Summary
يقدم البروتوكول الحالي طريقة فعالة ومرنة لعزل الحمض النووي الريبي من الكسور النووية والسيتوبلازمية باستخدام الخلايا المستزرعة ، ثم التحقق من صحتها باستخدام qPCR. هذا يعمل بشكل فعال كبديل لمجموعات إعداد الحمض النووي الريبي الأخرى.
Abstract
كان فصل المكونات داخل الخلايا أداة رئيسية في البيولوجيا الخلوية لسنوات عديدة حتى الآن وتمكن من توفير نظرة ثاقبة مفيدة حول كيفية تأثير موقعها على وظيفتها. على وجه الخصوص ، أصبح فصل الحمض النووي الريبي النووي والسيتوبلازمي مهما في سياق الخلايا السرطانية والسعي لإيجاد أهداف جديدة للأدوية. يمكن أن يكون شراء مجموعات لاستخراج الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي النووي مكلفا عندما يمكن العثور على العديد من المواد المطلوبة في بيئة معملية نموذجية. باستخدام الطريقة الحالية ، التي يمكن أن تحل محل مجموعات أكثر تكلفة أو غيرها من العمليات التي تستغرق وقتا طويلا ، لا يلزم سوى مخزن مؤقت محلي الصنع ، وأجهزة طرد مركزي على الطاولة ، وأعمدة تنقية عزل الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي والسيتوبلازمي. يستخدم المخزن المؤقت للتحلل لتحلل الغشاء الخارجي للخلية برفق دون التأثير على سلامة الغلاف النووي ، مما يسمح بإطلاق مكوناته داخل الخلايا. بعد ذلك، يمكن عزل النوى عن طريق خطوة طرد مركزي بسيطة؛ لأنها تحتوي على كثافة أعلى من محلول التحلل. يستخدم الطرد المركزي لفصل هذه المناطق بناء على اختلافات كثافتها لعزل العناصر تحت الخلوية في النواة عن تلك الموجودة في السيتوبلازم. بمجرد أن يقوم الطرد المركزي بعزل المكونات المختلفة ، يتم استخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي لتنقية محتوى الحمض النووي الريبي ، ويتم إجراء qPCR للتحقق من جودة الفصل ، ويتم تحديدها كميا بكمية الحمض النووي الريبي والسيتوبلازمي في الأجزاء المختلفة. تم تحقيق مستويات ذات دلالة إحصائية من الفصل ، مما يوضح فعالية البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف هذا النظام لعزل أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي (الكلي ، الحمض النووي الريبي الصغير ، إلخ) ، مما يسمح بالدراسة المستهدفة لتفاعلات السيتوبلازم والنواة ، ويساعد في فهم الاختلافات في وظيفة الحمض النووي الريبي الموجودة في النواة والسيتوبلازم.
Introduction
يسمح التجزئة الخلوية إلى مكونات دون خلوية بعزل ودراسة المجالات البيوكيميائية المحددة ويساعد في تحديد توطين عمليات خلوية محددة وكيف يمكن أن يؤثر ذلك على وظيفتها1. يمكن أن يسمح عزل الحمض النووي الريبي من مواقع مختلفة داخل الخلايا بتحسين دقة التحليل الجيني والكيميائي الحيوي لأحداث مستوى النسخ والتفاعلات الأخرى بين النواة والسيتوبلازم ، والتي تعمل كغرض أساسي للبروتوكولالحالي 2. تم تطوير هذا البروتوكول لضمان عزل الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي والنووي لتحديد دور كل منهما في التصدير النووي وفهم كيفية تأثير توطين الحمض النووي الريبي تحت الخلوي في النواة والسيتوبلازم على وظيفتها في العمليات الخلوية. وباستخدام مواد من بيئة مختبرية نموذجية، كان من الممكن تحقيق التجزئة النووية والسيتوبلازمية على نحو أكثر فعالية وأقل تكلفة من البروتوكولات الموضوعة سابقا دون المساس بجودة النتائج3.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دراسة تبادل الجزيئات بين السيتوبلازم والنواة مباشرة عن طريق فصل هذه المناطق. وبشكل أكثر تحديدا ، يعد فهم النسخ أمرا ضروريا لفهم التطور والمرض. ومع ذلك ، قد تكون الحمض النووي الريبي عند مستويات نضج مختلفة في أي وقت ويمكن أن تعقد تحليل المصب. يسمح هذا البروتوكول بالقدرة على عزل الحمض النووي الريبي من الكسور تحت الخلوية النووية والسيتوبلازمية ، والتي يمكن أن تساعد في دراسات الحمض النووي الريبي وتسمح بفهم أفضل لحمض نووي ريبوزي معين ذي أهمية ، مثل توطين الحمض النووي الريبي غير المشفر أو تحليل تقاطعات لصق داخل النواة.
تم تحسين هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي الطويل السيتوبلازمي والنووي ، بما في ذلك mRNAs و rRNAs و RNAs الطويلة غير المشفرة (lncRNAs) ، نظرا لانتقائية حجم عمود تنقية الحمض النووي الريبي المستخدم ، والذي يمكن تعديله لعزل الحمض النووي الريبي الآخر ذي الأهمية. في السابق ، كانت وظيفة الحمض النووي الريبي الطويل ، مثل mRNAs و lncRNAs ، تعتمد بشكل كبير على توطين كل منها داخل الخلية 4,5. لذلك ، أصبحت دراسة التصدير من النواة إلى المجالات دون الخلوية أكثر استهدافا لفهم الدور الذي يمكن أن يلعبه تصدير الحمض النووي الريبي أو المكونات الخلوية الأخرى على الخلية. تعمل lncRNAs كمثال رئيسي على ذلك ، حيث تعتمد ترجمتها وآثارها اللاحقة إلى حد كبير على القرب والتفاعلات مع أشكال أخرى من RNA6. علاوة على ذلك ، يرتبط تبادل العناصر الخلوية بين المناطق النووية والسيتوبلازمية بآليات المقاومة لمختلف علاجات السرطان7. سمح عزل المقصورات داخل الخلايا بتطوير مثبطات التصدير النووي ، مما قلل من آثار آليات المقاومة للعلاجات المختلفة8.
بعد فصل الحمض النووي الريبي النووي والسيتوبلازمي ، يتم تنفيذ خطوات لتنقية الحمض النووي الريبي محل الاهتمام. نظرا لأن مجموعات تنقية الحمض النووي الريبي توجد بشكل شائع داخل المختبرات وتعمل على تنقية وعزل الحمض النووي الريبي الطويل ، فإنها تخدم الغرض من هذا البروتوكول جيدا. لتنقية الحمض النووي الريبي ، يعد توليد نسب 260: 280 أكبر من 1.8 أمرا بالغ الأهمية لضمان جودة العينات لتسلسل الحمض النووي الريبي أو غيرها من الإجراءات المماثلة التي تتطلب مستويات عالية من النقاء والعزل. تشير القيم غير المنتظمة 260: 280 إلى تلوث الفينول ، مما يدل على ضعف العزل ويؤدي إلى نتائج غير دقيقة9.
بمجرد اكتمال تنقية الحمض النووي الريبي وتأكيد أن قيم 260: 280 أعلى من النطاق المقبول ، تم استخدام qPCR للتحقق من صحة نتائج عزل الكسور النووية والسيتوبلازمية. عند القيام بذلك ، تم استخدام الاشعال الخاصة بالمنطقة ذات الاهتمام لإثبات مستويات التجزئة النووية والسيتوبلازمية. في هذا البروتوكول ، تم استخدام MALAT1 و TUG1 كعلامات نووية وسيتوبلازمية ، على التوالي10. معا ، فإنها تسمح بإظهار مستويات عالية من التجزئة النووية مع MALAT1 ، في حين من المتوقع أن تكون التجزئة السيتوبلازمية منخفضة. على العكس من ذلك ، عند استخدام TUG1 ، من المتوقع أن تكون مستويات التجزئة السيتوبلازمية أعلى من مستويات التجزئة النووية.
باستخدام هذا البروتوكول ، كان من الممكن عزل الحمض النووي الريبي بناء على موقع عملها داخل الخلية. نظرا للوصول الواسع النطاق إلى العديد من المواد واستخدام المخزن المؤقت للتحلل فقط وتقنيات الطرد المركزي القائمة على الكثافة خلال هذه التجربة ، فإن قابلية التطبيق على أنواع الحمض النووي الريبي الأخرى والمكونات الخلوية الأخرى منتشرة على نطاق واسع. يمكن أن يوفر هذا معلومات مهمة من خلال تسليط الضوء على أحداث التعبير الخاصة بالموقع والتي لا يمكن تمييزها بدون فصل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تستخدم خلايا K562 في الدراسة الحالية. تم تحسين هذا البروتوكول للعمل مع 1 × 10 6-5 × 106 مليون خلية. ومع ذلك ، يمكن توسيع نطاق الإجراء لكميات أكبر من الخلايا عن طريق زيادة الأحجام بشكل مناسب.
1. إعداد المخزن المؤقت 0.25x تحلل
- قم بإعداد محلول تحلل 0.25x عن طريق خلط المكونات التالية الواردة في الجدول 1 أ.
ملاحظة: تتطلب العينات حوالي 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 0.25x. الحجم الموصى به = عدد العينات × 300 ميكرولتر.
2. فصل الكسور النووية والسيتوبلازمية
- قم بتكوير الخلايا باستخدام أنابيب سعة 1.5 مل عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 2000 × جم (درجة حرارة الغرفة). تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة شفط.
ملاحظة: تم استخدام خلايا K562 خلال هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول مع خطوط الخلايا المختلفة. - أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من محلول تحلل الثلج البارد 0.25x.
ملاحظة: الحفاظ على الجليد لمدة 2 دقيقة وتدوير الأنبوب كل 45 ثانية لضمان تحلل الخلايا بشكل صحيح. - قم بتدوير الأنابيب بأعلى سرعة (12000 × جم) عند 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة.
- بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ووضعها في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. سيكون هذا هو الجزء السيتوبلازمي. سيتم تحقيق ما يقرب من 300 ميكرولتر من الجزء السيتوبلازمي.
- الحبيبات المتبقية ستكون الجزء النووي. أضف 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد إلى الحبيبات وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: خلال هذه الخطوة ، تتم إزالة الحمض النووي الزائد.
3. تنظيف الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي
ملاحظة: تم تحقيق هذا البروتوكول باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
- فصل عينات الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي وعينات السيتوبلازم النووي (حيث تختلف خطوات التجزئة بينهما).
- لفصل الكسر السيتوبلازمي ، أضف 1050 ميكرولتر من محلول تحلل RLT 3.5x (انظر جدول المواد) والدوامة لفترة وجيزة. ثم أضف 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 90٪ وقم بتحميله على العمود من مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي.
ملاحظة: يجب خلط المحلول جيدا قبل التحميل على العمود. - لفصل الجزء النووي ، أضف 600 ميكرولتر من 3.5x محلول التحلل والدوامة. ثم أضف 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪.
- لفصل الكسر السيتوبلازمي ، أضف 1050 ميكرولتر من محلول تحلل RLT 3.5x (انظر جدول المواد) والدوامة لفترة وجيزة. ثم أضف 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 90٪ وقم بتحميله على العمود من مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي.
- قم بتحميل كل من الكسور السيتوبلازمية والنووية على أعمدة الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
ملاحظة: بالنسبة لبقية الخطوة 3 ، تتبع كل من العينات السيتوبلازمية والنووية نفس الإجراء. ومع ذلك ، تأكد من أن هذه العينات تظل مستقلة عن بعضها البعض.- قم بتحميل كل من الكسور السيتوبلازمية والنووية على أعمدة الحمض النووي الريبي وقم بتدويرها لمدة 30 ثانية عند 8000 × جم في درجة حرارة الغرفة. تخلص من التدفق الزائد من خلاله.
- أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل من مجموعة تنقية متاحة تجاريا (مخزن مؤقت RW1 ، انظر جدول المواد) ، وقم بتدويره مرة أخرى ، وتجاهل التدفق من خلاله.
- أضف محلول DNAse (1U / uL) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل ، وقم بتدويره مرة أخرى ، وتجاهل التدفق من خلاله.
- أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل المعتدل (RPE ، انظر جدول المواد) ، وقم بتدويره مرة أخرى ، وتجاهل التدفق من خلاله. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل المعتدل ، وقم بتدويره مرة أخرى ، ولكن لمدة 2 دقيقة فقط.
- انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 مل وأضف 30 ميكرولتر من الماء إلى عمود الدوران. دع العمود يجلس لمدة 1 دقيقة قبل الدوران.
4. التحقق من صحة الفصل النووي السيتوبلازمي
- أداء تخليق cDNA
- بمجرد استخراج وتنقية الأجزاء تحت الخلوية من الحمض النووي الريبي ، تأكد من فصل المقصورات باستخدام qPCR. للقيام بذلك ، أولا ، قم بتحويل الحمض النووي الريبي إلى cDNA باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- تحضير ماستر النسخ العكسي. إضافة قالب الحمض النووي الريبي. احتضان ردود الفعل في دورة حرارية.
ملاحظة: بالنسبة للسداسيات العشوائية ، يتم توفير معلمات الدورة المستخدمة في الجدول 2A. استخدم تفاعل النسخ العكسي على الفور أو خزنه عند -20 درجة مئوية (الجدول 1 ب).
- إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) والتحليل.
- قم بتخفيف تخليق cDNA بماء DEPC (انظر جدول المواد) للحصول على تركيز نهائي قدره 20 نانوغرام / مل.
- باستخدام مزيج رئيسي من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد التفاعل لكل عينة باستخدام التعليمات اليدوية كما هو موضح أدناه.
- الحصول على المجسات التجارية اللازمة للكشف عن التجزئة السيتوبلازمية والنووية. استخدم MALAT1 كعلامة نووية و TUG1 كعلامة السيتوبلازمية (انظر جدول المواد).
ملاحظة: ترد في الجدول 3 تسلسلات MALAT1 و TUG1. - احسب حجم كل مكون بضرب كل مكون في 3 لكل من النسخ المتماثلة التقنية للعينة الفردية.
- لكل عينة نووية وسيتوبلازمية ، احصل على الخلطات التالية لكل منها: (أ) جزء نووي مع MALAT1 ، (ب) جزء سيتوبلازمي مع MALAT1 ، (ج) جزء نووي مع TUG1 ، و (د) جزء سيتوبلازمي مع TUG1 (الجدول 1C).
- دوامة لفترة وجيزة لخلط المحاليل ونقل 20 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر من لوحة التفاعل البصري (انظر جدول المواد).
- قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق شفاف يستخدم في qPCR (انظر جدول المواد) وطرد مركزي للوحة لفترة وجيزة للتخلص من فقاعات الهواء ، ثم قم بتدوير العينة لأسفل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام برنامج التصميم والتحليل (انظر جدول المواد) ، حدد المنحنى القياسي لمعلمات ركوب الدراجات (الجدول 2B).
- باستخدام برنامج qPCR ، حدد إعداد التشغيل (الشكل التكميلي 1).
- في صفحة خصائص ملف البيانات ، حدد معلمات الطريقة ودورة الإدخال من الجدول 2B (الشكل التكميلي 2).
- بعد إدخال معلمات الدورة ، حدد علامة التبويب Plate ، وأدخل العينات المراد تشغيلها (الشكل التكميلي 3). حدد بدء التشغيل.
ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات الموضحة في جهاز qPCR باستخدام مزيج رئيسي متاح تجاريا (انظر جدول المواد).
- إجراء تحليل البيانات
- بعد اكتمال التشغيل، قم بإنشاء جدول بيانات باسم العينة واسم الهدف ودورة القياس الكمي (Cq) (الجدول التكميلي 1).
- ابدأ بعينات MALAT1 لحساب الكسر النووي. اطرح الجزء السيتوبلازمي MALAT1 من الجزء النووي MALAT1 (الجدول 4).
- ثم احسب ΔCq (2 ^ (-value)) (الجدول 5).
- استمر في عينات MALAT1 لحساب الكسر السيتوبلازمي ، واطرح الجزء النووي MALAT1 من الكسر السيتوبلازمي MALAT1 ، ثم احسب ΔCq (2 ^ (-value)) (الجدول 6).
ملاحظة: بالنظر إلى ΔCq ، لوحظ أن جزء MALAT1 النووي (تسليط الضوء الأخضر) له علامة MALAT1 أكبر من السيتوبلازم (تسليط الضوء الأحمر) ، ولكن الآن مطلوب تأكيد للتأكد من أن الجزء السيتوبلازمي هو في الغالب السيتوبلازم وأن الجزء النووي لا يحتوي على تلوث السيتوبلازم. - باستخدام عينات TUG1، قم بإجراء نفس العملية الحسابية المذكورة أعلاه (الخطوات 4.3.2-4.3.4) (الجدول 7).
ملاحظة: بالنظر إلى ΔCq ، لوحظ أن جزء TUG1 السيتوبلازمي (تسليط الضوء الأخضر) له علامة TUG1 أكبر من الجزء النووي (تسليط الضوء الأحمر) ، مما يؤكد الفصل الجيد للكسور السيتوبلازمية والنووية (الجدول 8 ، الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لضمان تحقيق العزل النووي والسيتوبلازمي ، تم إجراء qPCR للتحقق من صحة النتائج. عند القيام بذلك ، تم استخدام الاشعال الخاصة بالمنطقة ذات الاهتمام لإثبات مستويات التجزئة النووية والسيتوبلازمية. في هذه الدراسة ، تم استخدام MALAT1 و TUG1 كبادئات نووية وسيتوبلازمية ، على التوالي. معا ، فإنها تسمح بإظهار مستويات عالية من التجزئة النووية مع MALAT1 كتحكم إيجابي للعناصر النووية ، في حين من المتوقع أن تكون التجزئة السيتوبلازمية منخفضة. على العكس من ذلك ، عندما يكون TUG1 موجودا كعنصر تحكم إيجابي للعناصر السيتوبلازمية ، فمن المتوقع أن تكون مستويات التجزئة السيتوبلازمية أعلى من مستويات التجزئة النووية. يمكن ملاحظة ذلك في الشكل 2، وهو مثال على نتيجة إيجابية تؤكد انفصال الحمض النووي الريبوزي النووي السيتوبلازمي عن الحمض النووي الريبوزي السيتوبلازمي.
يمكن رؤية نتيجة سلبية في الشكل 3 ، حيث لوحظت مستويات التجزئة السيتوبلازمية في العينة باستخدام MALAT1. يشير هذا إلى تلوث الحمض النووي الريبي المعزول من الجزء النووي ، ربما بسبب تركيزات التحلل المنخفضة جدا أو المرتفعة جدا. جربت هذه الدراسة أيضا مواد أولية أخرى ، لكن MALAT1 و TUG1 أظهرا أعلى ارتباط بالفصل النووي والسيتوبلازمي ، كما تم تأكيده من خلال اللطخة الغربية والرحلان الكهربائي للحمض النووي الريبي ، مما أكد نقاء وجودة العينات (الشكل 4 والشكل 5).
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إثبات نقاء المستخلصات النووية والسيتوبلازمية من خلال لطخة غربية باستخدام lamin كعلامة للجزء النووي وألفا توبولين كعلامة موجبة للجزء السيتوبلازمي10 ، كما هو موضح في الشكل 4. هناك تعبير واضح عن الصفيحة فقط داخل الجزء النووي ، مع تعبير واضح عن ألفا توبولين داخل الجزء السيتوبلازمي ، مما يشير إلى النقاء النسبي داخل كل عينة.
نظرا لميل الحمض النووي الريبي إلى التحلل أثناء عملية qPCR ، من الضروري تأكيد جودة عائد الحمض النووي الريبي باستخدام رحلان الحمض النووي الريبي. تم إجراء الرحلان الكهربائي للحمض النووي الريبي وأظهر جودة عالية من الحمض النووي الريبي بسبب وجود ذروة في الوحدة الفرعية 32S rRNA ، وهي ميزة موجودة فقط في الكسور النووية. يشير وجود هذه الذروة إلى النقاء النووي والتجزئة الكافية. على العكس من ذلك ، لم يلاحظ أي ذروة في الرحلان الكهربائي للحمض النووي الريبي السيتوبلازمي ، مما يدل على جودة عالية وتلوث ضئيل أو معدوم في عينة الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي11 (الشكل 5).
الشكل 1: رسم تخطيطي لخطوات البروتوكول. بعد معالجة الخلايا ، يتم تحليلها وطردها مركزيا للعزل. بعد ذلك ، يتم إجراء عزل الحمض النووي الريبي ، ويتم إنشاء cDNA قبل التحقق من صحة العزل باستخدام qPCR. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بيانات النتائج الإيجابية. يسلط الشكل الضوء على نجاح البروتوكول الذي أظهرته المستويات العالية من فصل المكونات النووية والسيتوبلازمية. أظهر MALAT1 ، وهو برايمر الحمض النووي الريبي النووي ، مستويات أعلى ذات دلالة إحصائية من الجزء النووي. في TUG1 ، وهو تمهيدي للحمض النووي الريبي السيتوبلازمي ، لوحظت مستويات أعلى ذات دلالة إحصائية من الكسر السيتوبلازمي. لوحظت دلالة إحصائية عالية في كلتا العينتين عن طريق اختبار t. ص < 0.0001. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بيانات النتائج السالبة. يسلط الشكل الضوء على مثال على النتائج السلبية باستخدام البروتوكول التي أظهرتها المستويات العالية من الفصل بين المكونات النووية والسيتوبلازمية. أظهر MALAT1 ، وهو جهاز تمهيدي للحمض النووي الريبي النووي ، مستويات الكسور السيتوبلازمية الناجمة عن التلوث النووي. لم يلاحظ وجود فروق في الدلالة الإحصائية بين الكسور عبر اختبار t. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اللطخة الغربية توضح نقاء الكسور السيتوبلازمية والنووية. يسلط الشكل الضوء على لطخة غربية من الكسور النووية والسيتوبلازمية. تم استخدام Lamin للتحقق من نقاء العينة النووية ، بينما تم استخدام alpha-tubulin لإثبات نقاء الجزء السيتوبلازمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تأكيد نقاء الحمض النووي الريبوزي للأجزاء السيتوبلازمية والنووية عن طريق الرحلان الكهربائي للحمض النووي الريبوزي (RNA). أ: رحلان كهربي للحمض النووي الريبوزي (RNA) للجزء النووي. يوضح السهم 32S rRNA ، والذي يتم ملاحظته فقط في الكسور النووية. ب: الرحلان الكهربي للحمض النووي الريبوزي (RNA) للجزء السيتوبلازمي. يشير عدم وجود ذروة 32S إلى نقاء الحمض النووي الريبي للجزء السيتوبلازمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تركيب مخزن التحلل ومخاليط التفاعل والعينات. (أ) تكوين مخزن مؤقت للتحلل 0.25x. ب: تركيب مزيج النسخ العكسي المستخدم أثناء نسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) إلى الحمض النووي المركب. ج: تركيب العينات النووية والسيتوبلازمية باستخدام مجموعة النسخ العكسي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: المعلمات الدورية. (أ) معلمات الدورة للدراجات الحرارية. تم استخدام هذه المعلمات خلال qPCR لتضخيم التسلسل المستهدف. ب: بارامترات الدورة للعينات النووية والسيتوبلازمية. تم استخدام هذه المعلمات خلال qPCR لتضخيم التسلسل المستهدف. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: تسلسل الواسمات النووية والسيتوبلازمية. يتضمن الجدول تسلسلات العلامات المستخدمة لتأكيد الانفصال النووي والسيتوبلازمي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 4: إجراء طرح الكسور النووية والسيتوبلازمية MALAT1. مثال على ورقة البيانات المستخدمة لطرح الجزء النووي MALAT1 - جزء السيتوبلازم MALAT1. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 5: إجراء حساب ΔCq (2 ^ (-value). مثال على ورقة البيانات المستخدمة لحساب ΔCq (2 ^ (-value)). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 6: إجراء حساب الكسر السيتوبلازمي. مثال على ورقة البيانات المستخدمة لحساب الكسر السيتوبلازمي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 7: إجراءات حساب الكسر النووي. مثال على ورقة البيانات المستخدمة لحساب الكسر النووي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 8: إجراء تأكيد نتيجة التجزئة الناجحة. مثال على ورقة البيانات المستخدمة للتحقق من التجزئة الناجحة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الشكل التكميلي 1: صورة لبرنامج تصميم وتحليل آلة qPCR. صورة توضح تشغيل جهاز qPCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: صورة qPCR "خصائص ملف البيانات". صورة توضح إجراء إعداد المعلمات لتشغيل qPCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: صورة لتحميل العينات في آلة qPCR. صورة توضح إجراء إضافة عينات إلى برنامج qPCR للتحليل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: ورقة بيانات اسم العينة. مثال لورقة البيانات مع اسم العينة واسم الهدف وقيمة Cq. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في جميع أنحاء البروتوكول ، تم اتخاذ بعض الخطوات لتحسين العناصر لتكون أكثر فعالية لخط اهتمام الخلية. في حين أن الخطوات داخل البروتوكول واضحة نسبيا ، فقد يكون من الضروري إجراء تحليل وتعديلات طفيفة خلال الجوانب الحرجة للبروتوكول. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي تعديل تركيز المخزن المؤقت للتحلل إلى تركيز مناسب بناء على خط اهتمام الخلية والهدف الخلوي. نظرا لأن استخدام المخزن المؤقت للتحلل يعتمد إلى حد كبير على تعطيل أغشية الخلايا ، فهناك تباين طبيعي في فعالية محلول التحلل على خطوط الخلايا المختلفة حيث توجد اختلافات طفيفة في هشاشة الخلايا ونفاذية الغشاء بين خطوط الخلايا المختلفة12. بدءا من خط الأساس من المخزن المؤقت للتحلل 1x ، تم تنفيذ الخطوات في البروتوكول مع تقليل تركيز المخزن المؤقت للتحلل تدريجيا إلى 0.25x ، مما يضمن نتائج أكثر فعالية. نظرا لأن التجربة تهدف في النهاية إلى عزل عدد كبير من المكونات دون الخلوية ، فإن ضمان تحسين تركيز المخزن المؤقت للتحلل إلى خط اهتمام الخلية أمر بالغ الأهمية لتحقيق أعلى عائد وأفضل النتائج.
بالإضافة إلى تعديل تركيزات المخزن المؤقت للتحلل ، من المهم ملاحظة هشاشة الحمض النووي الريبي والحذر من الإجهاد أثناء عزل الحمض النووي الريبي. الحمض النووي الريبي أكثر عرضة للتحلل من الحمض النووي والعديد من العناصر الخلوية الأخرى ، حيث يمكن أن تكون مجموعة الهيدروكسيل 2 بوصة بمثابة نقطة ربط ل RNases ، وهي عائلة من الإنزيمات التي يمكن أن تتحلل من الحمض النووي الريبي وتؤدي إلى نتائج سيئة. RNases قادرة للغاية على تدهور الحمض النووي الريبي ، حتى عند تقديمها بكميات طفيفة13. نظرا لأن RNases يتم إطلاقها من الخلايا أثناء وبعد خطوات التحلل ، يجب توخي الحذر لمنع التلوث ، مما قد يؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي غير المرغوب فيه14. تتضمن الخطوات ارتداء القفازات أثناء التجربة وتغييرها في كثير من الأحيان لتجنب نقل RNases من البيئة أو الأسطح إلى العينات. بالإضافة إلى ذلك ، يجب استخدام حلول خالية من RNase ، ويجب استخدام مساحة عمل منفصلة عند التعامل مع الحمض النووي الريبي. أخيرا ، نظرا لأن RNase يمكن أن يكون مقاوما جدا للمخزن المؤقت للتحلل وتغيير الطبيعة ، يمكن استخدام مثبطات RNase للتخفيف من آثارها السلبية على عزل الحمض النووي الريبي15.
في حين أن الخطوات خلال البروتوكول أسفرت عن نتائج ناجحة للغاية ، إلا أن هناك بعض القيود. بادئ ذي بدء ، في حين يمكن عزل مكونات الحمض النووي الريبي والسيتوبلازم إلى حد كبير عن بعضها البعض ، لا يمكن فصل الاثنين تماما دون تعريض جودة الحمض النووي الريبي للدراسة. ونتيجة لذلك ، فإن أي استنتاج يعتمد على الاختلافات في نشاط أو وظيفة الجزيئات من هذه المناطق المنفصلة قد ينحرف قليلا بسبب عدم القدرة على اشتقاق عينات معزولة تماما. من المهم أيضا ملاحظة أنه إذا تم تكييف البروتوكول مع جزيئات الخلايا الأخرى ، مثل البروتينات ، فقد تتحلل بعض البروتينات أو العناصر الخلوية الأخرى أثناء فصل المستخلصات النووية ، مما يؤدي إلى فقدان النشاط والتأثير على نتائج الفرد16. من المهم أيضا ملاحظة أنه خلال هذا البروتوكول ، تم إجراء qPCR للأجزاء النووية والسيتوبلازمية باستخدام MALAT1 و TUG1 ببساطة للتحقق من نقاء وجودة العينات. للتوسع في هذه الفكرة ، لم يتم تحليل أو مقارنة النسب النسبية للحمض النووي الريبي النووي والسيتوبلازمي خلال هذا البروتوكول ، حيث تم استخدامه فقط لغرض التحقق من الصحة. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع استخدامات أخرى ، مثل مقارنة النسب النسبية للكسور النووية والسيتوبلازمية ، ولكن يجب تطبيع هذه القيم مع كمية إجمالي الحمض النووي الريبي لإجراء تحليل أو مقارنة دقيقة. تم وصف خطوات تطبيع الكسور السيتوبلازمية والنووية إلى إجمالي مستويات الحمض النووي الريبي سابقا في بروتوكولات أخرى11.
ومع ذلك ، كما ذكرنا سابقا ، تستخدم هذه الطريقة مواد معملية شائعة لتوليد مستخلصات RNA عالية الجودة بفعالية من حيث التكلفة. أيضا ، تثبت هذه الطريقة لدراسة التفاعلات النووية والسيتوبلازمية أنها من بين أكثر الإجراءات فعالية من حيث الوقت. يؤدي استخدام مجموعات نقاء الحمض النووي الريبي إلى تنظيف فعال للغاية للحمض النووي الريبي ويساعد على ضمان مستويات عالية من عزل الحمض النووي الريبي من مناطق خلوية مختلفة ، مما يؤدي إلى عينات أكثر فعالية للدراسة. أخيرا ، تقدم قابلية التكيف لهذا البروتوكول نفسها كميزة رئيسية ، حيث أن تعديل تركيز المخزن المؤقت للتحلل يمكن أن يتيح الوصول إلى دراسة العديد من خطوط الخلايا المختلفة ، ويمكن أن تؤدي تقنية فصل الكثافة مثل الطرد المركزي إلى عزل العديد من العناصر الخلوية المختلفة. مع تزايد انتشار الدراسات حول التفاعلات السيتوبلازمية والنووية ، يمكن فهم تأثير التوطين على المكونات الخلوية بشكل أفضل. يمكن تحليل التبادل بين السيتوبلازم والنواة ، مما يشير إلى ما إذا كانت جزيئات معينة خلال هذه التبادلات يمكن أن تؤدي إلى تطور السرطان ، حيث أشارت الدراسات التي أجريت على البروتينات النووية مثل XPO1إلى 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
بدعم من منح من الجمعية الأمريكية لأمراض الدم ، ومؤسسة روبرت وود جونسون ، ومؤسسة دوريس ديوك الخيرية ، ومؤسسة إدوارد بي إيفانز ، والمعهد الوطني للسرطان (1K08CA230319).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
References
- Conrad, T., Orom, U. A. Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA. Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).
- Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D.
- Liu, X., Fagotto, F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Science Signaling. 4 (203), (2011).
- Jansen, R. P. mRNA localization: message on the move. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).
- Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization. Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).
- Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. 150 years of the mass action law. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).
- El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy. Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer). Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).
- Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting. Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
- Taylor, J., et al. Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis. Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).
- Ayupe, A. C., et al. Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome. RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).
- Ghuysen, J. -M., Hakenbeck, R. Bacterial Cell Wall. , Elsevier. (1994).
- Fersht, A. Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
- Blumberg, D. D.
- Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 12, Unit 12.1 (2006).
- Taylor, J., et al. Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents. Blood. 132, Supplement 1 233 (2018).
