Summary
Retinala explantat erhållna från makaker av vildtyp odlades in vitro. Retinal degeneration och cGMP-PKG-signalvägen inducerades med användning av PDE6-hämmaren zaprinast. cGMP-ackumulering i explanterna vid olika zaprinastkoncentrationer verifierades med hjälp av immunofluorescens.
Abstract
Ärftlig retinal degeneration (RD) kännetecknas av progressiv fotoreceptorcelldöd. Överaktivering av den cykliska guanosinmonofosfat (cGMP)-beroende proteinkinasvägen (PKG) i fotoreceptorceller orsakar fotoreceptorcelldöd, särskilt i modeller som innehåller fosfodiesteras 6b (PDE6b) mutationer. Tidigare studier på RD har huvudsakligen använt murina modeller som rd1 eller rd10 möss. Med tanke på de genetiska och fysiologiska skillnaderna mellan möss och människor är det viktigt att förstå i vilken utsträckning näthinnan hos primater och gnagare är jämförbara. Makaker delar en hög grad av genetisk likhet med människor. Därför valdes makaker av vildtyp (i åldern 1-3 år) för in vitro-odling av retinala explantat som inkluderade retina-retinal pigmentepitel (RPE)-choroidkomplex. Dessa explantat behandlades med olika koncentrationer av PDE6-hämmaren zaprinast för att inducera cGMP-PKG-signalvägen och simulera RD-patogenes. cGMP-ackumulering och celldöd i primatretinala explantat verifierades därefter med hjälp av immunofluorescens och TUNEL-analysen. Den primatnäthinnemodell som etablerats i denna studie kan tjäna för relevanta och effektiva studier av mekanismerna för cGMP-PKG-beroende RD, liksom för utveckling av framtida behandlingsmetoder.
Introduction
Ärftlig retinal degeneration (RD) kännetecknas av progressiv fotoreceptorcelldöd och orsakas av mutationer i en mängd olika patogena gener1. Slutresultatet av RD är synförlust och i de allra flesta fall är sjukdomen fortfarande obehandlingsbar till denna dag. Därför är det viktigt att studera de cellulära mekanismerna som leder till fotoreceptordöd med hjälp av modeller som troget representerar det mänskliga sjukdomstillståndet. Här är primatbaserade modeller av särskilt intresse på grund av deras närhet till människor. I synnerhet kan sådana modeller främja utvecklingen av lämpliga terapeutiska ingrepp som kan stoppa eller fördröja fotoreceptorcelldöd.
Tidigare forskning om mekanismerna för celldöd vid RD har visat att minskningen eller förlusten av fosfodiesteras 6 (PDE6) aktivitet orsakad av RD-utlösande genmutationer leder till minskad hydrolys av cykliskt guanosinmonofosfat (cGMP)2,3. cGMP är en specifik agonist för de cykliska nukleotidstyrda jonkanalerna (CNGCs) i stavens yttre segment (ROS) och är också en nyckelmolekyl som ansvarar för omvandlingen av ljussignaler till elektriska signaler i ryggradsdjurens fotoreceptorceller4. Minskad cGMP-hydrolys orsakar ackumulering av cGMP i ROS, vilket leder till öppnandet av CNGC 5. Följaktligen aktiveras fototransduktionsvägarna, vilket resulterar i en ökning av katjonkoncentrationerna i fotoreceptorceller. Denna process medför en metabolisk belastning på fotoreceptorer, som när de överaktiveras, till exempel av mutationer i PDE6, kan orsaka celldöd.
Många studier har visat att en signifikant överackumulering av cGMP i fotoreceptorer hos musmodeller med olika RD-genmutationer kan orsaka aktivering av cGMP-beroende proteinkinas (PKG)3,6. Detta leder till en betydande ökning av döende, TUNEL-positiva celler och en gradvis uttunning av fotoreceptorcellskiktet. Tidigare studier tyder på att PKG-överaktivering orsakad av förhöjda cGMP-nivåer är ett nödvändigt och tillräckligt villkor för induktion av fotoreceptorcelldöd 2,5. Studier på olika musmodeller av RD har också visat att PKG-aktivering inducerad av förhöjda cGMP-nivåer i fotoreceptorer leder till överaktivering av nedströms effektorer såsom poly-ADP-ribospolymeras 1 (PARP1), histondeacetylas (HDAC) och calpain 2,7,8,9. Detta innebär orsakssamband mellan dessa olika målproteiner och fotoreceptorcelldöd.
Tidigare forskning om patologi, toxikofarmakologi och terapi av RD baserades dock huvudsakligen på musmodeller för RD10,11,12. Icke desto mindre kvarstår enorma svårigheter i den kliniska översättningen av dessa resultat. Detta beror på de stora genetiska och fysiologiska skillnaderna mellan möss och människor, särskilt med avseende på näthinnans struktur. Däremot delar icke-mänskliga primater (NHP) också en hög grad av likhet med människor med avseende på genetiska egenskaper, fysiologiska mönster och miljöfaktorreglering. Till exempel undersöktes optogenetisk terapi som ett sätt att återställa retinal aktivitet i en NHP-modell13. Lingam och kollegor visade att god tillverkningspraxis-grade human-inducerad pluripotent stamcells-härledd retinal fotoreceptorprekursorceller kan rädda konfotoreceptorskador i NHP14. Därför är NHP-modeller viktiga för utforskningen av RD-patogenes och utvecklingen av effektiva behandlingsmetoder. I synnerhet kan NHP-modeller av RD, som uppvisar patogena mekanismer som liknar dem hos människor, spela en avgörande roll i studier om utveckling och in vivo toxikofarmakologisk analys av nya läkemedel.
Med tanke på den långa livscykeln, höga tekniska svårigheter och höga kostnader för att etablera primatmodeller in vivo etablerade vi en in vitro icke-mänsklig primatmodell (NHP) med hjälp av kulturer av explanterad makaknäthinna. Först valdes makaker av vildtyp i åldern 1-3 år ut för in vitro-odling av retinala explantat, vilket inkluderade retina-RPE-choroidkomplexet. Explantater behandlades sedan med olika koncentrationer av PDE6-hämmaren zaprinast (100 μM, 200 μM och 400 μM) för att inducera cGMP-PKG-signalvägen. Fotoreceptorcelldöd kvantifierades och analyserades med hjälp av TUNEL-analysen, och cGMP-ackumulering i explantat verifierades via immunofluorescens. Med tanke på den höga graden av likhet med avseende på celldistribution och morfologi, näthinnans skikttjocklek och andra fysiologiska egenskaper hos näthinnan mellan apor och människor, kan etableringen av cGMP-PKG-signalvägen i in vitro-retinalmodellen underlätta framtida forskning om patogenesen av RD samt studier av utveckling och toxikofarmakologi av nya läkemedel för RD-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstudien granskades och godkändes av etikprövningskommittén vid Zoologiska institutet, Chinese Academy of Sciences (IACUC-PE-2022-06-002) och djuretisk granskning och djurprotokoll vid Yunnan University (YNU20220149).
1. Beredning av retinala explantat
- Få primatögonbollar från makaker av vildtyp, i åldern 1 till 3 år, förvara i vävnadsförvaringslösning och transportera på is inom 3 timmar efter enukleation efter att aporna offrades eller efter naturlig död.
- För beredning av proteinas K-lösning löses 25 mg proteinas K i 250 μL destillerat vatten och tillsätt sedan 225 μL av lösningen till 18,5 ml basmedium (R16).
- Tvätta ögongloberna i 10 ml 5% povidonjod (povidonjod: vatten = 1:19) i 30 s och doppa dem i 5% penicillin / streptomycin (PEN / STREP) :p hosfatbuffrad saltlösning = 1:19 i 1 min för att undvika bakteriell kontaminering. Inkubera sedan ögongloberna i 10 ml R16-medium i 5 minuter.
- Förvärm proteinas K-lösningen i en 37 °C inkubator. Sänk sedan ner ögongloberna i 10 ml proteinas K-lösning och inkubera i 2 minuter. Sänk ner ögongloberna i 10 ml R16 + fetalt bovint serum (1: 1) lösning, inkubera i 5 minuter och överför sedan ögonbollarna till 10 ml färsk R16 för en slutlig tvätt.
- Separera sclera, hornhinnan, iris, lins och glaskroppen och skär näthinnan från 4 sidor med pincett och sax (figur 1A-L).
- Skär retinala explantat med trefinblad i fem sektioner - ett 4 mm trefinblad för den nasala / temporala / överlägsna / underlägsna sidan och ett 6 mm trefinblad för den centrala sidan (innehållande optisk skiva och makula; Figur 1M-O). Skär på följande avstånd från synnervhuvudet: 1,5 mm för nasal, 4 mm för temporal och 2 mm för både överlägsen och underlägsen sida.
- Överför näthinnan explantat (innehållande näthinnan och choroid) med ögonlocksdämparen och placera dem i mitten av insatsen, fotoreceptorsidan uppåt (figur 1P). Placera cirka 1 ml komplett medium (R16 kompletterat med BSA, transferrin, progesteron, insulin, T3, kortikosteron, vitamin B1, vitamin B12, retinol, retinylacetat, DL-tokoferol, tokoferylacetat, linolsyra, L-cystein HCl, glutation, glutamin, vitamin C) under membranet på plattan för att helt täcka näthinnan.
2. Primat retinal explantkultur
- Odlingsnäthinnan explanteras i komplett medium och placeras i en 37 °C inkubator luftad med fuktad 5%CO2.
- Applicera läkemedelsbehandling i lämplig koncentration på retinalodlingsmediet (t.ex. zaprinast vid koncentrationer på 100 μM, 200 μM eller 400 μM). Använd minst tre explantat per behandlingstillstånd och använd explantat utan läkemedel som kontroll. Behandla med läkemedel i 4 dagar.
3. Fixering och kryosnittning
- Inkubera retinala explantat med 1 ml paraformaldehyd (PFA) i 45 minuter, skölj dem kort med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera sedan med 10% sackaros i 10 min, 20% sackaros i 20 minuter och 30% sackaros i 30 minuter (1 ml för varje näthinneplantning).
- Skär retinala explantat med trefinblad för att säkerställa konsistens i storleken på explanterna erhållna från olika platser med följande egenskaper: fyra kvadranter i periferin, 6 mm i mitten. Överför sedan näthinnans explantat till en tinbox (ca 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) med OCT-inbäddningsmedium för att täcka vävnaden. Frys omedelbart vävnadssektionerna i flytande kväve och placera dem i ett kylskåp på -20 °C för förvaring.
- Använd ett vasst blad för att trimma agar i ett litet block som innehåller vävnadsprovet, skär provblocken i 10 μm sektioner och placera dem på vidhäftningsmikroskopglas med en mjuk borste. Torka sedan i 45 minuter vid 40 °C och förvara vid -20 °C tills användning.
4. Immunhistokemi (figur 2)
- cGMP-färgning
- Torka objektglasen och dra en hydrofob ring runt näthinnans sektioner med en flytande blockerarpenna för att täcka proverna.
- Sänk ner objektglasen i 200 μL 0,3 % fosfatbuffertsaltlösning och Triton X-100 per glas (PBST) i 10 minuter vid rumstemperatur och sedan i blockerande lösning (5 % normalt åsneserum, 0,3 % PBST, 1 % BSA, 200 μl per objektglas) i 1 timme vid rumstemperatur.
- Inkubera proverna över natten med den primära antikroppen (1:250, får anti-cGMP, 200 μL per objektglas) beredd i blockeringslösningen vid 4 °C och skölj sedan med PBS i 10 min (200 μL per objektglas) 3x.
- Inkubera proverna med sekundär antikropp (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 μL per objektglas) i 1 h vid rumstemperatur och skölj sedan med PBS i 10 min, 3x. Täck proverna med ett antifade monteringsmedium innehållande 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och förvara vid 4 °C i minst 30 minuter före avbildning.
- TUNEL färgning
- Torka objektglasen vid rumstemperatur i 15 minuter och dra en vattenavvisande barriärring runt näthinnans vävnadsprover med vätskeblockerarpennan och inkubera dem sedan i 40 ml PBS i 15 minuter.
- Inkubera objektglas i 42 ml (per fem objektglas) TBS (0,05 M Tris-buffert) vid 37 °C. Sug upp TBS och inkubera proverna med 6 μl proteinas K i 5 minuter. Tvätta sedan bilderna 3x med TBS i 5 minuter varje gång.
- Exponera objektglasen för 40 ml etanolättiksyralösning i hacklinen, täck med ett genomskinligt ark och inkubera vid -20 °C i 5 minuter. Tvätta bilderna 3x med TBS i 5 minuter varje gång.
- Utsätt objektglasen för blockeringslösning (1 % BSA; 200–300 μl per objektglas enligt behov) och inkubera i en fuktkammare i 1 timme.
- Bered TUNEL kitlösning, TMR röd, i följande proportion: 62,50 μL blockeringslösning (1% BSA), 56,25 μL märkningslösning (TMR-dUTP) och 6,25 μL av enzymet (andel för varje objektglas). Tillsätt ca 130 μl av denna lösning per objektglas och inkubera vid 37 °C i 1 timme. Tvätta sedan bilderna med PBS i 5 minuter (200 μL per bild), 2x.
- Placera täckglas som innehåller 1–2 droppar antifade monteringsmedium med DAPI över proverna och inkubera sedan objektglasen vid 4 °C i minst 30 minuter före avbildning.
- cGMP-färgning kombinerad med TUNEL-färgning
- cGMP-färgning följdes av TUNEL-färgning. Följ stegen för TUNEL-färgning från steg 4.2.1 till steg 4.2.5 och fortsätt sedan stegen för cGMP-färgning från steg 4.1.2 till steg 4.1.4.
- Utför ljus- och fluorescensmikroskopi med kameraparametrar enligt följande: exponeringstid = 125 ms, ROI-storlek = 2752 x 2208, Färg = B / M. Ta bilder med programvaran. Föreställ dig fyra olika fält med en digitalkamera med 20x förstoring från varje sektion och få representativa bilder från de centrala delarna av näthinnan med DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), med Z-Stack-skanning som har ett intervall = 1 μm och valfritt = 1,251 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie utfördes Macaque monkey retinal explantkultur med användning av explantat innehållande näthinnan-RPE-choroidkomplexet (figur 1, kompletterande figur S1). Jämfört med in vitro-kulturen av retinala celler som använder näthinnan utan bifogad RPE och choroid, underlättar vår explantkultur bättre cellöverlevnad och förlänger följaktligen överlevnaden av fotoreceptorceller.
Vi använde olika koncentrationer av PDE6-hämmaren zaprinast (100 μM, 200 μM och 400 μM; Kompletterande figur S2) för att inducera en ackumulering av cGMP i fotoreceptorer och efterföljande aktivering av PKG in vitro. Varje koncentrationsbehandling gavs i 4 dagar. Behandlingen av in vitro-näthinnemodellen med 400 μM zaprinast uppvisade det största antalet TUNEL-positiva celler, en signifikant cGMP-signal och låg toxicitet för RPE och neuronala celler i den inre näthinnan. Den höga andelen TUNEL-positiva celler i figur 2 föreslog att ökad cGMP-aktivitet kan förbättra zaprinast-inducerad retinal celldegeneration och cGMP-ackumulering spelar en roll i fotoreceptordegeneration. Macaque retinal degenerationsmodell etablerad i denna studie kommer att tjäna för omfattande undersökningar av mekanismerna för cGMP-PKG-beroende RP.
Figur 1: Produktionsprocess av retinal explantodling i 1-åriga makaker. (A-L) Separera ut sclera, hornhinnan, iris, lins och glaskroppen och skär näthinnan från fyra sidor med pincett och sax. (M-O) Skär näthinnans explantat med trefinblad i fem sektioner - ett 4 mm trefinblad för den nasala/temporala/överlägsna/underlägsna sidan och ett 6 mm trefinblad för den centrala sidan (innehållande optisk skiva och makula). (P) Överför näthinnans explantat (innehållande näthinna och åderhinnan) fjäril öppen mot membranet och placera membranet på en 6-brunns odlingsplatta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Utvärdering av cGMP-aktiviteter inom ONL av retinala explantat av 1-årig apa. Explantaterna behandlades med olika koncentrationer av PDE6-hämmaren zaprinast (100 μM, 200 μM och 400 μM). Antalet TUNEL (röda) och cGMP (gröna) positiva celler i de tre olika koncentrationerna ökade kraftigt i ONL jämfört med kontroll (A-D). Jämfört med kontrollgruppen har de TUNEL / cGMP-positiva cellerna signifikanta skillnader i grupperna 100 μM, 200 μM och 400 μM. Kärnor färgades med DAPI (blå). Ett område av näthinnan som behandlades med 400 μM zaprinast förstorades för att observera cGMP (grön) och TUNEL (röd) positiva celler ensamma, liksom en sammanslagen bild. Felstaplar representerar standardavvikelse (SD); * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; = p ≤ 0,001; = p ≤ 0,0001. Förkortningar: GCs = ganglieceller, INL = inre kärnskikt, ONL = yttre kärnskikt, RPE = retinalt pigmentepitel, cGMP = cykliskt guanosinmonofosfat, PDE6 = fosfodiesteras 6. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Placering av näthinnestansar som används för explantkulturer. Explantat härrörande från nässtansar var belägna 1,5 mm från synnervhuvudet, medan detta avstånd var 4 mm för temporala respektive 2 mm för överlägsna respektive sämre stansar. Retinala explantat erhölls genom skärning med trefinblad på fem platser - ett 4 mm trefinblad för den nasala / temporala / överlägsna / underlägsna sidan och ett 6 mm trefinblad för den centrala sidan (innehållande optisk skiva och makula). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: TUNEL-färgning för döende celler. Kontrollera näthinnan (A) och näthinnor som behandlats med Zaprinast vid koncentrationer på 100 μM, 200 μM eller 400 μM (B-D). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Visuell fototransduktion hänvisar till den biologiska processen genom vilken ljussignaler omvandlas till elektriska signaler av fotoreceptorceller i ögats näthinna. Fotoreceptorceller är polariserade neuroner som kan fototransduktion, och det finns två olika typer av fotoreceptorer som kallas stavar och kottar efter formerna på deras yttre segment. Stavar är ansvariga för den skotopiska synen och kottar är ansvariga för fotopisk och hög synskärpa. Ärftlig RD avser neurodegenerativa sjukdomar som kännetecknas av progressiv retinal fotoreceptorcelldöd15.
Nuvarande forskning om RD har huvudsakligen baserats på musmodeller av RD, inklusive in vitro retinala explantkulturer härledda från murina RD-modeller16. Det finns emellertid betydande genetiska och fysiologiska skillnader, särskilt i näthinnans struktur, mellan möss och människor. Däremot delar NHP en hög grad av likhet med människor, vilket gör NHP-modeller mest lämpliga för undersökning av RD-patogenes och terapiutveckling.
I denna studie etablerade vi en in vitro NHP-modell genom att odla retinala explantat av makaker. Jämfört med rutinmässig encellsprimärkultur och en in vitro-kultur av odödliga cellinjer kan en in vitro retinal explantkultur bevara retinal vävnadskonformation och intercellulära interaktioner, vilket möjliggör bättre simulering av in vivo-förhållanden. Dessutom minskar det i stor utsträckning antalet djur som används och förkortar försökstiden och ger ett relativt kontrollerbart experimentellt tillvägagångssätt för att undersöka effekterna av olika faktorer som är involverade i retinal utveckling eller degeneration.
Framgångsrik beredning av retinala explantat är avgörande för framgångsrik etablering av in vitro retinala modeller. Baserat på vår tidigare forskningserfarenhet av att förbereda retinala explantat för möss sammanfattar vi här flera viktiga punkter för apa retinal explantberedning:
1) Explantberedning måste utföras så snart som möjligt efter djuroffer och enukleation. Användning av en vävnadsförvaringslösning för ögonglobslagring före användning i explantberedning rekommenderas eftersom det möjliggör bättre underhåll av cellviabilitet jämfört med fosfatbuffrad saltlösning.
2) Med tanke på den stora storleken på apa ögonbollar och de långa perioderna av yttre miljöexponering, tvätta ögonbollarna med utspädd povidonjodofor och en dubbel antibiotikalösning före retinal explantberedning kan minska föroreningar. Tvättning bör dock inte utföras under alltför lång tid. Tillsats av antibiotika under explantodling rekommenderas inte eftersom det kan påverka cellviabiliteten.
3) Enukleerade ögonbollar utsattes för en sekventiell separation av sclera, hornhinnan, iris, lins och glaskroppen följt av skivning av näthinnan. Till skillnad från musögonbollar, som är små och där sclera och uvea är tätt fästa vid varandra, är apögonbollar relativt stora och har ett tufft sclera och suprachoroidalt utrymme. Därför krävs sax för separation av sclera. Även om detta inte är ett svårt steg i hanteringen av enukleerade apögonbollar, måste försiktighet iakttas för att undvika att skada näthinnan och uvea. Dessutom måste det tuffa suspensiva ligamentet i aplinsen klippas med sax innan linsen försiktigt tas bort. Separation av glaskroppen är ett av de mest tidskrävande stegen i explantberedningsprocessen på grund av den stora glaskroppen i apögat, glaskroppens höga viskositet och glaskroppens fasta fastsättning med näthinnan hos apor i åldern 1-3 år. Glaskroppen avlägsnades i största möjliga utsträckning med sax och en pipett användes för att underlätta den efterföljande överföringen och odlingen av näthinnans explantat. Vi är för närvarande i färd med att utforska snabbare och effektivare metoder för glaskroppsborttagning. Retinala explantat (5 mm) skars med trefinblad för att säkerställa konsistens i storleken på explanterna erhållna från olika platser (platsegenskaper: fyra kvadranter i periferin, 6 mm i mitten). Under överföringen av explantat till odlingsinsatser kan näthinnan och choroid separeras. Därför krävs skonsam och smidig hantering för att säkerställa att explanterna överförs under det första försöket, eftersom upprepade försök kan orsaka näthinneskador. Slutligen bör mekanisk skada minimeras i största möjliga utsträckning under hela retinal explanteringsberedningsprocessen för att undvika att skada näthinnans struktur. Den tid det tar för explantberedning bör också minimeras för att undvika oavsiktlig celldöd.
4) Retinal explantkultur utfördes med användning av explantat innehållande näthinnan-RPE-choroidkomplexet. Jämfört med in vitro-kulturen av retinala celler som använder näthinnan utan bifogad RPE och choroid, möjliggör vår explantkultur bättre cellöverlevnad och förlänger följaktligen överlevnaden av fotoreceptorceller. Under odlingsprocessen vetter näthinnan uppåt och choroiden nedåt. Jämfört med musnäthinneplantor är apnäthinneplantor större i storlek, vilket ställer större krav på odlingsnäring. Därför utförde vi dagliga odlingsmedieförändringar för apans retinala explantkultur istället för att anta en odlingsmediumförändringsfrekvens på en gång varannan dag, som tidigare användes för musens retinala explantkultur.
Sammantaget har vi etablerat en in vitro NHP-modell genom odling av retinala explantat av makaker och deras behandling med zaprinast för att inducera cGMP-PKG-signalvägen som liknar den som observerats vid RD-patogenes. Zaprinast är en PDE6-hämmare och PDE6 upprätthåller balansen i den intracellulära koncentrationen av cGMP som aktiverar PKG17,18. cGMP-PKG-vägen kan negativt reglera oxidativ fosforylering och mitokondriella vägar och därigenom påverka retinal degeneration19. Induktionen av cGMP-PKG-signalvägen i denna in vitro NHP retinala modell etablerar den som en gynnsam modell för framtida forskning om patogenesen av RD, liksom för utveckling och toxikofarmakologisk testning av nya läkemedel för RD-behandling. Ändå har användningen av denna modell vissa begränsningar, särskilt dess relativt korta odlingsperioder och de relativt höga kostnaderna för primater. Under vår framtida forskning kommer denna in vitro-modell att användas för funktionell utvärdering av näthinnan efter intervention med MEA och μERG. Information och cellulära platser för PKG-mål kommer att kombineras med mätning av aktiviteter av nedströms effektorer (t.ex. calpain, PIRP och HDAC) och undersökningar av de relevanta neurodegenerativa mekanismerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (nr 81960180), Zinke Heritage Foundation och Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Vi tackar professor Longbao Lv (Zoologiska institutet, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Kina) för att ha delat med sig av apögongloberna som användes i denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
