Summary
Questo protocollo descrive un approccio per facilitare modifiche precise knock-in negli embrioni di zebrafish utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Viene presentata una pipeline di fenotipizzazione per dimostrare l'applicabilità di queste tecniche per modellare una variante genetica associata alla sindrome del QT lungo.
Abstract
Le brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) in modelli animali consentono una precisa manipolazione genetica per lo studio dei fenomeni fisiologici. I pesci zebra sono stati utilizzati come modello genetico efficace per studiare numerose domande relative alla malattia ereditaria, allo sviluppo e alla tossicologia a livello di intero organo e organismo. Grazie al genoma del pesce zebra ben annotato e mappato, sono stati sviluppati numerosi strumenti per l'editing genetico. Tuttavia, l'efficacia della generazione e la facilità di rilevare modifiche precise utilizzando CRISPR è un fattore limitante. Qui è descritto un approccio knock-in basato su CRISPR-Cas9 con la semplice rilevazione di modifiche precise in un gene responsabile della ripolarizzazione cardiaca e associato al disturbo elettrico, la sindrome del QT lungo (LQTS). Questo approccio a due RNA a guida singola (sgRNA) asporta e sostituisce la sequenza bersaglio e collega un gene reporter geneticamente codificato. L'utilità di questo approccio è dimostrata descrivendo misure fenotipiche non invasive della funzione elettrica cardiaca in larve di zebrafish wild-type e geneticamente modificate. Questo approccio consente lo studio efficiente delle varianti associate alla malattia in un intero organismo. Inoltre, questa strategia offre possibilità per l'inserimento di sequenze esogene di scelta, come geni reporter, ortologhi o editor di geni.
Introduction
Le strategie di editing genetico basate su CRISPR in modelli animali consentono lo studio di malattie, sviluppo e tossicologia geneticamente ereditabili a livello dell'intero organismo 1,2,3. I pesci zebra forniscono un modello potente che è più vicino in numerosi aspetti fisiologici agli esseri umani rispetto ai modelli cellulari murini o derivati dall'uomo4. Una vasta gamma di strumenti e strategie genetiche sono stati utilizzati nel pesce zebra sia per lo screening genetico in avanti5 che per lo screening genetico inverso6. La mappatura genetica completa e l'annotazione nel pesce zebra hanno facilitato gli approcci di modifica genetica come tecnica primaria per progettare knockout genici mirati (KO) e knock-in precisi (KI)7.
Nonostante ciò, la generazione di modifiche KI precise nel pesce zebra è limitata dalle basse efficienze e dalla difficoltà di un rilevamento accurato. Sebbene le nucleasi effettrici simili al fattore di trascrizione (TALEN) siano state utilizzate con successo e ottimizzate per i KI8, CRISPR fornisce una migliore strategia di modifica genetica con un targeting più semplice degli sgRNA. Numerosi studi hanno utilizzato CRISPR per generare KI precisi nel pesce zebra 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, sebbene queste modifiche generate attraverso la riparazione diretta dall'omologia mediata da CRISPR (HDR) tendano ad essere inefficienti con un basso successo intrinseco Tassi che richiedono la genotipizzazione come schermo primario 9,10,14,21. Ciò dimostra la necessità di un efficiente sistema KI CRISPR nel pesce zebra, nonché di un sistema affidabile ad alto rendimento per rilevare modifiche precise.
L'obiettivo di questo studio era quello di descrivere una piattaforma per generare un preciso gene cardiaco KI nei cuori di zebrafish con un rilevamento semplice e ad alto rendimento delle modifiche riuscite. Viene descritto un approccio di sostituzione dell'esone a due sgRNA basato su CRISPR-Cas9, basato su un approccio TALEN8. Questo approccio prevede l'escissione della sequenza bersaglio utilizzando due guide di sgRNA e la sostituzione con una sequenza modello esogena che contiene il KI di interesse e un gene reporter intronico geneticamente codificato (Figura 1). L'integrazione di un reporter fluorescente geneticamente codificato all'interno della sequenza intronica del gene bersaglio consente l'individuazione efficiente di modifiche positive. Viene quindi descritta una piattaforma di fenotipizzazione per valutare la funzione elettrica cardiaca nelle larve di zebrafish per la caratterizzazione non invasiva delle varianti genetiche associate alla LQTS ereditaria, una malattia elettrica cardiaca che predispone gli individui alla morte cardiaca improvvisa.
Questi approcci miglioreranno l'accesso e l'uso delle modifiche del gene KI del pesce zebra per modellare le malattie ereditarie e affrontare questioni biologiche e fisiologiche, come la mappatura dei modelli di espressione genica e la regolazione dello sviluppo. Poiché i cuori di zebrafish sono più simili alle caratteristiche elettrofisiologiche cardiache umane rispetto ai modelli murini, possono essere particolarmente interessanti come sistema geneticamente trattabile per la modellazione di malattie cardiache 7,22,23.
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Protocol
Gli studi che utilizzano il pesce zebra sono stati condotti in accordo con le politiche e le procedure del Simon Fraser University Animal Care Committee e del Canadian Council of Animal Care e sono stati completati secondo il protocollo # 1264K-18.
1. Progettazione di componenti CRISPR per modifiche precise
- Per progettare le guide a due sgRNA che verranno utilizzate per asportare la sequenza contenente il sito bersaglio KI, identificare prima l'ortologo del pesce zebra per il gene di interesse.
NOTA: la Figura 2 fornisce una panoramica riepilogativa dei passaggi per progettare modifiche precise utilizzando l'approccio CRISPR-Cas9 a due sgRNA. - Successivamente, utilizzare uno strumento software di progettazione, come CRISPOR24, che include la selezione per Danio rerio come specie e dell'enzima Cas da utilizzare.
NOTA: Il gene di interesse per questo studio era zkcnh6a (Ensembl Transcript ID: ENSDART00000090809.6; UniProt Protein ID: B3DJX4), e la mutazione bersaglio era l'amminoacido, R56Q.- Per l'approccio a due sgRNA, scegliere una posizione di sgRNA che precede l'esone bersaglio e un secondo sgRNA che si trova all'interno dell'introne immediatamente a valle.
- Assicurarsi che gli sgRNA selezionati abbiano un'elevata specificità e un basso legame off-target previsto. Utilizza le classifiche CRISPOR per identificare le guide con un'associazione off-target minima. Non prendere in considerazione guide senza discrepanze nella sequenza seed di potenziali fuori bersaglio.
- Identificare i potenziali siti off-target più probabili (in base ai punteggi CRISPOR, selezionare i primi tre siti potenziali di esone off-target) per la genotipizzazione del sequenziamento Sanger basata su PCR nella fase 6.1.3.
- Una volta selezionati i due sgRNA, ottenere il complemento inverso per ciascuno, in modo tale che ci siano quattro oligonucleotidi da utilizzare: due oligo complementari che precedono la mutazione e due oligo complementari che si trovano a valle.
- Su ciascuno dei quattro oligo, aggiungere siti di restrizione compatibili per l'incorporazione in un plasmide guida di scelta; per l'integrazione nel plasmide DR274, utilizzare un sito di restrizione BsaI di 5' per creare una sporgenza. Assicurarsi che il sito di riconoscimento Bsa1 sia progettato all'estremità 5' della guida selezionata da CRISPOR e che il sito di riconoscimento Bsa1 sia progettato all'estremità 5' dei filamenti complementari per garantire il corretto orientamento delle guide nel plasmide DR274 (vedere Figura 3).
- Per progettare il modello esogeno utilizzato per l'HDR nel pesce zebra (Figura 1), scegliere due frammenti di sequenza che affiancheranno il gene reporter mVenus YFP ospitato nel plasmide pKHR5.
NOTA: la modifica/modifica prevista può essere inclusa nel frammento a monte o a valle.- Utilizzando Ensembl, individuare il sito target all'interno della sequenza genica di interesse, inclusa approssimativamente la sequenza di fiancheggiamento di 2 kb (braccio di omologia), che verrà utilizzata per creare il modello.
NOTA: I bracci di omologia possono essere simmetrici o asimmetrici25,26 e circa 1 kb ciascuno, a monte e a valle del sito bersaglio. - Dividere il modello in due segmenti che verranno inseriti su entrambi i lati del gene reporter mVenus YFP (vedere Figura 4). Assicurarsi che il sito diviso si trovi in un introne in modo che la sequenza di codifica non venga interrotta.
NOTA: Se il gene è ben caratterizzato, controllare i ruoli funzionali nell'introne, come i siti di splicing o le regioni regolatorie. Le regioni vicine alle estremità 5' o 3' sono più spesso coinvolte nello splicing dell'mRNA. - Incorporare modifiche nella sequenza del modello che includono i) mutazioni silenti nel motivo adiacente del protospacer guida (PAM) o nella sequenza di semi (essere consapevoli dei siti PAM alternativi che l'enzima Cas potrebbe prendere di mira) per prevenire il ritaglio dell'enzima Cas; ii) la modifica dell'interesse; iii) la creazione di siti endonucleasi di restrizione per facilitare la clonazione nel plasmide pKHR5, che contiene il gene reporter mVenus YFP (vedi Figura 3).
NOTA: In questo studio, il primo segmento modello conteneva XhoI a monte del sito di mutazione R56Q e SalI a valle, mentre il secondo segmento modello aveva EcoRI a monte della sequenza target guida e BamHI a valle. Se uno qualsiasi dei siti di restrizione selezionati è presente all'interno della sequenza del modello, saranno necessarie mutazioni per silenziarli oppure è possibile utilizzare approcci alternativi come Gibson Assembly.
- Utilizzando Ensembl, individuare il sito target all'interno della sequenza genica di interesse, inclusa approssimativamente la sequenza di fiancheggiamento di 2 kb (braccio di omologia), che verrà utilizzata per creare il modello.
2. Preparazione dei componenti CRISPR per la microiniezione embrionale
- Preparare il Cas9 per la microiniezione 1 settimana prima delle microiniezioni. Utilizzare la proteina Cas9 o preparare l'mRNA Cas9 tramite trascrizione in vitro .
NOTA: In questo studio è stato utilizzato l'mRNA Cas9, poiché le efficienze tendevano ad essere più elevate.- Amplificare le colture batteriche di agar stab XL1 Blue disponibili in commercio (contenenti plasmide Cas9) utilizzando un antibiotico appropriato come l'ampicillina. Utilizzare 675 μL di coltura liquida (con 325 μL di glicerolo) per creare uno stock di glicerolo di riserva per la conservazione a lungo termine a -80 °C.
- Utilizzare il resto della coltura liquida per una purificazione miniprep, secondo il protocollo fornito con il kit miniprep. Risospendere il DNA purificato finale in 50 μL del tampone di eluizione fornito. Quantificare il prodotto tramite uno spettrofotometro per esaminarne la resa e la purezza.
- Linearizzare 2 μg di DNA purificato tramite digest di restrizione utilizzando un enzima di restrizione appropriato e utilizzando il tampone e il tempo di incubazione appropriati elencati per l'enzima di interesse.
- Purificare il plasmide linearizzato utilizzando un kit di purificazione PCR, risospendendolo in 30 μL del tampone di eluizione fornito.
- Dopo aver quantificato il prodotto, utilizzarlo come modello per la trascrizione in vitro utilizzando il kit di trascrizione appropriato per il promotore di interesse. Seguire il protocollo previsto e purificare tramite precipitazione di cloruro di litio27. Risospendere l'RNA purificato in 10 μL di H2O privo di nucleasi e quantificarlo prima di conservarlo a -20 °C per l'uso nella miscela di microiniezione.
- Preparare le due guide sgRNA.
- Preparare il plasmide sgRNA con un'impalcatura amplificando colture batteriche dalla pugnalata di agar batterico XL1 Blue disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali per i dettagli) nello stesso modo di MLM3613 sopra (passo 2.1.1), tranne usare kanamicina invece di ampicillina.
- Ricottura delle due coppie di oligonucleotidi complementari a singolo filamento (ssODNs) per le guide sgRNA progettate sopra risospendendo prima gli ssODN in tampone di ricottura 1x ad una concentrazione di 100 μM.
- In reazioni separate per ciascuno dei due sgRNA, ricottura la coppia di ssODN complementari usando un termociclatore. Mescolare 2 μg di ciascuna coppia ssODN complementare con 50 μL di tampone di ricottura e incubare a 95 °C per 2 minuti, quindi raffreddare a 25 °C per 45 minuti.
- Digerire un plasmide disponibile in commercio che contiene un'impalcatura di gRNA. Digerire 2 μg del plasmide DR274 utilizzando 1 μL di BsaI, 2 μL di tampone appropriato e ddH2O a 20 μL a 37 °C per 1 ora. Confermare la linearizzazione (opzionale: purificare utilizzando un kit di purificazione PCR) utilizzando l'elettroforesi su gel28.
- In due reazioni di legatura separate (una per ogni sgRNA), legare gli ssODN ricotti con il plasmide DR274 linearizzato. Utilizzare un rapporto inserto molare:vettore di 3:1, calcolando la massa appropriata attraverso un calcolatore di legatura online. Mescolare la massa richiesta dell'inserto e del vettore con 1 μL di T4 DNA ligasi, 2 μL di tampone di legatura e ddH2O a 12 μL e incubare a temperatura ambiente per 12 ore.
- Trasformare 2 μL del prodotto legato in cellule competenti appropriate (come le cellule da 10β) utilizzando approcci standard, quindi amplificare e purificare il prodotto utilizzando un kit Miniprep disponibile in commercio. Facoltativo: creare uno stock di glicerolo di questo prodotto.
- Trascrivi i due sgRNA linearizzando 2 μg di ciascuna guida usando un sito di restrizione a valle di 3' che sia il più vicino possibile alla fine della sequenza spaziale. Per il plasmide DR274, linearizzare con HindIII, quindi purificare il modello di RNA utilizzando un kit di purificazione PCR, risospendendo in 30 μL del tampone di eluizione.
- Trascrivi le due guide usando un kit di trascrizione dell'RNA. Seguire il protocollo del produttore e purificare mediante precipitazione di cloruro di litio27. Risospendere le due guide di sgRNA purificato in 10 μL di H2O privo di nucleasi, quantificarle e conservarle a -20 °C per l'uso nella miscela di microiniezione.
NOTA: Il kit di trascrizione dell'RNA non può incorporare un cappuccio da 5' o una coda poli-A.
- Prepara il modello di reporter HDR esogeno a doppio filamento.
NOTA: Il modello è sintetizzato in due parti, una a monte e una a valle del gene reporter mVenus YFP. Questi due segmenti sono costrutti sintetici ordinati attraverso un fornitore commerciale e poi legati al plasmide pKHR5 (che contiene mVenus YFP) in sequenza.- Preparare il plasmide pKHR5 amplificando colture batteriche dal ceppo batterico DH5α disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali per i dettagli) nello stesso modo di MLM3613 sopra (passo 2.1.1).
NOTA: Il plasmide pKHR5 contiene la sequenza genica reporter mVenus YFP. - Risospendere i due segmenti modello progettati sopra a 100 μM nel buffer TE e quindi trasformarli in celle da 10β.
- Digerire il primo segmento modello (quello a monte del gene reporter mVenus YFP) e il plasmide pKHR5 usando gli enzimi di restrizione selezionati al punto 1.3.3.
NOTA: Il digest sequenziale di pKHR5 è necessario a causa della stretta vicinanza dei siti di restrizione selezionati nell'MCS. - Per preparare il plasmide pKHR5 per il segmento del modello a monte, digerire 4 μg di pKHR5 (come da punto 2.2.4) con SalI e quindi purificare utilizzando un kit di purificazione PCR. Risospendere in 30 μL di ddH2O e usarlo come modello per la seconda reazione di digestione con XhoI. Purificare il prodotto utilizzando il Kit di Purificazione PCR.
- Preparare il primo segmento della dima digerendo 2 μg del segmento della dima (fase 2.3.2), 1 μL di XhoI, 1 μL di SalI, 2 μL di tampone appropriato e ddH2O a 20 μL per 1 ora a 37 °C e gelificare il prodotto.
- Collegare il segmento della dima a monte dal punto 2.3.5 al pKHR5 preparato utilizzando le condizioni di reazione descritte al punto 2.2.5. Trasformare il prodotto legato in cellule 10β competenti, amplificare e purificare utilizzando un miniprep (opzionale: creare uno stock di glicerolo di questo prodotto).
- Utilizzare il prodotto legato dal punto 2.3.6 (che contiene il primo segmento modello legato nel plasmide pKHR5 a monte del gene reporter mVenus YFP) e digerire per preparare il secondo segmento modello (a valle del reporter mVenus). Digerire 4 μg di prodotto legato (dal punto 2.3.6, come al punto 2.2.4) con BamHI, quindi purificare utilizzando un kit di purificazione PCR. Risospendere in 30 μL di ddH2O e utilizzarlo come modello per la seconda reazione digestiva con EcoRI. Purificare il prodotto utilizzando il Kit di Purificazione PCR.
- Preparare il secondo segmento di modello digerendo 2 μg del segmento della maschera (fase 2.3.2), 1 μL di BamHI, 1 μL di EcoRI, 2 μL di tampone appropriato e ddHda 2O a 20 μL per 1 ora a 37 °C e gelificare il prodotto.
- Collegare il segmento della dima a valle nel pKHR5 preparato (dal punto 2.3.7) utilizzando le condizioni di reazione descritte al punto 2.2.5. Trasforma il prodotto legato in cellule competenti, amplifica e purifica utilizzando un kit miniprep. Creare uno stock di glicerolo di questo prodotto finale, che contiene entrambi i segmenti modello legati su entrambi i lati del gene reporter mVenus YFP all'interno di pKHR5.
- Preparare il plasmide pKHR5 amplificando colture batteriche dal ceppo batterico DH5α disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali per i dettagli) nello stesso modo di MLM3613 sopra (passo 2.1.1).
- Preparare la miscela di microiniezione utilizzando l'mRNA Cas9, due sgRNA e il modello di reporter HDR esogeno.
- Mescolare 200 ng/μL di Cas9 mRNA, 100 ng/μL di ogni sgRNA e 200 ng/μL di modello di reporter HDR esogeno in 1x tampone di iniezione per un volume finale di 20 μL.
- Conservare la miscela di microiniezione a -20 °C ed eliminare la miscela non utilizzata dopo tre cicli di congelamento-scongelamento.
NOTA: Utilizzare 4 nL di questa miscela di microiniezione per la microiniezione nel sacco vitellino di ciascun embrione.
3. Allevamento di zebrafish e microiniezione di embrioni
NOTA: I protocolli per l'allevamento del pesce zebra e la microiniezione di embrioni unicellulari sono stati descritti in precedenza 29,30,31.
- Per la riproduzione, utilizzare zebrafish del ceppo AB e che hanno 6-12 mesi di età. Iniettare gli embrioni nella fase unicellulare a circa 40 minuti dopo la fecondazione (vedere Figura 5).
NOTA: Il sesso biologico degli embrioni iniettati non era noto; Il dimorfismo sessuale non è evidente fino a circa 3 mesi di età32.
4. Screening genico reporter di pesci zebra larvali modificati da CRISPR-Cas9
- Visualizza l'integrazione di YFP nelle larve di zebrafish dopo la microiniezione di componenti CRISPR-Cas9 per lo screening delle modifiche HDR di successo.
- In una capsula di Petri da 25 mm, anestetizzare 24 larve di zebrafish a 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) in 0,3% di tricaina metano solfonato (MS-222, tamponato a pH 7,0-7,4 con HEPES e idrossido di sodio) fino a quando non perdono il loro riflesso autoraddrizzante (tipicamente 1-2 min). Una volta anestetizzata, trasferire ogni larva in un singolo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
- Utilizzando un microscopio in grado di rilevare GFP / YFP, lo screening per la fluorescenza genica reporter negli occhi di ogni singola larva.
- Cattura immagini di ogni larva e documenta la presenza o l'assenza di espressione genica reporter.
5. Fenotipizzazione del pesce zebra larvale modificato da CRISPR-Cas9
- Dopo lo screening genico reporter, eseguire la fenotipizzazione cardiaca (frequenza cardiaca, dimensioni pericardiche, ECG) su ciascuna larva. Fenotipo un numero uguale di larve reporter gene-positive e -negative.
- Utilizzare una telecamera CCD (ad esempio, USB3 blackfly) e un software di registrazione video e immagini (ad esempio, Micromanager for ImageJ) per misurare la frequenza cardiaca e le dimensioni pericardiche mentre le larve sono anestetizzati.
- Per misurare la frequenza cardiaca, utilizzando Micromanager, creare una regione di interesse (ROI) in modo da catturare il cuore ed escludere altre strutture.
- Importare il video in ImageJ come sequenza di immagini e assicurarsi che il numero corretto di fotogrammi sia immesso in numero di immagini.
- Dopo aver aperto il file, utilizzare lo strumento di selezione del rettangolo per disegnare un ROI all'interno del cuore ma escludendo altri elementi in movimento, e salvare il ROI nel gestore ROI (analizzare | strumenti | Responsabile ROI).
- Fai clic su plug-in | installa e seleziona l'algoritmo della frequenza cardiaca per installare il codice nella cartella predefinita, quindi seleziona il plug-in nella parte inferiore della scheda plug-in. Registra i battiti al minuto (bpm) dalla finestra pop-up.
NOTA: gli algoritmi di rilevamento delle immagini sono stati scritti su misura per rilevare la frequenza cardiaca misurando le variazioni della densità dei singoli pixel associate alla contrazione sistolica ventricolare. Il codice può essere trovato su https://github.com/dpoburko/zFish_HR.
- Misura le dimensioni pericardiche utilizzando uno strumento gratuito come ImageJ per disegnare liberamente i ROI attorno al sacco pericardico e a uno degli occhi. Aprire l'immagine in ImageJ e utilizzare lo strumento di selezione dei poligoni per disegnare prima un ROI attorno al sacco pericardico, salvandolo nel gestore del ROI come nel passaggio 5.1.2 e ripetere per l'occhio. Seleziona questi due ROI nella gestione del ROI, quindi fai clic su Misura. Registra l'area per ciascuno per calcolare successivamente l'area del sacco pericardico normalizzata alla zona degli occhi in ciascuna larva.
- Dopo le misurazioni della frequenza cardiaca e del pericardio, registrare l'ECG dalle singole larve.
NOTA: I protocolli per la registrazione dell'ECG del pesce zebra sono stati descritti in precedenza33,34,35,36.
6. Genotipizzazione del pesce zebra larvale modificato con CRISPR-Cas9
- Dopo le analisi fenotipiche, condurre una genotipizzazione on- e potenziale off-target per confermare l'editing genico HDR accurato e preciso.
- Anestetizzare ogni larva da 3 dpf in 0,3% MS-222 e clip di coda per isolare il gDNA usando il metodo HOTShot37. Incubare ciascuna clip di coda asportata in 15 μL di 25 mM NaOH a 95 °C per 20 minuti. Quindi, neutralizzare con 1,5 μL di Tris-HCl e centrifugare a 13.800 x g per 30 s. Conservare il surnatante, che contiene gDNA estratto.
- Recuperare le larve nei media E3 e restituirle al sistema di alloggiamento se sono previsti ulteriori sviluppi o studi.
- Utilizzando il gDNA estratto come modello, eseguire il sequenziamento Sanger basato su PCR di siti on-target e potenziali off-target.
NOTA: Facoltativo: un approccio PCR nidificato può essere utile per alcune regioni geniche. - Assicurarsi che il disegno del primer on-target catturi il sito di mutazione e il sito di legame sgRNA più vicino. Progettare un primer di sequenziamento separato per rilevare la transizione dal braccio di omologia inserito e dal gene bersaglio per confermare l'integrazione nel gene di interesse. Progettare primer per sequenziare i primi tre potenziali siti off-target identificati nel passaggio 1.2.3.
NOTA: i programmi software di progettazione di guide spesso suggeriscono primer da utilizzare, ma potrebbe essere necessaria la personalizzazione per ottenere risultati ottimali. - Compila genotipizzazione on- e off-target, frequenza cardiaca, dimensioni pericardiche, fenotipizzazione ECG e dati genetici reporter identificabili per ciascun pesce zebra.
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Representative Results
L'uso di successo di questo approccio CRISPR di sostituzione dell'esone a due sgRNA è evidenziato dall'introduzione e dalla semplice rilevazione di una modifica precisa per ingegnerizzare la variante associata a LQTS, R56Q, nel gene zkcnh6a nel pesce zebra. La Figura 6 mostra una larva rappresentativa di 3 dpf iniettate allo stadio embrionale unicellulare con componenti CRISPR come descritto sopra. La Figura 6A mostra la presenza dell'espressione genica del reporter YFP mVenus nella lente dell'occhio come reporter positivo dell'integrazione di modelli di successo. La figura 6B,C mostra i cromatogrammi di sequenziamento Sanger ottenuti dal DNA genomico isolato da campioni di clip caudali di pesci wild-type e reporter gene-positivi, rispettivamente. I pesci positivi al gene reporter sono risultati avere la modifica precisa, da G ad A, che introduce la variante R56Q in zkcnh6a. La genotipizzazione ha mostrato una correlazione del 100% tra l'espressione genica reporter YFP e la presenza del preciso editing del gene R56Q, convalidando questo strumento di screening della fluorescenza.
La fenotipizzazione delle larve di zebrafish geneticamente modificate è stata condotta a 3 dpf. La Figura 7 mostra risultati rappresentativi di larve wild-type e modificate dal gene R56Q. La frequenza cardiaca è stata rilevata mediante acquisizione video come descritto sopra. Viene mostrato un esempio della misurazione delle dimensioni pericardiche come rapporto della zona dell'occhio (Figura 7A). La figura 7B traccia la frequenza cardiaca rispetto alle dimensioni pericardiche normalizzate, evidenziando una tendenza alla bradicardia con aumento dell'edema pericardico, che è associato a disturbi della ripolarizzazione cardiaca nel pesce zebra 8,38,39,40. La Figura 7C mostra un esempio rappresentativo di registrazioni ECG da larve di 3 dpf. Gli intervalli standard (QT, QRS) sono stati misurati da segnali ECG medi.
Figura 1: Integrazione del template HDR nel genoma del pesce zebra. Grigio scuro, omologia braccia; bersagli guida sgRNA verdi con mutazione silenziosa per prevenire il ritaglio di Cas9; grigio chiaro, esone target di interesse; linea rossa, mutazione puntiforme; giallo, mVenus YFP gene reporter sotto un promotore di cristallina α; Le linee tratteggiate indicano l'omologia. Qui, la modifica precisa mirata era R56Q nell'esone 2 del gene zkcnh6a . Abbreviazioni: HDR = riparazione diretta dall'omologia; sgRNA = RNA a guida singola; YFP = proteina fluorescente gialla; DSB = rottura a doppio filamento; WT = wild type. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Riepilogo dei passaggi per progettare modifiche precise nei geni del pesce zebra usando l'approccio a due sgRNA CRISPR-Cas9 (i numeri di passo del protocollo correlati sono indicati tra parentesi). Abbreviazioni: sgRNA = RNA a guida singola; YFP = proteina fluorescente gialla; gDNA = DNA genomico; ECG = elettrocardiogramma; dpf = giorni dopo la fecondazione; MS-222 = tricaina metano solfonato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Preparazione di frammenti di template esogeni e guide di sgRNA. (A) Digestione sequenziale e legatura di frammenti modello a monte e a valle della sequenza genica reporter mVenus YFP in pKHR5. (B) Ricottura di coppie di sgRNA complementari con sovrasbalzo di restrizione per la legatura in DR274. Abbreviazioni: sgRNA = RNA a guida singola; YFP = proteina fluorescente gialla. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Costruzione del modello HDR. Grigio scuro, omologia braccia; bersagli guida sgRNA verdi con mutazione silenziosa per prevenire il ritaglio di Cas9; grigio chiaro, esone target di interesse; linea rossa, mutazione puntiforme; giallo, mVenus YFP gene reporter sotto un promotore di cristallina α; linea blu scuro, aggiunti siti di restrizione. I due frammenti modello sono integrati nel donatore di plasmide pKHR5. Abbreviazioni: HDR = riparazione diretta dall'omologia; sgRNA = RNA a guida singola. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Microiniezione di embrioni di zebrafish unicellulari con componenti CRISPR-Cas9. Barra scala = 0,5 mm. Abbreviazioni: HDR = riparazione diretta dall'omologia; sgRNA = RNA a guida singola. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: La facile rilevazione della fluorescenza del gene reporter YFP di mVenus indica un'integrazione positiva del modello esogeno HDR nel gene bersaglio. (A) Esempio di espressione di mVenus YFP in un occhio di zebrafish (freccia) in una larva di zebrafish modificata. (B) Le modifiche riuscite sono confermate dal sequenziamento dei cromatogrammi (sinistra, WT; destra, modifica R56Q). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Analisi fenotipica delle conseguenze cardiache in 3 dpf zebrafish a seguito della precisa modifica di R56Q nel gene bersaglio zkcnh6a. (A) Rilevamento di immagini delle dimensioni pericardiche rispetto alle dimensioni dell'occhio utilizzando lo strumento poligono in ImageJ. I confini del sacco pericardico sono stati segnati dall'utente da un singolo fotogramma di registrazione basato sui cambiamenti di traslucenza e pigmentazione. Vengono mostrati esempi di dimensioni pericardiche normali e versamento pericardico. Barra della scala = 0,5 mm. (B) Correlazione tra dimensioni pericardiche (relative alla dimensione dell'occhio) e frequenza cardiaca, R2 = 0,33. (C) Esempio di registrazione ECG da un cuore di larva di zebrafish di 3 dpf (a sinistra) e complessi mediati (a destra). Frequenza cardiaca, 131 bpm; intervallo QTc corretto per la frequenza cardiaca, 460 ms. Abbreviazioni: dpf = giorni dopo la fecondazione; ECG = elettrocardiogramma. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'ingegneria di precisi edit genetici utilizzando CRISPR-Cas9 è messa in discussione dalle basse efficienze dei meccanismi HDR e dal loro rilevamento efficiente. Qui, viene descritto un approccio di sostituzione dell'esone a due sgRNA basato su CRISPR-Cas9 che produce modifiche precise nel pesce zebra con rilevamento visivo diretto di modifiche positive. L'efficacia di questo approccio è dimostrata generando modifiche precise nel gene zkcnh6a . Questo articolo mostra come la funzione cardiaca nelle larve di zebrafish geneticamente modificate può essere valutata utilizzando misure fenotipiche non invasive della frequenza cardiaca, delle dimensioni pericardiche e della morfologia dell'ECG. Questo approccio, dall'introduzione di un gene edit alla valutazione fenotipica, può essere completato dall'inizio alla fine entro circa 1 settimana.
I vantaggi dell'approccio di editing e fenotipizzazione di cui sopra sono la facilità di progettazione della modifica CRISPR, l'ampia applicabilità in più sistemi fisiologici, la capacità di inserire geni o frammenti di geni di grandi dimensioni e la capacità di tracciare longitudinalmente gli effetti delle varianti attraverso lo sviluppo e le generazioni. Il successo di modifiche precise in questo approccio può essere correlato alla combinazione delle grandi dimensioni del template (dovute all'inserto del gene reporter e ai bracci di omologia lunga), che ha dimostrato di aumentare l'efficienza delle modifiche nel pesce zebra14, e la strategia delle guide a due sgRNA, che è stata utilizzata efficacemente nelle modifiche indotte da TALEN8.
Un particolare punto di forza dell'approccio descritto è la capacità di inserire geni o frammenti di geni di grandi dimensioni. Questo può essere utile, ad esempio, per inserire ortologhi umani41, consentendo una caratterizzazione e un confronto tra ortologhi più traducibili clinicamente. In alternativa, potrebbero essere inseriti anche geni che codificano gli enzimi Cas, consentendo una linea di zebrafish con meccanismi di editing CRISPR in vivo , fornendo un sistema inducibile. Allo stesso modo, meccanismi CRISPR alternativi, come l'editing principale, potrebbero essere integrati e risultare in una linea di zebrafish che sono prontamente modificati in modo preciso ed efficiente.
Nonostante i vantaggi di questo approccio, ci sono alcune limitazioni. In primo luogo, solo un singolo gene e locus sono stati modificati, e sono necessari ulteriori test in altri siti o in altri geni per valutare quanto sia ampiamente applicabile questo approccio. A causa dei lunghi bracci di omologia richiesti, i costi di progettazione del modello sono più elevati; tuttavia, ciò può essere compensato da uno screening efficiente. Un'altra limitazione è che l'approccio di screening richiede capacità di rilevamento della fluorescenza. Tuttavia, i requisiti ottici sono relativamente bassi e possono essere costruiti su misura o acquistati commercialmente a un costo ragionevolmente basso. L'utilizzo di un approccio a due sgRNA aumenta il numero di potenziali eventi off-target; tuttavia, questo è probabilmente mitigato dalla minore probabilità che le due guide sgRNA ricavino entrambe in un modo che facilita l'incorporazione del modello per produrre l'espressione genica del reporter. Infine, l'uso dell'mRNA Cas9 può portare a mosaicismi poiché il Cas9 non è attivo fino a fasi di sviluppo successive. Questo potrebbe essere spiegato sequenziando particolari tipi di tessuto; Tuttavia, date le dimensioni delle larve di zebrafish, questo è tecnicamente impegnativo.
In sintesi, questo approccio di editing preciso a due sgRNA CRISPR-Cas9 nel pesce zebra consente la semplice rilevazione visiva di modifiche positive e può essere adattato per incorporare grandi geni di interesse in qualsiasi locus. In combinazione con le misure fenotipiche, ciò consente una piattaforma affidabile e ad alto rendimento per lo studio di varianti cardiache clinicamente rilevanti.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research Project (T.W.C.) e dalle sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery (T.W.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
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