Summary
Netzhautexplantate von Wildtyp-Makaken wurden in vitro kultiviert. Die Netzhautdegeneration und der cGMP-PKG-Signalweg wurden mit dem PDE6-Inhibitor Zaprinast induziert. Die cGMP-Akkumulation in den Explantaten bei unterschiedlichen Zapinast-Konzentrationen wurde mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen.
Abstract
Die erbliche Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet. Eine Überaktivierung des zyklischen Guanosinmonophosphat (cGMP)-abhängigen Proteinkinase-Signalwegs (PKG) in Photorezeptorzellen führt zum Tod von Photorezeptorzellen, insbesondere in Modellen mit Phosphodiesterase 6b (PDE6b)-Mutationen. Frühere Studien zu RD haben hauptsächlich Mausmodelle wie rd1 - oder rd10-Mäuse verwendet. Angesichts der genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen ist es wichtig zu verstehen, inwieweit die Netzhaut von Primaten und Nagetieren vergleichbar ist. Makaken haben eine hohe genetische Ähnlichkeit mit dem Menschen. Daher wurden Wildtyp-Makaken (im Alter von 1-3 Jahren) für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-Retinal-Pigmentepithel (RPE)-Aderhaut-Komplex enthielten. Diese Explantaten wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren und die RD-Pathogenese zu simulieren. Die cGMP-Akkumulation und der Zelltod in Netzhautexplantaten von Primaten wurden anschließend mit Hilfe von Immunfluoreszenz und dem TUNEL-Assay verifiziert. Das in dieser Studie etablierte Primaten-Netzhautmodell kann für relevante und effektive Studien zu den Mechanismen der cGMP-PKG-abhängigen RD sowie für die Entwicklung zukünftiger Behandlungsansätze dienen.
Introduction
Die hereditäre Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet und wird durch Mutationen in einer Vielzahl von pathogenen Genen verursacht1. Das Endergebnis von RD ist der Verlust des Sehvermögens, und in den allermeisten Fällen ist die Krankheit bis heute nicht behandelbar. Daher ist es wichtig, die zellulären Mechanismen, die zum Absterben von Photorezeptoren führen, mit Modellen zu untersuchen, die den menschlichen Krankheitszustand originalgetreu abbilden. Hier sind primatenbasierte Modelle aufgrund ihrer Nähe zum Menschen von besonderem Interesse. Insbesondere können solche Modelle die Entwicklung geeigneter therapeutischer Interventionen vorantreiben, die den Zelltod der Photorezeptoren stoppen oder verzögern können.
Frühere Forschungen zu den Mechanismen des Zelltods bei RD haben gezeigt, dass die Abnahme oder der Verlust der Phosphodiesterase 6 (PDE6)-Aktivität, die durch RD-auslösende Genmutationen verursacht wird, zu einer verminderten Hydrolyse von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP)2,3 führt. cGMP ist ein spezifischer Agonist der zyklischen Nukleotid-gesteuerten Ionenkanäle (CNGCs) in den äußeren Stäbchensegmenten (ROS) und ist auch ein Schlüsselmolekül, das für die Umwandlung von Lichtsignalen in elektrische Signale in Photorezeptorzellen von Wirbeltieren verantwortlich ist4. Eine reduzierte cGMP-Hydrolyse führt zu einer Akkumulation von cGMP in ROS, was zur Öffnung von CNGCs führt 5. Folglich werden die Phototransduktionswege aktiviert, was zu einem Anstieg der Kationenkonzentrationen in den Photorezeptorzellen führt. Dieser Prozess belastet die Photorezeptoren metabolisch, was bei Überaktivierung z.B. durch Mutationen in PDE6 zum Zelltod führen kann.
Viele Studien haben gezeigt, dass eine signifikante Überakkumulation von cGMP in Photorezeptoren von Mausmodellen mit verschiedenen RD-Genmutationen die Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase (PKG) verursachen kann3,6. Dies führt zu einer deutlichen Zunahme absterbender, TUNEL-positiver Zellen und zu einer allmählichen Ausdünnung der Photorezeptorzellschicht. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die durch erhöhte cGMP-Spiegel verursachte PKG-Überaktivierung eine notwendige und hinreichende Bedingung für die Induktion des Photorezeptorzelltods ist 2,5. Studien an verschiedenen Mausmodellen von RD haben auch gezeigt, dass die PKG-Aktivierung, die durch erhöhte cGMP-Spiegel in Photorezeptoren induziert wird, zu einer Überaktivierung von nachgeschalteten Effektoren wie Poly-ADP-Ribose-Polymerase 1 (PARP1), Histon-Deacetylase (HDAC) und Calpain 2,7,8,9 führt. Dies impliziert kausale Zusammenhänge zwischen diesen verschiedenen Zielproteinen und dem Tod von Photorezeptorzellen.
Bisherige Forschungen zur Pathologie, Toxikopharmakologie und Therapie von RD basierten jedoch hauptsächlich auf Mausmodellen für RD10,11,12. Dennoch gibt es nach wie vor immense Schwierigkeiten bei der klinischen Translation dieser Ergebnisse. Dies ist auf die erheblichen genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen zurückzuführen, insbesondere in Bezug auf die Netzhautstruktur. Im Gegensatz dazu weisen nicht-menschliche Primaten (NHPs) auch ein hohes Maß an Ähnlichkeit mit dem Menschen in Bezug auf genetische Merkmale, physiologische Muster und die Regulation von Umweltfaktoren auf. So wurde beispielsweise die optogenetische Therapie als Mittel zur Wiederherstellung der Netzhautaktivität in einem NHP-Modell untersucht13. Lingam und seine Kollegen zeigten, dass vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen, die aus retinalen Photorezeptor-Vorläuferzellen gewonnen werden, in der guten Herstellungspraxis eine Schädigung des Zapfen-Photorezeptors in NHP14 retten können. Daher sind NHP-Modelle wichtig für die Erforschung der RD-Pathogenese und die Entwicklung effektiver Behandlungsmethoden. Insbesondere NHP-Modelle von RD, die ähnliche pathogene Mechanismen wie beim Menschen aufweisen, könnten eine entscheidende Rolle bei Studien zur Entwicklung und In-vivo-toxikopharmakologischen Analyse neuer Medikamente spielen.
Angesichts des langen Lebenszyklus, der hohen technischen Schwierigkeiten und der hohen Kosten, die mit der Etablierung von In-vivo-Primatenmodellen verbunden sind, haben wir ein in vitro nicht-humanes Primatenmodell (NHP) unter Verwendung von Kulturen explantierter Makaken-Netzhaut etabliert. Zunächst wurden Wildtyp-Makaken im Alter von 1-3 Jahren für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-RPE-Aderhaut-Komplex enthielten. Explantate wurden dann mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast (100 μM, 200 μM und 400 μM) behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren. Der Zelltod der Photorezeptoren wurde mit dem TUNEL-Assay quantifiziert und analysiert, und die cGMP-Akkumulation in Explantaten wurde mittels Immunfluoreszenz verifiziert. Angesichts der hohen Ähnlichkeit in Bezug auf Zellverteilung und -morphologie, Netzhautschichtdicke und andere physiologische Eigenschaften der Netzhaut zwischen Affen und Menschen könnte die Etablierung des cGMP-PKG-Signalwegs im In-vitro-Netzhautmodell zukünftige Forschungen zur Pathogenese der RD sowie Studien zur Entwicklung und Toxikopharmakologie neuer Medikamente zur RD-Behandlung erleichtern.
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Protocol
Die Tierstudie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Zoologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (IACUC-PE-2022-06-002) und der Tierethikprüfung und dem Tierprotokoll der Universität Yunnan (YNU20220149) geprüft und genehmigt.
1. Herstellung von Netzhautexplantaten
- Die Augäpfel von Primaten werden von Wildtyp-Makaken im Alter von 1 bis 3 Jahren gewonnen, in einer Gewebeaufbewahrungslösung gelagert und innerhalb von 3 Stunden nach der Enukleation nach der Tötung der Affen oder nach dem natürlichen Tod auf Eis transportiert.
- Für die Herstellung der Proteinase-K-Lösung werden 25 mg Proteinase K in 250 μl destilliertem Wasser gelöst und dann 225 μl der Lösung zu 18,5 ml Basalmedium (R16) gegeben.
- Waschen Sie die Augäpfel 30 s lang in 10 ml 5%igem Povidon-Jod (Povidon-Jod: Wasser = 1:19) und tauchen Sie sie 1 Minute lang in 5%iges Penicillin/Streptomycin (PEN/STREPTOK):p Hosphat-gepufferte Kochsalzlösung = 1:19, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden. Inkubieren Sie dann die Augäpfel 5 Minuten lang in 10 ml R16-Medium.
- Die Proteinase-K-Lösung in einem 37 °C heißen Inkubator vorwärmen. Tauchen Sie dann die Augäpfel in 10 ml Proteinase-K-Lösung und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang. Tauchen Sie die Augäpfel in 10 ml R16 + fötales Kälberserum (1:1) Lösung, inkubieren Sie sie 5 Minuten lang und übertragen Sie dann die Augäpfel für eine letzte Wäsche in 10 ml frisches R16.
- Trennen Sie die Lederhaut, die Hornhaut, die Iris, die Linse und den Glaskörper ab und schneiden Sie die Netzhaut von 4 Seiten mit einer Pinzette und einer Schere ab (Abbildung 1A-L).
- Schneiden Sie Netzhautexplantaten mit Trepanklingen in fünf Abschnitte - eine 4-mm-Trepanklinge für die nasale/temporale/obere/untere Seite und eine 6-mm-Trepanklinge für die zentrale Seite (enthält Papille und Makula; Abbildung 1M-O). Schnitt in folgendem Abstand vom Sehnervenkopf: 1,5 mm für die Nasalseite, 4 mm für die Schläfenseite und 2 mm für die obere und untere Seite.
- Übertragen Sie die Netzhautexplantaten (die Netzhaut und Aderhaut enthalten) mit einem Augenlidspatel und legen Sie sie mit der Photorezeptorseite nach oben in die Mitte des Einsatzes (Abbildung 1P). Geben Sie ca. 1 ml des vollständigen Mediums (R16 ergänzt mit BSA, Transferrin, Progesteron, Insulin, T3, Corticosteron, Vitamin B1, Vitamin B12, Retinol, Retinylacetat, DL-Tocopherol, Tocopherylacetat, Linolsäure, L-Cystein HCl, Glutathion, Glutamin, Vitamin C) unter die Membran auf der Platte, um die Netzhaut vollständig zu bedecken.
2. Retinale Explantatkultur von Primaten
- Kultivieren Sie Netzhautexplanta in vollständigem Medium und stellen Sie sie in einen 37 °C heißen Inkubator, der mit befeuchteten 5 % CO2 belüftet ist.
- Wenden Sie die medikamentöse Behandlung in geeigneter Konzentration auf das Netzhautkulturmedium an (z. B. Zapinast in Konzentrationen von 100 μM, 200 μM oder 400 μM). Verwenden Sie mindestens drei Explantaten pro Behandlungsbedingung und verwenden Sie Explantate ohne Medikament als Kontrolle. Behandeln Sie mit dem Medikament für 4 Tage.
3. Fixierung und Kryo-Sektion
- Netzhautexplanta werden 45 min lang mit 1 ml Paraformaldehyd (PFA) inkubiert, kurz mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und dann 10 min lang mit 10 % Saccharose, 20 min mit 20 % Saccharose und 30 min mit 30 % Saccharose inkubiert (1 ml für jedes Netzhautexplantat).
- Schneiden Sie Netzhautexplantaten mit Trepanklingen, um die Konsistenz der Größe der Explantate zu gewährleisten, die an verschiedenen Stellen mit den folgenden Merkmalen gewonnen werden: vier Quadranten in der Peripherie, 6 mm in der Mitte. Anschließend werden die Netzhautexplantaten in eine Blechdose (ca. 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) mit O.C.T.-Einbettmedium überführt, um das Gewebe zu bedecken. Die Gewebeschnitte sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und zur Lagerung in einen -20 °C warmen Kühlschrank stellen.
- Schneiden Sie den Agar mit einer scharfen Klinge in einen kleinen Block mit der Gewebeprobe, schneiden Sie die Probenblöcke in 10-μm-Abschnitte und legen Sie sie mit einem weichen Pinsel auf Objektträger des Haftmikroskops. Anschließend 45 min bei 40 °C trocknen und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
4. Immunhistochemie (Abbildung 2)
- cGMP-Färbung
- Trocknen Sie die Objektträger und zeichnen Sie mit einem Flüssigkeitsblocker-Stift einen hydrophoben Ring um die Netzhautabschnitte, um die Proben zu bedecken.
- Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 200 μl 0,3 % Phosphatpuffer-Kochsalzlösung und Triton X-100 pro Objektträger (PBST) und dann 1 h lang bei Raumtemperatur in Blockierlösung (5 % normales Eselsserum, 0,3 % PBST, 1 % BSA, 200 μl pro Objektträger).
- Inkubieren Sie die Proben über Nacht mit dem Primärantikörper (1:250, Schaf-Anti-cGMP, 200 μL pro Objektträger), der in der Blockierungslösung bei 4 °C vorbereitet wurde, und spülen Sie sie dann 3x 10 min (200 μl pro Objektträger) mit PBS ab.
- Inkubieren Sie die Proben mit einem Sekundärantikörper (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 μL pro Objektträger) für 1 h bei Raumtemperatur und spülen Sie sie dann 3x 10 min lang mit PBS ab. Decken Sie die Proben mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium ab, das 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält, und lagern Sie sie vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang bei 4 °C.
- TUNEL-Färbung
- Trocknen Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und ziehen Sie mit dem Liquid Blocker Pen einen wasserabweisenden Barrierering um Netzhautgewebeproben und inkubieren Sie sie dann 15 Minuten lang in 40 ml PBS.
- Inkubation der Objektträger in 42 ml (pro fünf Objektträger) TBS (0,05 M Tris-Puffer) bei 37 °C. Aspirieren Sie das TBS und inkubieren Sie die Proben mit 6 μl Proteinase K für 5 Minuten. Waschen Sie dann die Objektträger 3x mit TBS für jeweils 5 Minuten.
- Setzen Sie die Objektträger 40 ml Ethanol-Essigsäure-Lösung im Collin aus, decken Sie sie mit einer transparenten Folie ab und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei -20 °C. Waschen Sie die Objektträger 3x mit TBS für jeweils 5 Minuten.
- Setzen Sie die Objektträger einer Blockierlösung (1 % BSA; 200-300 μl pro Objektträger, je nach Bedarf) aus und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang in einer Feuchtigkeitskammer.
- Bereiten Sie die TUNEL-Kit-Lösung, TMR rot, im folgenden Verhältnis vor: 62,50 μl Blockierlösung (1 % BSA), 56,25 μl Markierungslösung (TMR-dUTP) und 6,25 μl des Enzyms (Anteil für jeden Objektträger). Geben Sie ca. 130 μl dieser Lösung pro Objektträger hinzu und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C. Waschen Sie dann die Objektträger 5 Minuten lang (200 μl pro Objektträger) 2x mit PBS.
- Legen Sie Abdeckobjektträger mit 1-2 Tropfen Antifade-Einbettmedium mit DAPI über die Proben und inkubieren Sie die Objektträger vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang bei 4 °C.
- cGMP-Färbung kombiniert mit TUNEL-Färbung
- Auf die cGMP-Färbung folgte die TUNEL-Färbung. Befolgen Sie die Schritte der TUNEL-Färbung von Schritt 4.2.1 bis Schritt 4.2.5 und fahren Sie dann mit den Schritten der cGMP-Färbung von Schritt 4.1.2 bis Schritt 4.1.4 fort.
- Führen Sie die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie mit den folgenden Kameraparametern durch: Belichtungszeit = 125 ms, ROI-Größe = 2752 x 2208, Farbe = S/M. Nehmen Sie Bilder mit der Software auf. Nehmen Sie mit einer Digitalkamera vier verschiedene Felder mit 20-facher Vergrößerung aus jedem Schnitt auf und erhalten Sie repräsentative Bilder aus den zentralen Bereichen der Netzhaut mit DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), wobei Z-Stack-Scans ein Intervall = 1 μm und optional = 1,251 μm haben.
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Representative Results
In dieser Studie wurde die Netzhautexplantatkultur von Makakenaffen mit Explantaten durchgeführt, die den Retina-RPE-Aderhautkomplex enthielten (Abbildung 1, ergänzende Abbildung S1). Im Vergleich zur In-vitro-Kultur von Netzhautzellen unter Verwendung der Netzhaut ohne das angehängte RPE und die Aderhaut ermöglicht unsere Explantatkultur ein besseres Überleben der Zellen und verlängert dementsprechend das Überleben der Photorezeptorzellen.
Wir verwendeten unterschiedliche Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast (100 μM, 200 μM und 400 μM; Ergänzende Abbildung S2) eine Akkumulation von cGMP in Photorezeptoren und anschließende Aktivierung von PKG in vitro zu induzieren. Jede Konzentrationsbehandlung wurde jeweils 4 Tage lang durchgeführt. Die Behandlung des in vitro Netzhautmodells mit 400 μM Zapinast zeigte die größte Anzahl TUNEL-positiver Zellen, ein signifikantes cGMP-Signal und eine geringe Toxizität für das RPE und die neuronalen Zellen in der inneren Netzhaut. Der hohe Anteil an TUNEL-positiven Zellen in Abbildung 2 deutet darauf hin, dass eine Erhöhung der cGMP-Aktivität die Zaprinast-induzierte Retinalzelldegeneration verstärken kann, und die cGMP-Akkumulation spielt eine Rolle bei der Photorezeptordegeneration. Das in dieser Studie etablierte Modell der Netzhautdegeneration von Makaken wird dazu dienen, die Mechanismen der cGMP-PKG-abhängigen RP umfassend zu untersuchen.
Abbildung 1: Herstellungsprozess der Kultivierung von Netzhautexplantaten bei 1-jährigen Makaken. (A-L) Trennen Sie die Sklera, die Hornhaut, die Iris, die Linse und den Glaskörper ab und schneiden Sie die Netzhaut von vier Seiten mit einer Pinzette und einer Schere ab. (M-O) Schneiden Sie die Netzhautexplantaten mit Trepanklingen in fünf Abschnitte - eine 4-mm-Trepanklinge für die nasale/temporale/obere/untere Seite und eine 6-mm-Trepanklinge für die zentrale Seite (mit Papille und Makula). (P) Übertragen Sie die Netzhautexplanate (einschließlich Netzhaut und Aderhaut) mit Schmetterlingen auf die Membran und legen Sie die Membran auf eine 6-Well-Kulturplatte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Evaluierung der cGMP-Aktivitäten innerhalb der ONL von Netzhautexplantaten eines 1-jährigen Affen. Explantate wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast (100 μM, 200 μM und 400 μM) behandelt. Die Anzahl der TUNEL- (rot) und cGMP-positiven (grün) Zellen in den drei verschiedenen Konzentrationen war in ONL im Vergleich zur Kontrollgruppe (A-D) stark erhöht. Im Vergleich zur Kontrollgruppe weisen die TUNEL/cGMP-positiven Zellen signifikante Unterschiede in den Gruppen 100 μM, 200 μM und 400 μM auf. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Ein Bereich der Netzhaut, der mit 400 μM Zapinast behandelt wurde, wurde vergrößert, um nur cGMP (grün) und TUNEL (rot) positive Zellen sowie ein verschmolzenes Bild zu sehen. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar. * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; = p ≤ 0,001; = p ≤ 0,0001. Abkürzungen: GCs = Ganglienzellen, INL = innere Kernschicht, ONL = äußere Kernschicht, RPE = retinales Pigmentepithel, cGMP = cyclisches Guanosinmonophosphat, PDE6 = Phosphodiesterase 6. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung S1: Lage der Netzhautstanzen, die für Explantatkulturen verwendet werden. Explantate aus nasalen Stempeln befanden sich 1,5 mm vom Sehnervenkopf entfernt, während dieser Abstand 4 mm für temporale und 2 mm für superiore bzw. inferiore Stempel betrug. Netzhautexplantaten wurden durch Schneiden mit Trepanklingen an fünf Stellen erhalten - eine 4 mm Trepanklinge für die nasale/temporale/superiore/inferiore Seite und eine 6 mm Trepanklinge für die zentrale Seite (enthält Papille und Makula). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: TUNEL-Färbung für sterbende Zellen. Kontrollieren Sie die mit Zaprinast behandelte Netzhaut (A) und Netzhaut in Konzentrationen von 100 μM, 200 μM oder 400 μM (B-D). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Visuelle Phototransduktion bezieht sich auf den biologischen Prozess, bei dem Lichtsignale von Photorezeptorzellen in der Netzhaut des Auges in elektrische Signale umgewandelt werden. Photorezeptorzellen sind polarisierte Neuronen, die zur Phototransduktion fähig sind, und es gibt zwei verschiedene Arten von Photorezeptoren, die nach der Form ihrer äußeren Segmente als Stäbchen und Zapfen bezeichnet werden. Stäbchen sind für das skotopische Sehen verantwortlich und Zapfen sind für das photopische und hochscharfe Sehen verantwortlich. Hereditäre RD bezieht sich auf neurodegenerative Erkrankungen, die durch einen fortschreitenden retinalen Photorezeptorzelltod gekennzeichnet sind15.
Die aktuelle Forschung zu RD basiert hauptsächlich auf Mausmodellen für RD, einschließlich in vitro retinaler Explantatkulturen, die aus murinen RD-Modellen abgeleitet wurden16. Allerdings gibt es erhebliche genetische und physiologische Unterschiede, vor allem in der Netzhautstruktur, zwischen Mäusen und Menschen. Im Gegensatz dazu weisen NHPs ein hohes Maß an Ähnlichkeit mit dem Menschen auf, so dass NHP-Modelle für die Untersuchung der RD-Pathogenese und Therapieentwicklung am besten geeignet sind.
In dieser Studie haben wir ein in vitro NHP-Modell etabliert, indem wir Netzhautexplanate von Makaken kultiviert haben. Im Vergleich zu einer routinemäßigen Einzelzell-Primärkultur und einer In-vitro-Kultur von immortalisierten Zelllinien kann eine in vitro retinale Explantatkultur die retinale Gewebekonformation und interzelluläre Interaktionen erhalten, was eine bessere Simulation der In-vivo-Bedingungen ermöglicht. Darüber hinaus reduziert es die Anzahl der verwendeten Tiere erheblich, verkürzt die Versuchsdauer und bietet einen relativ kontrollierbaren experimentellen Ansatz zur Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Faktoren, die an der Entwicklung oder Degeneration der Netzhaut beteiligt sind.
Die erfolgreiche Herstellung von Netzhautexplantaten ist entscheidend für die erfolgreiche Etablierung von in vitro Netzhautmodellen. Basierend auf unseren bisherigen Forschungserfahrungen bei der Herstellung von Netzhautexplantaten für Mäuse fassen wir hier einige wichtige Punkte für die Herstellung von Netzhautexplantaten von Affen zusammen:
1) Die Explantatvorbereitung muss so bald wie möglich nach der Tierschlachtung und Enukleation durchgeführt werden. Die Verwendung einer Gewebeaufbewahrungslösung für die Lagerung des Augapfels vor der Verwendung in der Explantatpräparation wird empfohlen, da sie im Vergleich zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung eine bessere Aufrechterhaltung der Zellviabilität ermöglicht.
2) In Anbetracht der Größe der Affenaugäpfel und der langen Zeiträume der Exposition gegenüber äußeren Umwelteinflüssen kann das Waschen der Augäpfel mit verdünntem Povidon-Iodophor und einer dualen Antibiotikalösung vor der Herstellung der Netzhautexplantation die Kontamination reduzieren. Das Waschen sollte jedoch nicht übermäßig lange durchgeführt werden. Die Zugabe von Antibiotika während der Explantatkultur wird nicht empfohlen, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen kann.
3) Enukleierte Augäpfel wurden einer sequentiellen Trennung von Sklera, Hornhaut, Iris, Linse und Glaskörper unterzogen, gefolgt von der Schneidung der Netzhaut. Im Gegensatz zu den Augäpfeln der Maus, die klein sind und bei denen Sklera und Uvea eng aneinander befestigt sind, sind die Augäpfel von Affen relativ groß und besitzen eine harte Sklera und einen suprachoroidalen Raum. Daher ist für die Trennung der Lederhaut eine Schere erforderlich. Obwohl dies kein schwieriger Schritt im Umgang mit enukleierten Affenaugäpfeln ist, muss darauf geachtet werden, dass die Netzhaut und die Uvea nicht beschädigt werden. Außerdem muss das zähe Zentralband der Affenlinse vor der vorsichtigen Entfernung der Linse mit einer Schere durchtrennt werden. Die Trennung des Glaskörpers ist aufgrund der großen Glaskörperkammer des Affenauges, der hohen Viskosität des Glaskörpers und der festen Bindung des Glaskörpers an die Netzhaut bei Affen im Alter von 1-3 Jahren einer der zeitaufwändigsten Schritte des Explantatherstellungsprozesses. Der Glaskörper wurde weitestgehend mit einer Schere entfernt und eine Pipette verwendet, um den anschließenden Transfer und die Kultivierung der Netzhautexplanate zu erleichtern. Wir sind gerade dabei, schnellere und effektivere Methoden zur Glaskörperentfernung zu erforschen. Die Netzhautexplantaten (5 mm) wurden mit Trepanklingen geschnitten, um eine Konsistenz in der Größe der Explantate zu gewährleisten, die von verschiedenen Standorten gewonnen wurden (Standortmerkmale: vier Quadranten in der Peripherie, 6 mm in der Mitte). Bei der Übertragung von Explantaten in Kultureinsätze kann es zu einer Trennung von Netzhaut und Aderhaut kommen. Daher ist eine schonende und flinke Handhabung erforderlich, um sicherzustellen, dass die Explantate bereits beim ersten Versuch übertragen werden, da wiederholte Versuche zu Netzhautschäden führen können. Schließlich sollten mechanische Schäden während des gesamten Vorbereitungsprozesses der Netzhautexplantierung so weit wie möglich minimiert werden, um eine Schädigung der Netzhautstruktur zu vermeiden. Auch die Zeit für die Explantatvorbereitung sollte minimiert werden, um einen unbeabsichtigten Zelltod zu vermeiden.
4) Die retinale Explantatkultur wurde mit Explantaten durchgeführt, die den Retina-RPE-Aderhautkomplex enthielten. Im Vergleich zur In-vitro-Kultur von Netzhautzellen unter Verwendung der Netzhaut ohne das angehängte RPE und die Aderhaut ermöglicht unsere Explantatkultur ein besseres Überleben der Zellen und verlängert dementsprechend das Überleben der Photorezeptorzellen. Während des Kulturprozesses zeigt die Netzhaut nach oben und die Aderhaut nach unten. Im Vergleich zu Maus-Netzhautexplantaten sind Affen-Netzhaut-Explantaten größer, was höhere Anforderungen an die Kulturernährung stellt. Daher führten wir tägliche Nährbodenwechsel für die Affen-Netzhaut-Explantat-Kultur durch, anstatt eine Nährmedium-Wechselfrequenz von einmal alle 2 Tage anzunehmen, die zuvor für die Maus-Netzhaut-Explantat-Kultur verwendet wurde.
Zusammenfassend haben wir ein in vitro NHP-Modell durch die Kultivierung der Netzhautexplantaten von Makaken und deren Behandlung mit Zapinast etabliert, um den cGMP-PKG-Signalweg ähnlich dem in der RD-Pathogenese beobachteten zu induzieren. Zaprinast ist ein PDE6-Inhibitor und PDE6 hält das Gleichgewicht der intrazellulären Konzentration von cGMP aufrecht, das PKG17,18 aktiviert. Der cGMP-PKG-Signalweg kann die oxidative Phosphorylierung und die mitochondrialen Signalwege negativ regulieren und dadurch die Netzhautdegeneration beeinflussen19. Die Induktion des cGMP-PKG-Signalwegs in diesem in vitro NHP-Netzhautmodell etabliert es als günstiges Modell für die zukünftige Erforschung der Pathogenese der RD sowie für die Entwicklung und toxikopharmakologische Testung neuer Medikamente zur RD-Behandlung. Dennoch hat die Verwendung dieses Modells einige Einschränkungen, insbesondere die relativ kurzen Kultivierungszeiten und die relativ hohen Kosten für Primaten. In unserer zukünftigen Forschung wird dieses In-vitro-Modell für die postinterventionelle funktionelle Bewertung der Netzhaut mittels MEA und μERG verwendet. Informationen und zelluläre Lokalisationen von PKG-Targets werden mit der Messung von Aktivitäten nachgeschalteter Effektoren (z.B. Calpain, PARP und HDAC) und Untersuchungen der relevanten neurodegenerativen Mechanismen kombiniert.
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Disclosures
Alle Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81960180), der Zinke Heritage Foundation und der Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01) unterstützt. Wir danken Prof. Longbao Lv (Institut für Zoologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Kunming, China) für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Affenaugäpfel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
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| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
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References
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