Summary
ひよこは、さまざまな研究のために費用効果が高く、アクセスしやすく、広く利用可能なモデル生物です。ここでは、鳥類の内耳の発達と再生の根底にある分子メカニズムを理解するための一連のプロトコルが詳述されています。
Abstract
内耳は音を知覚し、蝸牛と前庭を使用してバランスを維持します。これは、有毛細胞として知られる専用の機械感覚細胞タイプを使用して行われます。内耳の基礎研究は、有毛細胞がどのように機能するか、そして調節不全がどのように難聴やめまいにつながるかについての深い理解につながりました。この研究では、マウスが卓越したモデルシステムとなっています。しかし、マウスは、すべての哺乳類と同様に、有毛細胞を置き換える能力を失っています。したがって、内耳機能を回復するための細胞療法を理解しようとするとき、他の脊椎動物種での補完的な研究はさらなる洞察を提供する可能性があります。鳥の聴覚上皮である脳底乳頭(BP)は、支持細胞(SC)によって挿入された機械感覚有毛細胞(HC)で構成される上皮のシートです。脳底乳頭と哺乳類の蝸牛の解剖学的構造は異なりますが、内耳の発達と聴覚の分子メカニズムは似ています。これにより、脳底乳頭は比較研究だけでなく、再生を理解するための有用なシステムになります。ここでは、鶏内耳の解剖・操作技術について述べる。この手法は、遺伝的および低分子阻害法を示しており、内耳発生の分子メカニズムを研究するための強力なツールを提供します。本稿では、CRIPSR-Cas9欠失を用いて脳底乳頭を遺伝的に摂動させ、その後脳底乳頭を解剖する ovo エレクトロポレーション技術について議論する。また、BP臓器培養と培養マトリックスの最適な使用を実証し、上皮と有毛細胞の発達を観察します。
Introduction
すべての脊椎動物の内耳は、耳のプラコード1,2として知られる単純な上皮に由来します。これにより、聴覚とバランスの知覚に関連する機械感覚情報を伝達するために必要なすべての構造要素と細胞型が生じます。内耳の繊毛センサーである有毛細胞(HC)は、支持細胞(SC)に囲まれています。HCは、第8脳神経のニューロンを介して聴覚後脳に情報を中継します。これらも耳プラコード3から生成される。音の一次伝達は、機械的に敏感な毛束4を介して、聴覚HCの頂端表面で達成される。これは、立体繊毛と呼ばれる修飾されたアクチンベースの突起を介して媒介され、それらは傾斜した階段パターン5に配置されています。さらに、キノシリウムと呼ばれる修飾一次繊毛は、毛束形成を組織し、ステレオ繊毛の最も高い列に隣接しています6,7,8。ステレオ繊毛の構造は、音響エネルギーに由来する機械的刺激を電気的神経信号に変換するこの役割にとって重要です9。加齢、感染、耳音響外傷、または耳毒性ショックによる聴覚HCの損傷は、哺乳類では不可逆的な部分的または完全な難聴を引き起こす可能性があります10。
そのような損傷を修復する可能性のある細胞補充療法が提案されている11,12。この研究のアプローチは、哺乳類の有毛細胞の正常な発達を理解し、内耳13内に存在する可能性のある前駆細胞で発生プログラムを再開できるかどうかを尋ねることでした。第2のアプローチは、哺乳類の外側、鳥類などの聴覚有毛細胞の強力な再生が起こる非哺乳類の脊椎動物に目を向けることでした14,15。鳥類では、有毛細胞の再生は、主に支持細胞の前駆細胞様状態への脱分化、続いて非対称有糸分裂によって有毛細胞および支持細胞16を生成することによって起こる。また、有毛細胞を生成する支持細胞の直接分化も認められている17。
鳥類の聴覚発達のメカニズムは哺乳類のそれと有意な類似性を示していますが、違いがあります18。ニワトリBPにおけるHCおよびSC分化は、胚期(E)7日目から明らかになり、時間とともにより明瞭になる。E12によって、よくパターン化され、よく分極された脳底乳頭(BP)を視覚化することができ、E17によって、よく発達した有毛細胞を見ることができます19。これらの時点は、分化、パターン形成、極性、および有毛細胞の成熟のメカニズムへの窓を提供します。このようなメカニズムが保存されているか分岐しているかを理解することは、機械感覚有毛細胞の起源の深い相同性への洞察を提供するため、重要です。
ここでは、内耳器官の発達全体にわたる増殖、運命の特定、分化、パターン形成、維持などの細胞プロセスを研究するために、初期および後期の胚期に実行される一連の技術を示します。これは、外植片培養における内耳の発達を理解するための他のプロトコルを補完するものです20,21,22。まず、Ovoエレクトロポレーションを用いてE3.5耳嚢胞内のBP前駆体に外因性DNAまたはRNAを導入する方法について説明します。遺伝子操作は貴重な洞察を提供することができますが、このようにして生成された表現型は多面的であり、その結果、交絡する可能性があります。これは、細胞骨格リモデリングなどの基本的なプロセスが細胞分裂、組織形態形成、および細胞の特殊化において複数の役割を果たす後期の内耳発達に特に当てはまります。本研究では、外植体培養における薬理阻害のプロトコールを提示し、投与量や治療のタイミングや期間の制御に利点をもたらし、発生機構の正確な時空間操作を提供します。
小さな阻害剤の処理期間に応じて、さまざまな臓器培養方法を利用できます。ここでは、上皮の形態形成と細胞の特殊化に関する洞察を可能にする2つの臓器培養方法を示します。コラーゲンをマトリックスとして蝸牛管を培養する3D培養法は、発達中のBPの堅牢な培養とライブ可視化を可能にします。ステレオ繊毛の形成を理解するために、硬いマトリックス上で上皮組織を培養し、アクチン突起を自由に成長させる膜培養法を紹介します。どちらの方法でも、ライブセルイメージング、免疫組織化学、走査型電子顕微鏡(SEM)、細胞記録などのダウンストリーム処理が可能です。これらの技術は、鳥類の聴覚上皮の発生、成熟、再生を理解および操作するためのモデルシステムとしてひよこを効果的に使用するためのロードマップを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
受精鶏卵と孵化していない胚の調達、培養、使用を含むプロトコルは、カルナータカ州バンガロールの国立生物科学センターの制度的動物倫理委員会によって承認されました。
1. ニワトリ聴覚前駆体の ovo エレクトロポレーション
- CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトのためのsgRNA設計とクローニング
- 遺伝子ノックアウトを作成するために、遺伝子のエクソン領域を破壊するようにガイドRNAを設計し、好ましくはコード領域の5'末端に近い。
- ウェブツールCRISPOR23を使用して潜在的なガイドRNAを選択します。ブラウザデータを ガルスガルス に設定し、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を5'-NGG -3'に設定します。プログラムは、入力配列からガイドRNAを決定し、オンターゲットおよびオフターゲット活性に基づいて異なるスコアを割り当てます。さらなる研究のために上位4つのガイドを選択してください。
- ガイド(g)RNA生産用のテンプレート特異的オリゴを設計するには、gRNA設計ツールの出力からPAM配列(5'-NGG -3')を削除します。これはターゲティングには必要ありませんが、Cas9切断認識シーケンスが含まれています。各潜在的なgRNAについて、両端にBsmBI制限部位を有する2つのHPLC精製相補的オリゴを合成します。
- 選択したベクターのtracrRNAスキャフォールドを用いてガイド配列をフレーム内にクローニングする(ここでは、ベクター pcU6_1sgRNA24を用いた)。
- sgRNAオリゴヌクレオチドを100 μMの濃度でDNase/RNaseフリーの水に溶解します。サーモサイクラーを使用して、2つのセンスオリゴガイドとアンチセンスオリゴガイドのアニーリングを次のパラメータで実行します:95°Cで3分間、次に37°Cで15分間、次に4°Cに下げます。
- 25に記載の標準的な分子生物学的手法を用いて、アニールされたオリゴの制限消化をセットアップし、BsmBI酵素でクローニングベクター pcU6_1sgRNA一晩セットアップした。ゲル精製した直鎖状BsmBI消化pcU6_1sgRNAベクターおよび消化sgRNAオリゴによるライゲーションのセットアップ。DH5-αコンピテントセルに形質転換し、得られたクローンを配列確認する。
- 卵の取り扱いとウィンドウ
- 産みたての卵を調達し、汚染を防ぐために70%エタノールで拭いてきれいにします。37〜38°C、湿度45%で3.5〜4日間インキュベートします。
- 孵卵後、開く前に少なくとも5分間卵を横に置きます。これにより、胚は卵黄の上部に再配置できます。鉗子を使用して、21Gの針が通過できるように、卵の上部と鈍い端に小さな穴を開けます。
- ウィンドウイング中の損傷を防ぐために、アルブミンを除去して胚を殻から遠ざけます。これを行うには、5 mLシリンジと21G針を使用して、卵の鈍い端にある穴から2 mLのアルブミンを注意深く引き出します。透明なテープを使用して、鈍端の穴を覆います。
- 卵窓を作るには、卵殻の上部に透明なテープを貼り付けます。スプリングボウハサミを使用して、長さ約2 cm、幅1.5 cmの窓を切り開き、胚を露出させます。鉗子を使用して胚の上にある絨毛膜を開き、胚へのアクセスを可能にします。
- マイクロインジェクションプラスミド
- 遺伝子ノックアウト実験のために、SpCas9タンパク質とガイドプラスミド-pcU6_1sgRNAを含むノックダウンミックスと、T2K-eGFP(これはTol2のトランスポゾン部位に囲まれたGFPカセットを駆動するニワトリβ-アクチンプロモーター)とT2TP(Tol2構築物26,27でクローニングされたTol2トランスポザーゼ)のトレーサープラスミドミックスの2つの溶液を調製します。トレーサーは、エレクトロポレーション効率を追跡するために使用されます。
- 複数のプラスミドをエレクトロポレーションする場合は、DNAの最終濃度が少なくとも4 μg/μLであることを確認してください。 ガイドプラスミド pcU6_1sgRNA、T2K-eGFP、T2TP の 3 つのコンストラクトを、1 μg の SpCas9 タンパク質、30% スクロース、および 0.1% Fast Green 色素と 1:1:1 の比率で最終容量 10 μL で混合します。
- 垂直ピペットプーラーを使用して、標準的なガラスキャピラリー(長さ3インチ、外径1.0 mm)からマイクロインジェクション用の針を引きます。引っ張った後、細かい鉗子を使用して毛細管先端を切り離し、先細りの端で約50μmの先端直径を得ます。
- 胚を左側のE3.5に置き、頭を右に向けています。このようにして、マイクロインジェクションのために右耳小胞のみがアクセス可能である。ノックダウンミックスを耳小胞にマイクロインジェクションします。約200 nLのDNA溶液混合物を注入して、耳小胞を満たします。
- T7エンドヌクレアーゼアッセイ28を用いてガイド効率を決定する。
- エレクトロポレーション
- エレクトロポレーションの前に胚の上に0.719%生理食塩水を数滴加えて、電気抵抗を下げ、胚の過熱を防ぎます。
- アルブミンを除去したときに卵の鈍い側に作られた穴に正極を通します。電極が卵黄の下になるように操作します。満たされた耳嚢胞の上に負極を置きます。
- エレクトロポレーションを使用して、プラスミドを胚の細胞にトランスフェクトします。方形パルス発生器を使用して、それぞれ25Vと100msの持続時間の5つのパルスを50ms間隔で印加します。個々のエレクトロポレーション設定に基づいて経験的に条件を決定します。
- エレクトロポレーション後に0.719%生理食塩水を数滴加えて胚を水和させる。電極の表面から変性アルブミンをきれいにするには、蒸留水で十分にすすいでください。卵を透明なテープで再密封し、さらにインキュベーションするために37〜38°Cで加湿インキュベーターに戻します。
注:胚はエレクトロポレーション後に孵化するまで培養できますが、生存率は急激に低下します。
2.脳底乳頭解剖
- 70%エタノールを使用して、手術台、顕微鏡ステージ、およびその周辺を消毒します。熱またはアルコールは、最小限のスプリングボウハサミ、マイクロキュレット、および2組の細かい鉗子を含むマイクロダイセクション装置を滅菌します。
- 次の解剖プレートを準備します:黒いシリコンベースのガラスペトリ皿、90 mmのプラスチック製のペトリ皿、および60 mmのペトリ皿。解剖のためにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはハンクス平衡塩溶液(HBSS)のいずれかを冷やします。
- 卵を90mmのペトリ皿にそっと割る。ひよこの外耳を特定します。ハサミを使用して下顎の高さのすぐ下で首を切って胚を斬首します。氷冷PBSで満たされた60mmのペトリ皿に頭を移します。
- くちばしの上部を実験者の方に向け、#5鉗子の1つを使用してくちばしを保持します。2番目の#5鉗子を使用して目をすくい取ります。吻側から尾側に移動し、正中線に沿って頭蓋骨を切ります。脳をすくい取ります。
- 氷のように冷たいPBSまたはHBSSを追加し、耳介のレベルに近い2つの光沢のある構造を見つけます。これらは蝸牛管の端にあるラゲナの耳石であり、正中線の近くに見られます。
- 2つのラゲナの間を大まかに切り、この領域の上下をかなり上回って、2つの内耳を分離します。斜めの照明の下で、内耳の輪郭を視覚化します。無関係な組織と前庭を取り除きます。
- 単離した蝸牛を、氷冷PBSを備えた黒色のシリコンベースプレートに移します。#5鉗子を使用して、軟骨性蝸牛嚢を剥がして蝸牛管を取得します。蝸牛管の起伏のある層(被蓋)を見つけ、#55鉗子を使用してBPを露出させます。 #55鉗子を使用して、構造膜を除去してHCとSCを露出させます。
3.脳底乳頭外植片の培養
- BPの膜培養
- 6ウェルの組織培養プレートを取り、1ウェルにつき1つの培養膜インサートを配置します。
- 解剖した脳底乳頭(外植片)を1x HBSSバッファーを含む200 μLピペットに集め、メンブレンに移します。組織がピペットの壁に付着するのを防ぐために、組織を吸引する前にいくつかの媒体を作成します。
- 脳底乳頭が上を向くように外植体を向け、毛髪と支持細胞が上部29から見えるようにします。外植片を配置したら、培養膜表面からHBSSバッファーをゆっくりと吸引します。このプロセスでは、外植片は培養膜に付着します。
- メンブレンインサートとウェル壁の間に1.2 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)培養液を加え、6ウェルプレートのウェルを満たします。1つの30 mm培養膜で最大6つの外植片を培養できます。
- 蝸牛管のコラーゲン培養
- 組織培養フードに400 μLの3 mg/mLラットテールコラーゲン、50 μLの10x DMEM、30 μLの7.5%NaHCO3、および5 μLのHEPESを加えて、コラーゲン混合物を調製します。
- 4ウェルプレートを取り、各ウェルにコラーゲン混合物を3滴加えます。解剖した蝸牛管を各コラーゲン滴に移します。プレートを37°Cで10分間インキュベートし、5%CO2 でコラーゲンマトリックスを硬化させた。
- 培養物の低分子処理
- 薬理学的調節剤またはその溶媒のみ(対照として使用するため)のいずれかで培養培地(DMEM、N-2サプリメント、ペニシリン)を調製します。培養液を、阻害剤を添加した700 μLの培地と交換します。外植体をインキュベーター内で37°C、5%CO2で培養する。
- 培地の50%を毎日交換してください。適切なインキュベーション時間の後、培地を取り出し、下流アッセイに外植片を使用します。
4. イメージングと解析
- 免疫蛍光分析
- ウェルから培地を取り出し、1x HBSSで外植片を2回洗浄します。ピペットを使用して、1 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)をウェルに加え、室温で20分間インキュベートします。
- PFAを除去し、室温で1x PBSで外植体を3回洗浄します。培養膜から外植体を採取するには、小さなスプリングボウハサミを使用して組織片を含む膜の周りに小さな切り込みを入れ、鉗子を使用して膜と一緒に組織を48ウェル培養プレートに移します。
注:固定後に組織が浮遊している場合は、200 μLのピペットで吸引し、さらに処理するために48ウェルプレートに移します。膜からの組織の強制的な剥離を避けてください。 - コラーゲン液滴培養では、鉗子を使用してコラーゲン滴全体をシリコンプレートに移します。200 μLの1x PBSを加え、鉗子を使用してコラーゲンを除去してから、組織を48ウェル培養プレートに移します。
- 0.3%Tween-20(PBST)を添加した1 mLの1x PBSを室温で30分間移植片に透過処理します。外植体を200 μLのブロッキングバッファー(10%ヤギ血清+ 1%ウシ血清アルブミンPBST溶液)で室温で1時間インキュベートします。
- 外植体を200 μLの一次抗体溶液(1:300、ブロッキングバッファー中)で4°Cで一晩インキュベートします。 一次抗体溶液を除去し、外植片をPBSTで5 x 20分徹底的に洗浄します。
- 外植体を200 μLのファロイジンおよび二次抗体溶液(ブロッキングバッファー中)とともに、室温、暗所で1時間インキュベートします。ファロイジンと二次抗体溶液を除去し、外植片をPBSTで5 x 20分徹底的に洗浄します。
注:二次抗体の濃度と洗浄時間は、個々のイメージングアプリケーションごとに決定する必要があります。超解像顕微鏡を用いたイメージングでは、通常、二次抗体の濃度を1:500から1:200に増やし、ファロイジンの濃度を1:400から1:200に上げます。 - 外植片をDAPI溶液(PBSTで1:1000)で室温で15分間インキュベートします。DAPI溶液を取り出し、外植片をPBSTで3 x 5分洗浄します。
- 封入剤を使用して、BPが上向き(カバーガラスに対して)を向いたスライドに外植片を取り付けます。共焦点イメージングには、退色防止マウントメディアを使用します。封入剤を室温の暗所で一晩乾燥させます。直接画像化するか、画像化までスライドを4°Cで保存します。
- SEM分析のためのオトト固定
- すべての溶液を新鮮に準備し、地域の安全ガイドラインに従って取り扱います。膜培養外植片(ステップ4.1.4から)を、3 mM CaCl 2を含む0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファー(pH 7.3)中の2.5%グルタルアルデヒドに固定します。4°Cで24〜72時間固定を行い、24時間ごとに固定液を交換します。
- 固定液を取り出し、0.1 Mカコジル酸ナトリウムで組織を室温で3 x 5分洗浄します。1%OsO 4(0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファーを使用して4%OsO4ストックから希釈)で室温で1時間二次固定します。ドラフトで脱水するまで、これと後続の手順を実行します。
- 0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファーを使用して、室温で3 x 5分間すすぎます。その後、室温で3 x 5分間二重蒸留水または超純水ですすいでください。
- チオカルボヒドラジド(TCH)の超純水に0.5%溶液を調製します。75°Cで10分間攪拌し、室温に冷却されたら溶液をろ過します。
注:TCHは非常に危険です。使用は地域の安全委員会の承認が必要であり、取り扱いには注意が必要です。 - サンプルから超純水を除去し、0.5%TCHを滴ずつ添加します。溶液が褐色に変わったら、サンプルを停止して超純水ですすぎ、0.5%TCH溶液を慎重に添加してください。溶液が明らかになったら、0.5%TCHに置き換えます。室温で20分間インキュベートします 30,31.
- 室温で3 x 5分間超純水でサンプルをすすぎます。手順4.2.2、4.2.3、および4.2.5をさらに4回繰り返し、OsO4 インキュベーションとそれに続くすすぎで終了します。
- エタノールシリーズのサンプルを100%無水エタノール(EtOH)に脱水します。最初に25%ETOHで10分間インキュベートし、次に50%ETOHで10分間、75%EtOHで10分間、95%ETOHで10分間インキュベートした後、100%ETOHでそれぞれ合計3倍で10分間インキュベートします。
- 液体CO2を用いて臨界点乾燥を行う。すぐにサンプルを両面カーボン粘着テープでSEMスタブに取り付けます。スパッタコートに進み、5〜10nmのコーティングを提供します。すぐにイメージングしない場合は、真空下でサンプルをデシケーターに保管してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
エレクトロポレーションのセットアップでは、電極の位置決めがトランスフェクションの領域で役割を果たすことができます。正極は卵黄の下に、負極は胚の上に配置されます(図1A)。これにより、内耳の大部分と両前庭器官(図1B)、および聴覚脳底乳頭(図1C、D)でGFP発現が高くなり、トランスフェクションが確認されます。
CRISPRノックダウンの表現型を評価する際に、有毛細胞転写因子Atonalホモログ1(Atoh1)へのガイドRNAを設計しました。Atoh1のマウス変異体は有毛細胞を形成することができない32;Atoh1ガイドRNAのエレクトロポレーションとE10までのインキュベーション後、コントロール、空のプラスミドコントロールと比較するとHC発生が損なわれることがわかりました(図2)。エレクトロポレーションはモザイクですが(図2E、F)、コントロールエレクトロポレーション細胞は有毛細胞を形成することができます。Atoh1 gRNAエレクトロポレーションサンプルでは、GFP陽性細胞はHC発生のマーカーを示すことはありません(図2B)。
BPの器官培養は、組織へのアクセス可能性を提供する。コラーゲンなどの3Dマトリックスでの培養は、最大5日間、組織形態の優れた保存を提供します。HCおよびSCの組織は、これらの培養条件下で維持される(図3)。
メンブレン上の臓器培養は、ステレオ繊毛のイメージングに適しています。このような培養物は、毛束の完全性を維持しながら最大5日間培養することができる。これは、チップリンクタンパク質であるプロトカドヘリン1533 (Pcdh15)の局在によって見ることができます(図4)。毛束の発達を調べるには、より高解像度のイメージングが必要であり、超解像顕微鏡(図4D)または走査型電子顕微鏡(図4E)のいずれかを使用したそのようなアプローチにより、より完全な情報が得られます。
図 1.GFP発現は、E4での ovo エレクトロポレーション後のE10 で見ることができます。 (a)E4におけるニワトリ耳小胞における ovo マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションにおける示す模式図。インジェクションピペットには、Tol2-eGFP(T2K-eGFP)およびTol2-トランスポザーゼ(T2TP)プラスミドと、可視化用の高速緑色色素が充填されています。(B)実体顕微鏡上の0.63倍の空気対物レンズを用いたE10のエレクトロポレーション内耳の画像。左内耳は内部コントロールです。赤い矢印は右内耳の蝸牛管におけるGFP発現を示し、赤いアスタリスクは前庭器官におけるGFP発現を示す。スケールバーは2cmです。 (C)0.5NAの20倍の空気対物レンズを使用した右蝸牛管の断面の広視野蛍光画像。GFP発現は主に感覚上皮に限定されます。スケールバーは10μmです。 (D)Alexa 647フルオロフォアと結合したファロイジンで染色した0.5 NAの10倍の空気対物レンズを使用して画像化された山底乳頭全体の共焦点画像。GFP発現は、BPの神経側の近位端から遠位端まで観察されます。スケールバーは100μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.CRISPR/Cas9を介したAtoh1遺伝子ノックアウトは、 卵管エレクトロ ポレーションを介して有毛細胞(HC)を失います。 Atoh1遺伝子ガイドプラスミドpcU6_1-Atoh1sgRNAおよびトレーサープラスミドTol2-eGFP(T2K-eGFP)およびSpCas9タンパク質を含むTol2-トランスポザーゼ(T2TP)をマイクロインジェクションし、E4のニワトリ耳小胞にエレクトロポレーションします。すべての画像は、レーザー共焦点顕微鏡を使用して1.42NAの60倍の油浸対物レンズで撮影された、10μmのスケールバーを備えたひよこE10脳底乳頭からのものです。ズームインインセットは、すべての画像に提供されます。(A,B,C,D)左側のパネルには、有毛細胞(HC)を含むBPと、空のpcU6_1sgRNAとT2K-eGFPでエレクトロポレーションされ、SpCas9タンパク質を含むT2TPが含まれています。(E,F,G,H)右側のパネルには、Atoh1ガイド(pcU6_1-Atoh1sgRNA)およびT2K-eGFPでエレクトロポレーションされたHCが失われたBPと、SpCas9タンパク質を含むT2TPが含まれています。(A,E)脳底乳頭の有毛細胞(HC)を示すマージ画像。これらはミオシン7a(青色)に対して免疫反応性があります。Alexa 647(赤色)と結合したファロイジンで染色されたF-アクチン;Tol2-eGFPプラスミドからのGFP発現は、抗GFP抗体(緑色)を用いて検出される。HCの喪失は、空のpcU6_1sgRNA(D)およびpcU6_1-Atoh1sgRNA(H)との治療を比較すると、ミオシン7aの免疫反応性から明らかです。両方の治療からのF-アクチンイメージングは、HC(B、F)の毛束を強調します。(C,G)T2K-eGFPおよびT2TPは、トランスフェクションの位置と効率を測定するために使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.3Dコラーゲン液滴培養における蝸牛管の臓器培養は、感覚上皮の組織を維持する。E10のBPを3Dコラーゲン液滴培養で1日間培養し、レーザー共焦点顕微鏡を用いて1.42NAの60倍油浸対物レンズを用いてイメージングします。(A)コラーゲン液滴中で1日間培養し、有毛細胞抗原(HCA)34に対する抗体で染色したE10の全BPの画像。スケールバーは100μmです。 (B)(C)ファロイジン(緑)および(D)HCA(青)で染色されたBPの遠位側からの感覚上皮の保存された組織を示すマージ画像;スケールバーは10μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.電子顕微鏡および光学顕微鏡下での脳底乳頭の立体繊毛束。 0.1%ジメチルスルホキシド(DMSO)処理BPをE10で移植し、膜培養インサート上でin vitro (DIV)で3日間培養しました。 (A) 外植片は、レーザー走査型共焦点顕微鏡で1.42NAの60倍油浸対物レンズを使用して画像化されます。マージされた画像は、プロトカドヘリン15(Pcdh15)の発現と、Alexa 488と結合したファロイジンによってマークされたステレオ繊毛(緑色)を示しています。F-アクチン (B) およびPcdh15 (C) のシングルチャンネル画像を示す。スケールバーは10μmです。 (D) ファロイジンで染色されたステレオ繊毛と緑色のAlexa 488染色を結合させた超解像画像。画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡のAiryscanモードで1.42NAの63倍油浸対物レンズを使用して取得されました。スケールバーは5μmです。 ( E )SEM画像は、7kV電子高圧(EHT)電圧を用いて16340倍の倍率で撮影した。赤いアスタリスクはキノシリアを示し、赤いくさびはステレオ繊毛を示します。明るさとコントラストは自動に調整され、画像はFIJIを使用してシャープになりました。スケールバーは1μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ひよこは、実験室が内耳の研究に使用できるモデル生物への費用効果が高く便利な追加です。ここで説明されている方法は、私たちの研究室で日常的に使用されており、哺乳類の内耳で進行中の研究を補完します。ovoでは、エレクトロポレーションは、ニワトリゲノムに遺伝子操作を導入するために使用されます。エレクトロポレーションはまた、特定の細胞小器官または細胞内構造を標的とする蛍光タンパク質をコードする構築物を導入するためにも使用することができる35,36。これは簡単な手順ですが、卵子の胚の操作は生存率に影響を与えます。効率的なエレクトロポレーションのためには、卵は新鮮に調達する必要があります(産卵後すぐに)。死亡率の上昇および/または異常な発育は、5日以上保存された卵で頻繁に観察されます。滅菌技術の使用、卵が水分を失わないように卵が適切に密封されていることを確認し、胚に対して行われる操作を最小限に抑えることで、生存能力が向上します。
E3.5からE4の耳嚢胞を標的にすることで、胚が直面する外傷が軽減され、慎重に配置された電極を使用することで、BPの感覚前駆体を良好に標的化できることが分かった。しかしながら、この段階までに、聴音前庭神経節の前駆物質はすでに内耳から離れて移動している37,38。これらの細胞を標的とするには、耳嚢胞エレクトロポレーションのより早い時点を選択し、対応する生存率の低下に対応するための調整を行う必要があります。さらに注意すべき点は、エレクトロポレーションされた胚におけるモザイクの可能性である。すべての細胞がすべてのプラスミドを取り込むわけではないため、モザイク処理は解釈を混乱させる可能性があります。トレーサープラスミドの使用は、データの解釈に役立ち、モザイク効果の可能性をある程度制御できます。複数の繰り返し、慎重な分析、および統計的手法の使用は、モザイク表現型の評価に役立ちます。別のアプローチは、遺伝子組み換えウズラを使用することです39。現在、これらの数は限られており、多くのラボで常に利用できるとは限りません。しかし、入手可能性は高まり、細胞内標的蛍光タンパク質を構成的に発現するウズラ胚は、イメージング実験の魅力的な提案です。
この方法では、非相同末端結合(NHEJ)24を介してCRISPRを介したノックダウンのためにタンパク質とDNAをエレクトロポレーションします。相同性指向修復(HDR)によるCRISPR/Cas9を介した融合構築物の生成は、この特定のパラダイムでは依然として非効率的である(Singh et al., 未発表の観察)。エレクトロポレーション法は、RNAおよびタンパク質だけでなく、他のタイプのDNA構築物(これらは融合タンパク質をコードする構築物であり得る)での使用に適合させることができる。発生(および細胞分裂)の間、ベクターがこれらの細胞のゲノムへの外因性DNAの挿入を媒介する部位(例えば、Tol2またはPiggyBac)を組み込まない限り、DNAベースの発現構築物は希釈されることに留意すべきである。これにより、コンストラクトのより安定した発現が可能になる。
エレクトロポレーション後、胚は通常、有毛細胞の分化および発生研究のためにE10段階まで ovoで 培養されます。しかし、必要に応じて、 卵 が孵化するまで卵子培養を続けることができます。しかしながら、潜伏期間が長くなるにつれて、対応する生存率の低下がある。これを回避するために、 ovo エレクトロポレーションでは、BP解剖とそれに続く長期 のexovo 培養と組み合わせることができます。3Dマトリックス内で外植片を培養することで、組織形態を良好に保存できます。この方法は、組織のパターン形成、極性、および分化の変化を研究するために使用できます。膜上のBPの培養により、組織27の頂端側の可視化、特に立体繊毛の高解像度画像化が可能になる。
場合によっては、遺伝子組み換えの限界は、異なる低分子ベースの処理を使用することによって克服することができる。薬理学的に活性な化合物は、シグナル伝達経路または細胞生物学的プロセスのための阻害剤またはアゴニストとして作用する。それらのアプリケーションは、時間的要件を分析するのに特に役立ちます。ただし、細胞株で行われる標準化が組織で必要な投与量に匹敵しない場合があるため、正確な送達モードと最適な濃度は経験的に決定する必要があります。胚内での分娩は問題となる可能性があり、必要な量と他の臓器系への影響を組み合わせると、生存能力が大幅に損なわれる可能性があります。すぐに使える代替手段は、臓器培養法20,21,22です。ただし、正確な培養方法は、意図する研究と分析の種類によって異なります。コラーゲン培養はBPの組織形態を維持しますが、膜培養はHCの頂端毛束の研究に適しています。組織を膜の上に置くだけで、走査型電子顕微鏡または超解像顕微鏡を使用して頂端表面を視覚化できます。臓器培養のための解剖には、良い練習が必要です。これらには、無菌のワークスペースの維持と鋭利な器具の使用が含まれます。このようなマイクロダイセクションツールは敏感であり、顕微手術ツールの完全性を維持する上でシリコンディッシュの使用が重要であることがわかりました。
一緒に、技術は内耳の発達の理解を深めるための貴重なアプローチを表しています。ニワトリ胚が提供する比較生物学と再生の洞察は、有毛細胞の発達と機能に関する重要な洞察を提供することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、開示する競合する利益を持っていません。
Acknowledgments
NCBS、TIFR、Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant、DST-SERB、および王立国立ろう研究所からの支援に感謝します。バンガロールのヘサラガッタにある中央家禽開発機構および訓練研究所に感謝します。NCBSのCIFFおよびEM施設およびラボのサポートに感謝しています。Tol2-eGFPおよびT2TPコンストラクトを提供してくれた高橋佳子と川上浩一、HCAとG19 Pcdh15抗体についてGuy Richardsonに感謝します。プロトコルに関する絶え間ないサポートと貴重なフィードバックを提供してくれたEarlabメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
References
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
- Driver, E. C., Kelley, M. W.
- Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
- Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
- Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
- Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
- Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
- Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
- Edge, A. S., Chen, Z. Y.
- Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
- Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
- Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
- Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
- Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
- Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
- Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
- Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
- Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
- Funahashi, J., Nakamura, H.
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
- Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
- Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).
