भूमिका निभाती हैं। हम सुसंस्कृत खोजों में औषधीय निषेध के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो खुराक और उपचार के समय और अवधि को नियंत्रित करने में फायदे प्रदान करते हैं, विकास तंत्र के सटीक स्थानिक हेरफेर की पेशकश करते हैं।

छोटे अवरोधकों की उपचार अवधि के आधार पर विभिन्न अंग संस्कृति विधियों का उपयोग किया जा सकता है। यहां हम अंग संस्कृति के दो तरीकों का प्रदर्शन करते हैं जो उपकला मोर्फोजेनेसिस और सेलुलर विशेषज्ञता में अंतर्दृष्टि की अनुमति देते हैं। कोक्लियर डक्ट को कल्चर करने के लिए मैट्रिक्स के रूप में कोलेजन का उपयोग करके 3 डी कल्चर के लिए एक विधि विकासशील बीपी के मजबूत संवर्धन और लाइव विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाती है। स्टीरियोसिलिया के गठन को समझने के लिए, हम एक झिल्ली संस्कृति विधि प्रस्तुत करते हैं जैसे कि उपकला ऊतक को एक कठोर मैट्रिक्स पर सुसंस्कृत किया जाता है जो एक्टिन प्रोट्रूशियंस को स्वतंत्र रूप से बढ़ने में सक्षम बनाता है। दोनों विधियां डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग जैसे लाइव-सेल इमेजिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम), सेल रिकॉर्डिंग आदि की अनुमति देती हैं। ये तकनीकें एवियन श्रवण उपकला के विकास, परिपक्वता और उत्थान को समझने और हेरफेर करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में चूजे के प्रभावी उपयोग के लिए एक रोडमैप प्रदान करती हैं।

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Protocol

निषेचित चिकन अंडे और अनहैच्ड भ्रूण की खरीद, संस्कृति और उपयोग से जुड़े प्रोटोकॉल को नेशनल सेंटर फॉर बायोलॉजिकल साइंसेज, बेंगलुरु, कर्नाटक की संस्थागत पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. चूजे के श्रवण अग्रदूतों के विद्युतीकरण में

  1. CRISPR/Cas9 जीन नॉकआउट के लिए SgRNA डिजाइन और क्लोनिंग
    1. जीन नॉकआउट बनाने के लिए, जीन के एक्सॉन क्षेत्रों को बाधित करने के लिए आरएनए को डिजाइन करें, अधिमानतः कोडिंग क्षेत्र के 5 'अंत के करीब।
    2. एक वेब उपकरण CRISPOR23 का उपयोग कर संभावित गाइड RNA का चयन करें। ब्राउज़र डेटा को गैलस गैलस और प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रम को 5'- एनजीजी -3' पर सेट करें। कार्यक्रम इनपुट अनुक्रम से गाइड आरएनए निर्धारित करता है और ऑन-टारगेट और ऑफ-टारगेट गतिविधि के आधार पर अलग-अलग स्कोर प्रदान करता है। आगे के अध्ययन के लिए शीर्ष चार गाइड का चयन करें।
    3. गाइड (जी) आरएनए उत्पादन के लिए टेम्पलेट विशिष्ट ऑलिगोस के डिजाइनिंग के लिए, जीआरएनए डिजाइन टूल आउटपुट से पीएएम अनुक्रम (5'- एनजीजी -3') को हटा दें। यह लक्ष्यीकरण के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन इसमें Cas9 क्लीवेज पहचान अनुक्रम शामिल है। प्रत्येक संभावित जीआरएनए के लिए दोनों सिरों पर बीएसएमबीआई प्रतिबंध साइट के साथ दो एचपीएलसी शुद्ध पूरक ऑलिगोस को संश्लेषित करें।
    4. पसंद के वेक्टर के एक ट्रैकआरएनए पाड़ के साथ फ्रेम में गाइड अनुक्रम क्लोन करें (यहां, pcU6_1sgRNA वेक्टर का उपयोग किया गया था24)।
    5. DNase/RNase-मुक्त पानी में 100 μM की सांद्रता पर SgRNA ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को घोलें। निम्नलिखित मापदंडों के साथ थर्मोसाइक्लर का उपयोग करके दो सेंस और एंटीसेंस ऑलिगो गाइड की एनीलिंग करें: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, फिर 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस तक कम करें।
    6. 25 में वर्णित मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग करते हुए, रात भर बीएसएमबीआई एंजाइम के साथ एनाल्ड ऑलिगोस और pcU6_1sgRNA क्लोनिंग वेक्टर के पाचन को प्रतिबंधित करें। जेल-शुद्ध रैखिक बीएसएमबीआई-पचने वाले pcU6_1sgRNA वेक्टर और पचने वाले एसजीआरएनए ओलिगोस के साथ बंधाव सेटअप करें। एक डीएच 5-अल्फा सक्षम सेल में बदलें और अनुक्रम प्राप्त क्लोन की पुष्टि करता है।
  2. अंडे की हैंडलिंग और विंडोिंग
    1. ताजा रखे अंडे खरीदें और संदूषण को रोकने के लिए उन्हें 70% इथेनॉल के साथ पोंछकर साफ करें। 3.5-4 दिनों के लिए 45% आर्द्रता के साथ 37-38 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. इनक्यूबेशन के बाद, खोलने से पहले अंडे को कम से कम 5 मिनट के लिए अपनी तरफ रखें। यह भ्रूण को जर्दी के शीर्ष पर पुनर्स्थापित करने की अनुमति देता है। अंडे के शीर्ष और कुंद छोर पर छोटे छेद बनाने के लिए बल का उपयोग करें ताकि 21 जी सुई गुजर सके।
    3. विंडोिंग के दौरान क्षति को रोकने के लिए, भ्रूण को शेल से दूर करने के लिए एल्बुमिन को हटा दें। ऐसा करने के लिए, अंडे के कुंद छोर पर एक छेद से 2 एमएल एल्ब्यूमिन को ध्यान से खींचने के लिए 5 एमएल सिरिंज और 21 जी सुई का उपयोग करें। कुंद छोर पर छेद को कवर करने के लिए स्पष्ट टेप का उपयोग करें।
    4. अंडे की खिड़की बनाने के लिए, अंडे के छिलके के शीर्ष पर स्पष्ट टेप चिपकाएं। स्प्रिंग धनुष कैंची का उपयोग करके लगभग 2 सेमी लंबी और 1.5 सेमी चौड़ी खिड़की को काटें और भ्रूण को उजागर करें। भ्रूण के ऊपर कोरियोनिक झिल्ली खोलने के लिए फोर्सप्स का उपयोग करें, जिससे भ्रूण तक पहुंच की अनुमति मिलती है।
  3. माइक्रोइंजेक्टिंग प्लास्मिड
    1. जीन नॉकआउट प्रयोग के लिए, दो समाधान तैयार करें: नॉक-डाउन मिश्रण जिसमें एसपीसीए 9 प्रोटीन और गाइड प्लास्मिड होता है - pcU6_1sgRNA, और टी 2 के-ईजीएफपी का ट्रेसर प्लास्मिड मिश्रण (यह टी 2 के ट्रांसपोसन साइटों से घिरा जीएफपी कैसेट चलाने वाला एक चिक बी-एक्टिन प्रमोटर है) के साथ टी 2 टीपी (टोल 2 निर्माण 26,27 में क्लोन किए गए टोल2 ट्रांसपोसेस)। ट्रेसर का उपयोग इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता को ट्रैक करने के लिए किया जाता है।
    2. कई प्लास्मिड को इलेक्ट्रोपोरेट करते समय, सुनिश्चित करें कि डीएनए की अंतिम सांद्रता कम से कम 4 μg/ μL है। तीन संरचनाओं को मिलाएं, प्लास्मिड - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP और T2TP का मार्गदर्शन करें, 1: 1: 1 अनुपात में SpCas9 प्रोटीन, 30% सुक्रोज, और 0.1% फास्ट ग्रीन डाई के साथ 10 μL की अंतिम मात्रा में।
    3. ऊर्ध्वाधर पिपेट पुलर का उपयोग करके मानक ग्लास केशिकाओं (लंबाई 3 इंच, ओडी 1.0 मिमी) से माइक्रोइंजेक्शन के लिए सुइयों को खींचें। पतली छोर के साथ लगभग 50 μm का टिप व्यास प्राप्त करने के लिए खींचने के बाद केशिका टिप को तोड़ने के लिए ठीक बल का उपयोग करें।
    4. भ्रूण को उनके बाईं ओर E3.5 पर रखें, सिर दाईं ओर रखें। इस तरह माइक्रो-इंजेक्शन के लिए केवल सही ओटिक पुटिका सुलभ है। नॉक-डाउन मिश्रण को ओटिक पुटिका में माइक्रो-इंजेक्ट करें। ओटिक पुटिका को भरने के लिए डीएनए समाधान मिश्रण की लगभग 200 एनएल मात्रा इंजेक्ट करें।
    5. टी 7 एंडोन्यूक्लिज़ परख28 का उपयोग करके गाइड दक्षता निर्धारित करें।
  4. विद्युतीकरण
    1. विद्युत प्रतिरोध को कम करने और भ्रूण के अतिताप को रोकने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले भ्रूण के शीर्ष पर 0.719% खारा की कुछ बूंदें जोड़ें।
    2. एल्बुमिन को हटाने पर अंडे के कुंद पक्ष में बने छेद के माध्यम से सकारात्मक इलेक्ट्रोड रखें। इलेक्ट्रोड को पैंतरेबाज़ी करें ताकि यह जर्दी के नीचे हो। भरे हुए ओटोसिस्ट के ऊपर नकारात्मक इलेक्ट्रोड रखें।
    3. भ्रूण की कोशिकाओं में प्लास्मिड को स्थानांतरित करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करें। एक वर्ग पल्स जनरेटर का उपयोग करें और 25 वी और 100 एमएस अवधि की पांच दालें लागू करें, प्रत्येक 50 एमएस अलग। एक व्यक्तिगत इलेक्ट्रोपोरेशन सेटअप के आधार पर अनुभवजन्य रूप से स्थितियों का निर्धारण करें।
    4. इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद भ्रूण को 0.719% खारा की कुछ बूंदें जोड़कर हाइड्रेट करें। इलेक्ट्रोड की सतह से विकृत एल्बुमिन को साफ करने के लिए, इसे आसुत जल से अच्छी तरह से धो लें। अंडे को स्पष्ट टेप के साथ फिर से सील करें और आगे के इनक्यूबेशन के लिए 37-38 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर पर लौटें।
      नोट: भ्रूण को इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद सेने तक सुसंस्कृत किया जा सकता है, हालांकि व्यवहार्यता में भारी कमी आई है।

2. बेसिलर पैपिला विच्छेदन

  1. सर्जिकल टेबल, माइक्रोस्कोप चरण और आसपास के क्षेत्र को कीटाणुरहित करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें। हीट या अल्कोहल माइक्रोडिसेक्शन उपकरण को निष्फल करते हैं जिसमें न्यूनतम स्प्रिंग-बो कैंची, माइक्रो-क्योरेट और दो जोड़े ठीक बल शामिल हैं।
  2. निम्नलिखित विच्छेदन प्लेटें तैयार करें: एक काले सिलिकॉन बेस के साथ एक ग्लास पेट्री डिश, एक 90 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश, और 60 मिमी पेट्री डिश। विच्छेदन के लिए या तो फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) या हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान (एचबीएसएस) को ठंडा करें।
  3. धीरे से अंडे को 90 मिमी पेट्री डिश में क्रैक करें। चूजे के बाहरी कान की पहचान करें। कैंची का उपयोग करके निचले जबड़े के स्तर के ठीक नीचे गर्दन काटकर भ्रूण का सिर काट दें। सिर को बर्फ-ठंडे पीबीएस से भरे 60 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  4. भ्रूण को चोंच के शीर्ष के साथ प्रयोगकर्ता की ओर उन्मुख करें और # 5 बलों में से एक का उपयोग करके चोंच को पकड़ें। दूसरे # 5 बल का उपयोग करके आंखों को बाहर निकालें। रोस्ट्रल से पुच्छल तक जाते हुए, खोपड़ी को इसकी मध्य रेखा के साथ काट लें। मस्तिष्क को बाहर निकालें।
  5. अधिक बर्फ-ठंडा पीबीएस या एचबीएसएस जोड़ें और पिन्ना के स्तर के करीब दो चमकदार संरचनाओं का पता लगाएं। ये कॉक्लियर डक्ट के अंत में लैजेना के ओटोलिथ हैं और मध्य रेखा के करीब पाए जाते हैं।
  6. दो आंतरिक कानों को अलग करने के लिए इस क्षेत्र के ऊपर और नीचे लगभग दो लैगेना के बीच और अच्छी तरह से काटें। तिरछी रोशनी के तहत, आंतरिक कान की रूपरेखा की कल्पना करें। बाहरी ऊतक और वेस्टिब्यूल को हटा दें।
  7. पृथक कोक्लेआ को बर्फ के ठंडे पीबीएस के साथ एक काले सिलिकॉन बेस प्लेट में स्थानांतरित करें। # 5 फोर्सप्स का उपयोग करके, कॉक्लियर डक्ट प्राप्त करने के लिए कार्टिलाजिनस कॉक्लियर कैप्सूल को छील लें। कोक्लियर डक्ट की लहरदार परत (टेग्मेंटम) का पता लगाएं और बीपी को उजागर करने के लिए # 55 फोर्सप्स का उपयोग करके हटा दें। # 55 फोर्सप्स का उपयोग करके, एचसी और एससी को उजागर करने के लिए टेक्टोरियल झिल्ली को हटा दें।

3. बेसिलर पैपिला खोजों की संस्कृति

  1. बीपी की झिल्ली संस्कृति
    1. एक छह-अच्छी तरह से ऊतक संवर्धन प्लेट लें और प्रति अच्छी तरह से एक संस्कृति झिल्ली डालने की व्यवस्था करें।
    2. 1x HBSS बफर के साथ 200 μL पिपेट में विच्छेदित बेसिलर पैपिला (खोज) एकत्र करें और इसे एक झिल्ली पर स्थानांतरित करें। ऊतक को पिपेट की दीवार से चिपकने से रोकने के लिए, ऊतक को एस्पिरेटेड करने से पहले कुछ मीडिया तैयार करें।
    3. खोज को इस तरह से उन्मुख करें कि बेसिलर पैपिला ऊपर की ओर है, ताकि बाल और समर्थन कोशिकाएं शीर्ष29 से दिखाई दें। एक बार जब खोज तैनात हो जाती है, तो कल्चर झिल्ली की सतह से धीरे-धीरे एचबीएसएस बफर को एस्पिरेट करें। इस प्रक्रिया में, खोज संस्कृति झिल्ली से जुड़ जाएगी।
    4. छह-वेल प्लेट के कुओं को भरने के लिए झिल्ली डालने और अच्छी दीवार के बीच 1.2 एमएल डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) कल्चर मीडिया जोड़ें। एक 30 मिमी संस्कृति झिल्ली पर छह खोजों को सुसंस्कृत किया जा सकता है।
  2. कॉक्लियर डक्ट की कोलेजन संस्कृति
    1. एक ऊतक संवर्धन हुड में 3 मिलीग्राम / एमएल चूहे की पूंछ कोलेजन का 400 μL, 10x DMEM का 50 μL, 7.5% NaHCO3 का 30 μL और HEPES का 5 μL जोड़कर कोलेजन मिश्रण तैयार करें।
    2. एक चार-अच्छी प्लेट लें और प्रत्येक कुएं में कोलेजन मिश्रण की तीन बूंदें जोड़ें। प्रत्येक कोलेजन ड्रॉप में विच्छेदित कॉक्लियर डक्ट को स्थानांतरित करें। कोलेजन मैट्रिक्स को ठीक करने के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. संस्कृतियों के छोटे अणु उपचार
    1. या तो फार्माकोलॉजिकल मॉड्यूलेटर या अकेले इसके विलायक (नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए) के साथ संस्कृति मीडिया (डीएमईएम, एन -2 पूरक, पेनिसिलिन) तैयार करें। अवरोधक के साथ पूरक मीडिया के 700 μL के साथ संस्कृति मीडिया को प्रतिस्थापित करें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर एक इनक्यूबेटर मेंखोजों को कल्चर करें।
    2. हर दिन 50% संस्कृति मीडिया को बदलें। उचित इनक्यूबेशन समय के बाद, संस्कृति मीडिया को हटा दें और डाउनस्ट्रीम परख के लिए खोजों का उपयोग करें।

4. इमेजिंग और विश्लेषण

  1. इम्यूनोफ्लोरोसेंट विश्लेषण
    1. कुओं से कल्चर मीडिया को हटा दें और 1x HBSS के साथ दो बार खोजों को धोएं। पिपेट का उपयोग करके, कुएं में 1 एमएल 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. पीएफए निकालें और कमरे के तापमान पर 1x PBS के साथ तीन बार खोजों को धोएं। कल्चर झिल्ली से खोजों को इकट्ठा करने के लिए, छोटे स्प्रिंग बो कैंची का उपयोग करके ऊतक के टुकड़े वाले झिल्ली के चारों ओर एक छोटा सा कट बनाएं और झिल्ली के साथ ऊतक को फोर्सप्स का उपयोग करके 48-वेल कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें।
      नोट: यदि निर्धारण के बाद ऊतक तैर रहे हैं, तो 200 μL पिपेट के साथ एस्पिरेट करें और इसे आगे के प्रसंस्करण के लिए 48-वेल प्लेटों में स्थानांतरित करें। झिल्ली से ऊतक के बलपूर्वक अलगाव से बचें।
    3. कोलेजन ड्रॉपलेट कल्चर के लिए, पूरे कोलेजन ड्रॉप को सिलिकॉन प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए फोर्स का उपयोग करें। 1x PBS का 200 μL जोड़ें और बल की मदद से कोलेजन को हटा दें, और फिर ऊतक को 48-वेल कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें।
    4. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 0.3% ट्वीन -20 (पीबीएसटी) के साथ पूरक 1x PBS के 1 एमएल के साथ खोजों को प्रतिस्थापित करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 200 μL ब्लॉकिंग बफर (PBST में 10% बकरी सीरम + 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन) के साथ खोजों को इनक्यूबेट करें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 200 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (1:300, बफर को अवरुद्ध करने में) के साथ खोजों को इनक्यूबेट करें। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और पीबीएसटी के साथ 5 x 20 मिनट की अच्छी तरह से धो लें।
    6. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 200 μL फेलोइडिन और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान (ब्लॉकिंग बफर में) के साथ खोजों को इनक्यूबेट करें। फैलोइडिन और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और पीबीएसटी के साथ 5 x 20 मिनट की अच्छी तरह से धो लें।
      नोट: प्रत्येक व्यक्तिगत इमेजिंग एप्लिकेशन के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी एकाग्रता और धोने की लंबाई निर्धारित की जानी चाहिए। सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमेजिंग के लिए, हम आम तौर पर द्वितीयक एंटीबॉडी की एकाग्रता को 1: 500 से 1: 200 तक बढ़ाते हैं और फेलोइडिन की एकाग्रता को 1: 400 से 1: 200 तक बढ़ाते हैं।
    7. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए DAPI (PBST में 1: 1000) के घोल के साथ खोजों को इनक्यूबेट करें। DAPI समाधान निकालें और PBST के साथ 3 x 5 मिनट धो लें।
    8. बीपी के साथ ऊपर की दिशा में (कवरस्लिप के खिलाफ) के साथ स्लाइड पर खोजों को माउंट करने के लिए माउंटिंग मीडिया का उपयोग करें। कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए एंटीफेड माउंटिंग मीडिया का उपयोग करें। बढ़ते मीडिया को अंधेरे में कमरे के तापमान पर रात भर सूखने दें। या तो सीधे छवि बनाएं या इमेजिंग तक स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एसईएम विश्लेषण के लिए ओटीओटीओ निर्धारण
    1. सभी समाधानों को ताजा तैयार करें और स्थानीय सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुसार संभालें। 3 mMCaCl 2 के साथ 0.1 M सोडियम कैकोडाइलेट बफर (pH 7.3) में 2.5% ग्लूटारल्डिहाइड में झिल्ली-सुसंस्कृत खोजों (चरण 4.1.4 से) को ठीक करें। हर 24 घंटे में फिक्सेटिव के परिवर्तन के साथ 24 से 72 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारण करें।
    2. फिक्सेटिव को हटा दें और कमरे के तापमान पर 3 x 5 मिनट 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट के साथ ऊतक को धो लें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1% ओएसओ4 (0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर का उपयोग करके 4% ओएसओ4 स्टॉक से पतला) के साथ द्वितीयक फिक्स। इसे और बाद के चरणों को तब तक करें जब तक कि फ्यूम हुड में निर्जलीकरण न हो।
    3. कमरे के तापमान पर 3 x 5 मिनट 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर का उपयोग करके कुल्ला करें। फिर कमरे के तापमान पर 3 x 5 मिनट डबल डिस्टिल्ड या अल्ट्राप्योर पानी में कुल्ला करें।
    4. अल्ट्राप्योर पानी में थियोकार्बोहाइड्राज़ाइड (टीसीएच) का 0.5% समाधान तैयार करें। 10 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं और कमरे के तापमान पर ठंडा होने पर घोल को छान लें।
      नोट: टीसीएच बेहद खतरनाक है। उपयोग को स्थानीय सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए, और हैंडलिंग करते समय सावधानी बरतनी चाहिए।
    5. नमूने से अल्ट्राप्योर पानी निकालें और बूंद-दर-बूंद 0.5% टीसीएच ड्रॉप जोड़ें। यदि घोल भूरा हो जाता है, तो 0.5% टीसीएच समाधान को सावधानीपूर्वक जोड़ने से पहले, अल्ट्राप्योर पानी के साथ नमूने को रोकें और कुल्ला करें। एक बार समाधान स्पष्ट होने के बाद, इसे 0.5% टीसीएच से बदलें। 20 मिनट30,31 के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    6. कमरे के तापमान पर 3 x 5 मिनट अल्ट्राप्योर पानी के साथ नमूने को धो लें। चरण 4.2.2, 4.2.3, और 4.2.5 को दो बार दोहराएं जो ओएसओ4 इनक्यूबेशन के साथ समाप्त होते हैं और उसके बाद कुल्ला करते हैं।
    7. इथेनॉल श्रृंखला में नमूनों को 100% निर्जल इथेनॉल (ईटीओएच) में निर्जलित करें। पहले 10 मिनट के लिए 25% ईटीओएच में, फिर 10 मिनट के लिए 50% ईटीओएच, 10 मिनट के लिए 75% ईटीओएच, 10 मिनट के लिए 95% ईटीओएच, 10 मिनट के लिए कुल 3 गुना के लिए इनक्यूबेट करें, 100% ईटीओएच में प्रत्येक के लिए कुल 3 गुना के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. तरल सीओ2 का उपयोग करके महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने का प्रदर्शन करें। तुरंत डबल-साइडेड कार्बन चिपकने वाले टेप के साथ एसईएम स्टब पर नमूने माउंट करें। 5-10 एनएम कोटिंग प्रदान करने के लिए स्पटर कोट पर आगे बढ़ें। यदि तुरंत इमेजिंग नहीं की जाती है, तो नमूनों को वैक्यूम के तहत एक डेसिकेटर में स्टोर करें।

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Representative Results

इलेक्ट्रोपोरेशन सेटअप में, इलेक्ट्रोड पोजिशनिंग अभिकर्मक के डोमेन में एक भूमिका निभा सकती है। सकारात्मक इलेक्ट्रोड को जर्दी के नीचे रखा जाता है, और भ्रूण के ऊपर नकारात्मक (चित्रा 1 ए)। इसके परिणामस्वरूप आंतरिक कान और वेस्टिबुलर अंगों (चित्रा 1 बी), और श्रवण बेसिलर पैपिला (चित्रा 1 सी, डी) में उच्च जीएफपी अभिव्यक्ति होती है, जो अभिकर्मक की पुष्टि करती है।

सीआरआईएसपीआर-वध के फेनोटाइप का आकलन करने में, हमने आरएनए को हेयर सेल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एटोनल होमोलॉग 1 (एटोह 1) के लिए गाइड डिज़ाइन किया। एटोह 1 के माउस उत्परिवर्ती बाल कोशिकाओं को बनाने में असमर्थ हैं32; एटोह 1 गाइड आरएनए के इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद और ई 10 तक इनक्यूबेशन, हम पाते हैं कि नियंत्रण, खाली प्लास्मिड नियंत्रण (चित्रा 2) की तुलना में एचसी विकास बिगड़ा हुआ है। यद्यपि इलेक्ट्रोपोरेशन मोज़ेक (चित्रा 2 ई, एफ) है, नियंत्रण इलेक्ट्रोपोरेट कोशिकाएं बाल कोशिकाओं को बनाने में सक्षम हैं। एटोह 1 जीआरएनए इलेक्ट्रोपोरेट नमूनों में, जीएफपी पॉजिटिव कोशिकाएं कभी भी एचसी विकास के मार्कर नहीं दिखाती हैं (चित्रा 2 बी)।

बीपी की अंग संस्कृति ऊतक तक पहुंच प्रदान करती है। कोलेजन जैसे 3 डी मैट्रिक्स में संस्कृतियां, 5 दिनों तक ऊतक आकृति विज्ञान का उत्कृष्ट संरक्षण प्रदान करती हैं। एचसी और एससी का संगठन इन संस्कृति स्थितियों में बनाए रखा जाता है (चित्रा 3)।

इमेजिंग स्टीरियोसिलिया के लिए झिल्ली पर अंग संस्कृतियां बेहतर हैं। बाल बंडल अखंडता को बनाए रखते हुए ऐसी संस्कृतियों को 5 दिनों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है। यह टिप-लिंक प्रोटीन, प्रोटोकैडरिन 1533 (पीसीडीएच 15) (चित्रा 4) के स्थानीयकरण से देखा जा सकता है। बाल बंडल के विकास से पूछताछ के लिए, उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग आवश्यक है, और इस तरह के दृष्टिकोण, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4 डी) या स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4 ई) का उपयोग करके, अधिक पूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं।

Figure 1
चित्र 1. (ए) योजनाबद्ध आरेख जो ई 4 पर चिक ओटिक पुटिका में ओवो माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन को दर्शाता है। इंजेक्शन पिपेट को टोल 2-ईजीएफपी (टी 2 के-ईजीएफपी) और टोल 2-ट्रांसपोसेस (टी 2 टीपी) प्लास्मिड से भरा जाता है, साथ ही विज़ुअलाइज़ेशन के लिए तेज हरी डाई के साथ। (बी) स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर 0.63 एक्स एयर ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करके ई 10 पर इलेक्ट्रोपोरेट किए गए आंतरिक कान की छवि। बाएं आंतरिक कान आंतरिक नियंत्रण है। लाल तीर दाहिने आंतरिक कान के कॉक्लियर वाहिनी में जीएफपी अभिव्यक्ति को चिह्नित करता है, और लाल तारांकन वेस्टिबुलर अंगों में जीएफपी अभिव्यक्ति दिखाता है; स्केल बार 2 सेमी है। (सी) 0.5 एनए के 20 x वायु उद्देश्य का उपयोग करके दाएं कॉक्लियर डक्ट के क्रॉस-सेक्शन की वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस छवि। जीएफपी अभिव्यक्ति ज्यादातर संवेदी उपकला तक ही सीमित है; (डी) एलेक्सा 647 फ्लोरोफोरे के साथ संयुग्मित फेलोइडिन के साथ सना हुआ 0.5 एनए के 10x वायु उद्देश्य का उपयोग करके पूरे माउंट बेसिलर पैपिला की कॉन्फोकल छवि। जीएफपी अभिव्यक्ति बीपी के तंत्रिका पक्ष पर समीपस्थ से डिस्टल छोर तक देखी जाती है; स्केल पट्टी 100 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. CRISPR/Cas9-मध्यस्थता Atoh1 जीन नॉकआउट के माध्यम से ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन के परिणामस्वरूप बाल कोशिकाओं (एचसी) का नुकसान होता है। एटोह 1 जीन गाइड प्लास्मिड pcU6_1-एटोह 1 एसजीआरएनए और ट्रेसर प्लास्मिड टोल 2-ईजीएफपी (टी 2 के-ईजीएफपी) और टोल 2-ट्रांसपोसेस (टी 2 टीपी) के साथ एसपीकेएएस 9 प्रोटीन को ई 4 पर चिक ओटिक पुटिका में माइक्रोइंजेक्ट और इलेक्ट्रोपोरेट किया जाता है। सभी चित्र चिक ई 10 बेसिलर पैपिला से 10 μm स्केल बार के साथ हैं, जिसे लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 1.42 NA के 60x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ कैप्चर किया गया है। सभी छवियों के लिए ज़ूम इनसेट प्रदान किए गए हैं। (ए, बी, सी, डी) बाएं हाथ के पैनल में बाल कोशिकाओं (एचसी) के साथ बीपी होता है, खाली pcU6_1sgRNA और टी 2 के-ईजीएफपी के साथ इलेक्ट्रोपोरेट होता है, और एसपीसीएएएस 9 प्रोटीन के साथ टी 2 टीपी होता है। (E, F, G, H) दाएं हाथ के पैनल में एचसी के नुकसान के साथ बीपी होता है, एटोह 1 गाइड (pcU6_1-एटोह 1 एसजीआरएनए) और टी 2 के-ईजीएफपी के साथ इलेक्ट्रोपोरेट होता है, और एसपीसीएएस 9 प्रोटीन के साथ टी 2 टीपी होता है। (ए, ई) बेसिलर पैपिला में बाल कोशिकाओं (एचसी) को दिखाने वाली मर्ज छवि। ये मायोसिन 7 ए (नीला) के लिए इम्यूनोरिएक्टिव हैं; एलेक्सा 647 (लाल) के साथ संयुग्मित फेलोइडिन के साथ सना हुआ एफ-एक्टिन; टोल 2-ईजीएफपी प्लास्मिड से जीएफपी अभिव्यक्ति का पता एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी (हरे) का उपयोग करके लगाया जाता है। खाली pcU6_1sgRNA (डी) और pcU6_1-एटोह 1 एसजीआरएनए (एच) के साथ उपचार की तुलना करते समय मायोसिन 7 ए विकृति से एचसी का नुकसान स्पष्ट है। दोनों उपचारों से एफ-एक्टिन इमेजिंग एचसी (बी, एफ) के बाल बंडल पर प्रकाश डालती है। (C, G) टी 2 के-ईजीएफपी और टी 2 टीपी का उपयोग अभिकर्मक स्थान और दक्षता को मापने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3. 3 डी-कोलेजन ड्रॉपलेट कल्चर में कॉक्लियर डक्ट की अंग संस्कृति संवेदी उपकला के संगठन को बनाए रखती है। ई 10 पर बीपी को 1 दिन के लिए 3 डी कोलेजन ड्रॉपलेट कल्चर में सुसंस्कृत किया जाता है और लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 1.42 एनए के 60 एक्स तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके चित्रित किया जाता है। (ए) ई 10 के पूरे बीपी की छवि कोलेजन की बूंद में 1 दिन के लिए सुसंस्कृत होती है और हेयर सेल एंटीजन (एचसीए) 34 के खिलाफ एंटीबॉडी से सना होता है। स्केल बार 100 μm है । (B) विलय की गई छवि जो बीपी के बाहर की तरफ से संवेदी उपकला के संरक्षित संगठन को दिखाती है जो (C) फैलोइडिन (हरा) और (D) HCA (नीला) से सना हुआ है; स्केल पट्टी 10 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. इलेक्ट्रॉन और प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत बेसिलर पैपिला के स्टीरियोसिलरी बंडल। 0.1% डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) -उपचारित बीपी को ई 10 पर खोजा गया और झिल्ली संस्कृति सम्मिलित पर विट्रो (डीआईवी) में 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया। (ए) लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ 1.42 एनए के 60 एक्स तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके खोज को चित्रित किया गया है। विलय की गई छवि एलेक्सा 488 (हरे) के साथ संयुग्मित फेलोइडिन द्वारा चिह्नित प्रोटोकैडरिन 15 (पीसीडीएच 15) और स्टीरियोसिलिया की अभिव्यक्ति दिखाती है। एफ-एक्टिन (बी) और पीसीडीएच 15 (सी) की एकल-चैनल छवियां दिखाई गई हैं। स्केल बार 10 μm है ( D) हरे रंग में एलेक्सा 488 धुंधला होने के साथ संयुग्मित फेलोइडिन के साथ सना स्टीरियोसिलिया की सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि। छवि लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के एयरिस्कैन मोड में 1.42 एनए के 63 एक्स तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त की गई थी। (ई) एसईएम छवि 7 केवी इलेक्ट्रॉन हाई टेंशन (ईएचटी) वोल्टेज का उपयोग करके 16340x आवर्धन पर ली गई थी। लाल तारांकन चिह्न किनोसिलिया और लाल वेज स्टीरियोसिलिया को चिह्नित करता है। चमक और कंट्रास्ट को ऑटो में समायोजित किया गया था और फिजी का उपयोग करके छवि को तेज किया गया था। स्केल पट्टी 1 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

चूजा मॉडल जीवों के लिए एक लागत प्रभावी और सुविधाजनक अतिरिक्त है जिसका उपयोग एक प्रयोगशाला आंतरिक कान पर शोध करने के लिए कर सकती है। यहां वर्णित विधियों का उपयोग नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में किया जाता है और स्तनधारी आंतरिक कान में चल रहे शोध के पूरक हैं। ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग चूजे के जीनोम में आनुवंशिक जोड़तोड़ पेश करने के लिए किया जाता है। इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग उन संरचनाओं को पेश करने के लिए भी किया जा सकता है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन को विशेष ऑर्गेनेल या उपकोशिकीय संरचनाओं35,36 पर लक्षित करते हैं। हालांकि यह एक सरल प्रक्रिया है, ओवो में भ्रूण का हेरफेर व्यवहार्यता को प्रभावित करता है। कुशल इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए, अंडे को ताजा (बिछाने के तुरंत बाद) खरीदा जाना चाहिए। मृत्यु दर और / या असामान्य विकास में वृद्धि अक्सर अंडे में देखी जाती है जो 5 दिनों से अधिक समय तक संग्रहीत किए गए हैं। बाँझ तकनीक का उपयोग, यह सुनिश्चित करना कि अंडे को ठीक से सील किया गया है ताकि यह नमी न खोए, और भ्रूण पर किए गए जोड़तोड़ को कम करने से व्यवहार्यता बढ़ जाती है।

हमने पाया कि ई 3.5 से ई 4 पर ओटोसिस्ट को लक्षित करने से भ्रूण के सामने आने वाले आघात कम हो जाते हैं, और सावधानीपूर्वक तैनात इलेक्ट्रोड का उपयोग करने से बीपी के संवेदी अग्रदूतों के अच्छे लक्ष्यीकरण की अनुमति मिलती है। हालांकि, इस चरण तक, ध्वनिक-वेस्टिबुलर गैंग्लियन के अग्रदूत पहले से ही आंतरिक कान37,38 से दूर चले गए हैं। इन कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए, ओटोसिस्ट इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए पहले के समय बिंदुओं का चयन किया जाना चाहिए, और व्यवहार्यता में इसी कमी के लिए आवास बनाए जाने चाहिए। सावधानी का एक और नोट इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूण में मोज़ेकिज्म की संभावना है। सभी कोशिकाएं सभी प्लास्मिड को नहीं लेती हैं, और इस प्रकार मोज़ेकिज़्म व्याख्या को भ्रमित कर सकता है। ट्रेसर प्लास्मिड का उपयोग डेटा व्याख्या में मदद करता है और संभावित मोज़ेक प्रभावों पर कुछ नियंत्रण प्रदान करता है। कई दोहराव, सावधानीपूर्वक विश्लेषण और सांख्यिकीय तरीकों का उपयोग मोज़ेक फेनोटाइप के मूल्यांकन में सहायता करेगा। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से संशोधित बटेर39 का उपयोग करना है। वर्तमान में, ये संख्या सीमित हैं और हमेशा कई प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं। हालांकि, उपलब्धता में वृद्धि होगी, और बटेर भ्रूण, जो संवैधानिक रूप से उप-सेलुलर रूप से लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, इमेजिंग प्रयोगों के लिए एक आकर्षक प्रस्ताव है।

इस विधि में, हम सीआरआईएसपीआर मध्यस्थता के लिए प्रोटीन और डीएनए को गैर-समरूप अंत जुड़ने (एनएचईजे) 24 के माध्यम से इलेक्ट्रोपोरेट करते हैं। CRISPR/Cas9 ने होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (HDR) के माध्यम से संलयन संरचनाओं की मध्यस्थता पीढ़ी इस विशेष प्रतिमान (सिंह और अन्य, अप्रकाशित अवलोकन) में अक्षम बनी हुई है। इलेक्ट्रोपोरेशन विधि को अन्य प्रकार के डीएनए संरचनाओं के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (ये संलयन प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले निर्माण हो सकते हैं), साथ ही आरएनए और प्रोटीन के लिए भी। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विकास (और कोशिका विभाजन) के दौरान डीएनए आधारित अभिव्यक्ति संरचनाएं तब तक कमजोर हो जाएंगी जब तक कि वेक्टर उन साइटों को शामिल नहीं करता है जो इन कोशिकाओं के जीनोम में बहिर्जात डीएनए के सम्मिलन को मध्यस्थ करते हैं (जैसे, टोल 2 या पिगीबैक)। यह निर्माण की अधिक स्थिर अभिव्यक्ति की अनुमति देता है।

इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, भ्रूण को आमतौर पर बाल कोशिका भेदभाव और विकास अध्ययन के लिए ई 10 चरण तक ओवो में सुसंस्कृत किया जाता है। लेकिन यदि आवश्यक हो, तो ओवो संस्कृति में अंडे निकलने तक जारी रखा जा सकता है; हालांकि, इनक्यूबेशन की बढ़ती लंबाई के साथ व्यवहार्यता में इसी तरह की गिरावट आई है। इसे दरकिनार करने के लिए, ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन को बीपी विच्छेदन के साथ जोड़ा जा सकता है जिसके बाद दीर्घकालिक एक्स ओवो कल्चर होता है। 3 डी मैट्रिक्स के भीतर खोजों की खेती ऊतक आकृति विज्ञान के अच्छे संरक्षण की अनुमति देती है। इस विधि का उपयोग ऊतक पैटर्निंग, ध्रुवीयता और भेदभाव में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। एक झिल्ली पर बीपी की संस्कृति ऊतक27 के एपिकल पक्ष के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है, विशेष रूप से स्टीरियोसिलिया के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग।

कुछ मामलों में, विभिन्न छोटे अणु-आधारित उपचारों का उपयोग करके आनुवंशिक संशोधन की सीमाओं को दूर किया जा सकता है। औषधीय रूप से सक्रिय यौगिक सिग्नलिंग मार्गों या सेल जैविक प्रक्रियाओं के लिए अवरोधक या एगोनिस्ट के रूप में कार्य करते हैं। उनका आवेदन अस्थायी आवश्यकता को विच्छेदित करने में विशेष रूप से उपयोगी है। हालांकि, वितरण के सटीक तरीकों और इष्टतम सांद्रता को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि कुछ मामलों में सेल लाइनों में किया गया मानकीकरण ऊतकों में आवश्यक खुराक के बराबर नहीं है। भ्रूण के भीतर प्रसव समस्याग्रस्त हो सकता है, और अन्य अंग प्रणालियों पर प्रभाव के साथ संयुक्त आवश्यक मात्रा व्यवहार्यता से काफी समझौता कर सकती है। एक तैयार विकल्प अंग संस्कृति विधियां 20,21,22 हैं। हालांकि, सटीक संस्कृति विधि अध्ययन और विश्लेषण के प्रकारों पर निर्भर करती है जो इच्छित हैं। जबकि कोलेजन संस्कृति बीपी के ऊतक आकृति विज्ञान को संरक्षित करती है, झिल्ली संस्कृति एचसी के एपिकल बाल बंडलों का अध्ययन करने के लिए बेहतर अनुकूल है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एपिकल सतह की कल्पना करने के लिए ऊतक को झिल्ली के शीर्ष पर रखा जा सकता है। अंग संस्कृति के लिए विच्छेदन के लिए अच्छे अभ्यास की आवश्यकता होती है। इनमें बाँझ कार्यक्षेत्र बनाए रखना और तेज उपकरणों का उपयोग करना शामिल है। इस तरह के माइक्रोडिसेक्शन टूल संवेदनशील हैं, और हम माइक्रोसर्जिकल टूल की अखंडता को संरक्षित करने में सिलिकॉन व्यंजनों का उपयोग महत्वपूर्ण पाते हैं।

साथ में, तकनीक आंतरिक कान के विकास की समझ को आगे बढ़ाने के लिए मूल्यवान दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है। तुलनात्मक जीव विज्ञान और पुनर्जनन में अंतर्दृष्टि जो चूजा भ्रूण प्रदान करते हैं, बाल कोशिका विकास और कार्य में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

हम एनसीबीएस, टीआईएफआर, इंफोसिस-टीआईएफआर लीडिंग एज रिसर्च ग्रांट, डीएसटी-एसईआरबी और रॉयल नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर द डेफ से समर्थन को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं। हम केंद्रीय कुक्कुट विकास संगठन और प्रशिक्षण संस्थान, हेसरघट्टा, बेंगलुरु को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम सीआईएफएफ और ईएम सुविधा और एनसीबीएस में प्रयोगशाला समर्थन के आभारी हैं। हम योशिको ताकाहाशी और कोइची कवाकामी को टोल 2-ईजीएफपी और टी 2 टीपी निर्माण के लिए धन्यवाद देते हैं, और गाइ रिचर्डसन एचसीए और जी 1 9 पीसीडीएच 15 एंटीबॉडी के लिए। हम प्रोटोकॉल पर उनके निरंतर समर्थन और मूल्यवान प्रतिक्रिया के लिए ईयरलैब सदस्यों के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 Integrated DNA Technologies 1081061 High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibody Abcam ab290 Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Calcium Chloride Dihydrate Thermo Fisher Scientific Q12135
Collagen I, rat tail Thermo Fisher Scientific A1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 Leica
CUY-21 Electroporator Nepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
DM5000B Widefield Microscope Leica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569010
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252
Fluoroshield Sigma-Aldrich F6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope Olympus
Glutaraldehyde (25 %) Sigma-Aldrich 340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
Goat Serum Sterile filtered HiMedia RM10701 Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14025092
LSM980 Airyscan Microscope Zeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm Sigma-Aldrich PICM03050
MVX10 Stereo Microscope Olympus
MYO7A antibody DSHB 138-1 Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscope Leica
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'') World Precision Instruments 501237
Osmium tetroxide (4%) Sigma-Aldrich 75632
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PC-10 Puller Narishige
pcU6_1sgRNA Addgene 92395 Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
SMZ1500 Dissecting microscope Nikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M Electron Microscopy Sciences 11652
Sodium chloride HiMedia GRM853
Sputtre Coater K550X Emitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament World Precision Instruments 1B100-3
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
The MERLIN Compact VP Zeiss
Thiocarbohydrazide Alfa Aesar L01205
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 184
ओवो और <em>एक्स ओवो</em> विधियों <em>में</em> एवियन इनर कान के विकास का अध्ययन करने के लिए
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Singh, N., Prakash, A.,… More

Singh, N., Prakash, A., Chakravarthy, S. R., Kaushik, R., Ladher, R. K. In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development. J. Vis. Exp. (184), e64172, doi:10.3791/64172 (2022).

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