Summary
Escherichia coli forårsager sepsis hos nyfødte, der indtager bakterierne omkring fødselstidspunktet. Processen involveret i E. coli's evne til at rejse fra den enteriske kanal til blodbanen er dårligt forstået. Denne in vitro-model vurderer E. coli-stammers evne til at rejse gennem tarmepitelcellerne.
Abstract
Nyfødte indtager moderens E. coli-stammer , der koloniserer deres tarmkanal omkring leveringstidspunktet. E. coli-stammer med evnen til at translokere over tarmen invaderer den nyfødtes blodbanen og forårsager livstruende bakteriæmi. Metoden, der præsenteres her, anvender polariserede intestinale epitelceller dyrket på semipermeable indsatser til at vurdere transcytose af neonatal E . coli-bakteriæmiisolater in vitro. Denne metode bruger den etablerede T84 tarmcellelinje, der har evnen til at vokse til sammenløb og danne tætte kryds og desmosomer. Efter at have nået sammenløb udvikler modne T84-monolag transepitelresistens (TEER), som kan kvantificeres ved hjælp af et voltmeter. TEER-værdierne er omvendt korreleret med den paracellulære permeabilitet af ekstracellulære komponenter, herunder bakterier, på tværs af tarmmonolaget. Den transcellulære passage af bakterier (transcytose) ændrer derimod ikke nødvendigvis TEER-målingerne. I denne model kvantificeres bakteriel passage over tarmens monolag i op til 6 timer efter infektion, og der foretages gentagne målinger af TEER for at overvåge den paracellulære permeabilitet. Derudover letter denne metode brugen af teknikker såsom immunfarvning til at studere de strukturelle ændringer i tætte kryds og andre celle-til-celle-adhæsionsproteiner under bakteriel transcytose over det polariserede epitel. Anvendelsen af denne model bidrager til karakteriseringen af de mekanismer, hvormed neonatal E. coli transcytose over tarmepitelet for at producere bakteriæmi.
Introduction
Escherichia coli er den mest almindelige årsag til tidlig sepsis hos nyfødte 1,2,3. Dødeligheden af neonatal E. coli bakteriæmi kan nå 40%, og meningitis er en mulig komplikation, der er forbundet med alvorlige neurodevelopmental handicap2. Indtagelse af moderens E. coli-stammer af den nyfødte kan producere neonatal bakteriæmi; Denne proces er blevet gentaget i dyremodel 2,4. Når de er indtaget, rejser patogene bakterier fra det neonatale tarmlumen over tarmbarrieren og kommer ind i blodbanen og forårsager septikæmi. Neonatal invasive E. coli-stammer, der producerer bakteriæmi, varierer i deres evne til at invadere intestinale epitelceller 1,5. Imidlertid er deres evne til at transcytose tarmepitelet efter invasion ikke blevet fuldstændigt karakteriseret.
Denne intestinale transcytosemodel er en nyttig in vitro-metode til at efterligne bakteriel passage over tarmepitelet. Det overordnede mål med de metoder, der præsenteres i dette manuskript, er at sammenligne neonatal E. coli-isolaters evne til at transcytose tarmepitelet. Modellen beskrevet her bruger T84-celler, som er udødeliggjorte humane tarmadenocarcinomceller 6,7. T84-celler dyrkes til sammenløb på en semipermeabel membran med to separate rum. Begrundelsen for at bruge denne teknik er, at disse tarmceller, som det sker in vivo, polariserer og udvikler modne tætte kryds 6,8. Den side, der er i kontakt med membranen, bliver basalsiden. Den modsatte side af cellerne bliver den apikale side, der ligner tarmlumenet, hvor indtagne patogener klæber og invaderer. Transwell-membranen er gennemtrængelig for bakterier, men de polariserede tarmceller danner tætte kryds, hvilket forringer bakteriel paracellulær bevægelse9. Således giver denne metode fordelen ved et kontrolleret in vitro-miljø, der anvender en human cellelinje til at studere processen med bakteriel transcytose, herunder den transcellulære rute. Mens der findes andre metoder til at undersøge transcytose af bakterier over tarmepitelet, giver transwell-metoden, der præsenteres her, større lethed og tilgængelighed. Der findes alternative teknikker, f.eks. ved hjælp af ex vivo-prøver, der er opstillet i Ussing-kammersystemer. De bruger dog vævsprøver, der muligvis ikke er let tilgængelige, især hvis forskningen har til hensigt at studere menneskelig fysiologi10. Intestinale organoider repræsenterer et andet eksempel på et in vitro-alternativ til undersøgelse af værtsbakterieinteraktioner11. Mens organoide monolag også kan bruges i transwellsystemet til at studere bakteriel transcytose, kræver de isolering og vækst af stamceller og anvendelse af specifikke vækstfaktorer til at inducere differentiering12. Således er deres anvendelse mere tidskrævende og forbundet med større omkostninger sammenlignet med transwell-metoden beskrevet i dette manuskript.
Vurderingen af bakteriel passage over tarmepitelet ved hjælp af dette in vitro transwell-system er blevet udført med succes for forskellige patogener. Disse undersøgelser har vist nytten af transwell-systemet ved hjælp af T84-celler til at karakterisere transcytose af bakterier over det polariserede tarmepitel13,14,15. Imidlertid er anvendelsen af denne transwell-metode til sammenligning af transcytoseevnen hos bakteriæmiproducerende neonatal E. coli-stammer ikke beskrevet detaljeret. Dette manuskript giver andre forskere en standard transwell-protokol, der er pålidelig og nem at bruge og ikke kræver ressourcer, der er for dyre.
For at sammenligne neonatal invasive E. coli-stammers evne til at transcytose tarmepitelet, kan den apikale side af tarmepitelmonolaget inficeres med et kendt antal bakterieceller. Efter inkubation kan mediet på epithelets basale side opsamles, og bakterierne kvantificeres for at bestemme mængden af bakteriel transcytose over tid. I dette manuskript anvendes de præsenterede metoder til at studere transcytoseevnen hos neonatal E. coli kliniske stammer, der er genoprettet fra nyfødte indlagt med bakteriæmi. Inklusionskriterierne for udvælgelsen af disse neonatale kliniske isolater til transcytosestudier er tidligere blevet offentliggjort 1,2,16. Når denne metode udføres ved anvendelse af forskellige E. coli-stammer, kan deres transcytoseevner sammenlignes. Gennem denne proces giver tarmtranscytosemodellen værdifulde data til at karakterisere virulensfaktorerne for E. coli, der bidrager til multistep-processen, der kulminerer i udviklingen af neonatal bakteriæmi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Udfør alle manipulationer af T84-celler, bakterier, plader og reagenser i et sikkerhedsskab til biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) for at undgå kontaminering. Brug separate områder og inkubatorer til alt arbejde, der involverer sterile T84-celler, inficerede T84-celler og E. coli. De kliniske E. coli-isolater, der blev testet med de metoder, der er beskrevet her, blev opnået efter retningslinjerne fra Institutional Review Board på vores institution 1,16.
1. Forberedelse af transcytoseindsatser med T84-celler (ca. 1-2 uger før eksperimentet)
- Dyrk American Type Culture Collection (ATCC) T84-celler i vævskulturmedium (TCM + antibiotika) bestående af Dulbeccos modificerede ørnemedium: Hams F-12-næringsblanding (1: 1, endelig koncentration: 50% hver), 5% føtalt bovint serum og 1% (100 U / ml) penicillin / streptomycin dobbelt antibiotikablanding. Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2.
BEMÆRK: En variation af denne mediumformulering uden penicillin/streptomycin (TCM uden antibiotika) anvendes til de senere trin (afsnit 2 og fremefter) i proceduren. Sørg for, at den korrekte formulering anvendes til hvert trin. - Ved at arbejde inde i et biosikkerhedsskab (BSC) sås T84-cellerne i polyethylenterephthalatmembrancellekulturtranswell-indsatser med 3 μm porer lavet til 24-brøndsplader. Inkluder transwell-indsatsreplikater for hver ønsket eksperimentel tilstand plus uinficerede kontroller for at overvåge for mulig forurening.
- I en 24-brøndplade designet til at holde transwell-indsatser skal du fylde det ønskede antal opsamlingsbrønde med 1 ml TCM + antibiotika.
- Anbring en transwellindsats i hvert hul.
- Frø disse indsatser med 1 x 105 T84 celler suspenderet i 500 μL TCM + antibiotika. Kvantificer antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer med trypanblå plet eller en automatiseret celletæller17.
- Inkubere transwellpladerne indeholdende frøindsatser under de samme forhold, som cellerne blev dyrket under.
- Kontroller med lysmikroskopi, at monolagene er begyndt at blive sammenflydende efter såning af indsatsen, ca. 48 timer efter såning.
- Hver 2. dag efter såning måles og registreres den transepiteliske elektriske modstand (TEER) ved hjælp af en epitelvolt / ohmmåler (EVOM) for at vurdere monolagets modenhed. Når indsatserne når en TEER på mindst 1.000 Ω·cm2, anses de for klar til analyse18.
BEMÆRK: Skærene tager typisk 7-10 dage at nå denne TEER efter såning. T84-cellerne viser 100% sammenløb under lysmikroskopi, når denne modstand er nået.- EVOM-sonden opbevares med elektroderne nedsænket i 0,15 M KCl, når den ikke er i brug.
- Før måling af TEER dekontamineres elektrodesonden ved at nedsænke den i 5 ml 70% ethanol i et 50 ml konisk rør i 10-15 minutter. Fjern sonden, ryst det overskydende ethanol af, og lad det lufttørre inde i BSC i 10 minutter. Bevar røret med ethanol.
- Test EVOM og sonden ved at placere den tørre dekontaminerede sonde i en steril brønd indeholdende 1 ml TCM + antibiotika med en steril indsats indeni indeholdende 500 μL TCM + antibiotika. Sørg for, at EVOM-aflæsningen er <200 Ω. Denne blindværdi registreres for at bruge den i de senere modstandsberegninger, der er beskrevet i trin 1.3.6.
- Fjern sonden fra røret med TCM + antibiotika. Opbevar dette rør til opbevaring af sonden under hele eksperimentet.
- Sænk forsigtigt sonden ned i det første skær med den lange elektrode i opsamlingsbrønden og den korte elektrode inde i indsatsen. Lad den lange elektrode røre bunden af opsamlingsbrønden, men skub ikke ned, da dette kan forstyrre epitelmonolaget.
- Gentag denne proces for at måle og registrere modstanden i Ohms (Ω) for hver indsats. Når du er færdig, dekontamineres sonden i ethanolen ved at nedsænke den i yderligere 10-15 minutter. Flyt derefter den dekontaminerede sonde tilbage til KCl-opløsningen til opbevaring. Den blindprøve, der opnås i trin 1.3.3, trækkes fra hver værdi opnået fra hver insert indeholdende T84-celler. Den resulterende modstand (Ω) for hvert skær multipliceres med arealet af bunden af hvert skær (cm 2) for at opnå den endelige TEER-måling (Ω· cm2).
- Når TEER når mindst 1.000 Ω· cm2, er epitelmonolaget modent og klar til infektionsassays.
- Når TEER modnes, skal du give cellerne frisk medium hver 1-2 dag.
- I en ny 24-brøndsplade tilsættes 1 ml TCM + antibiotika til en brønd for hver podet indsats, der fremstilles.
- Brug sterile tang til forsigtigt at overføre indsatserne til de nyligt genopfyldte brønde.
- Udskift mediet i indsatserne.
- Fjern det gamle medie fra skærene ved at vippe pladen og bruge en intern vakuumaspirator til forsigtigt at fjerne mediet med en pipettespids langs siden af indsatsen. Aspiratoren tillader regulering af sugning på lavt niveau for at forhindre forstyrrelse af cellerne. Lad ikke pipettespidsen røre bunden af indsatsen, da dette vil forstyrre det udviklende epitelmonolag.
- Tilsæt 500 μL TCM + antibiotika til indsatserne. Visualiser monolaget med lysmikroskopi for at kontrollere, at det forbliver intakt.
- Hver 1.-2. dag måles TEER på tværs af hvert skær som beskrevet ovenfor i trin 1.3.2-1.3.6.
2. Forberedelse af T84-cellerne 1 dag før eksperimentet ved hjælp af TCM uden antibiotika
- Mål og registrer TEER dagen før eksperimentet.
- Udskift TCM på samme måde som under den forudgående celleforberedelse og vedligeholdelse. TCM uden antibiotika anvendes dog i stedet som forberedelse til infektionen (1 ml i pladebrønden og 500 μL i indsatsen).
3. E. coli-kulturer (påbegyndt 1 dag før forsøget)
FORSIGTIG: Brug forholdsregler på biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2), når du arbejder med patogene kliniske E. coli-stammer.
- Tag et mærket 15 ml konisk rør med 5 ml steril lysogeni bouillon (LB), og brug en steril sløjfe til at inokulere bouillon med en koloni fra en bakteriestamme (E. coli). Gentag denne proces, og opret et kulturrør natten over for hver stamme, der skal testes.
- Natkulturen inkuberes med hætterne på rørene løsnet i en inkubatorryster (250 o / min, 37 ° C).
4. Forberedelse af E. coli-inokulum, epitelceller og materialer (om morgenen for eksperimentet)
BEMÆRK: Brug TCM uden antibiotika opvarmet til 37 °C fra dette tidspunkt.
- Der tilsættes 250 μL fra hver LB-kultur natten over til 25 ml TCM uden antibiotika i et 50 ml konisk rør (et pr. Individuel stamme). Hold hætterne på rørene løsnet. Disse nye kulturrør anbringes i rysteapparatet ved de samme indstillinger (250 o/min, 37 °C) i nøjagtig 2 timer. Udfør de resterende undertrin, mens du venter.
- Mål TEER på tværs af hver indsats som beskrevet i trin 1.3.2-1.3.6. Optag disse som TEER'erne på tidspunktet (t) = 0 timer.
- Indsatserne flyttes til brønde i en ny plade, og mediet skiftes ved hjælp af den teknik, der er beskrevet i trin 1.4.3. Denne gang skal du dog fylde de nye opsamlingsbrønde med 500 μL TCM uden antibiotika og fylde indsatserne med 400 μL TCM uden antibiotika. Hold indsatserne inde i vævskulturinkubatoren indtil infektionstidspunktet.
- Angiv et tilstrækkeligt antal firkantede LB-agarplader til opvarmning til stuetemperatur (RT) til senere plettering og bakteriel kvantificering.
5. Inokulering af cellerne (start af forsøget)
- Efter præcis 2 timer fjernes morgenens bakteriekulturer fra shakeren, og centrifugeres i 10 minutter (1.900 x g, 4 °C).
BEMÆRK: For alle de følgende trin skal du holde alle bakteriesuspensioner på is for at minimere væksten. - Resuspend bakteriepellet i TCM uden antibiotika. Brug et spektrofotometer til at justere den optiske densitet (OD) til 0,7-0,9, og fortynd yderligere med TCM uden antibiotika til en koncentration på 1 x 106 kolonidannende enheder (CFU) / ml (ca. 1:100 fortynding). Brug denne bakteriesuspension til at inficere hvert skær med 1 x 105 CFU pr. 100 μL volumen.
- Transwellpladen mærkes, og hvert skær inficeres med 100 μL OD-justeret podemateriale (i alt 1 x 105 CFU pr. indsats). Analysen er nu begyndt. Bemærk tiden, og registrer den som t = 0 h.
- Podebakteriesuspensionen opvarmes for at kvantificere CFU/ml ved hjælp af sporfortyndingsmetoden, idet 10 μL alikvoter forsynes på kvadratiske LB-agarplader19.
6. Kvantificering af transcytose
- Hvert 30. minut efter podning fyldes nye huller med 500 μL TCM uden antibiotika. Overfør indsatserne til disse nye brønde ved hjælp af et andet sæt sterile tang til hver anden bakteriestamme.
- Saml mediet fra den brugte opsamlingsbrønd for hver indsats i separate mærkede rør. Placer disse rør på is. Returner transwellpladerne til inkubatoren mellem tidspunkterne.
- For hver indsats kombineres de indsamlede medier fra t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h og t = 2 h og hvirvel kort. De opsamlede medier anbringes på LB-agarplader ved hjælp af sporfortyndingsmetoden til kvantificering af mængden af bakterier, der transcytoseres i de første 2 timer af eksperimentet.
BEMÆRK: At hente bakterierne hvert 30. minut og holde dem på is sikrer, at bakterievæksten i opsamlingsbrøndene minimeres, og målinger udføres på overvejende transcytoserede bakterier. - De mærkede LB-agarplader til sporfortynding anbringes i bakterieinkubatoren ved 37 °C uden supplerende CO2, og T84-transwellpladen returneres til vævskulturinkubatoren.
- Ved t = 4 h gentages trin 6.3 ved at kombinere de indsamlede medier fra t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h og t = 4 h.
- Ved t = 6 h gentages trin 6.3 ved at kombinere de indsamlede medier fra t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h og t = 6 h. Derudover skal mediet fra kontrolhullerne ved t = 6 timer plades.
7. Eksperimentets afslutning
- Mål og registrer TEER i slutningen af eksperimentet, t = 6 timer. Fremgangsmåden beskrevet i trin 1.3.2-1.3.6.
- Dekontaminer sonden ved at nedsænke den i 70% ethanol i 10-15 min. Kassér indsatserne, eller gem/behandl dem til yderligere applikationer, hvis det ønskes. Lad LB-agarpladerne inkubere natten over, og desinficer og/eller bortskaf alle andre brugte materialer på en sikker måde.
- Efter inkubation natten over tælles bakteriekolonierne manuelt på sporfortyndings-LB-pladerne for at bestemme podemængden og mængden af E. coli-transcytose . Sørg for, at kontrolpladerne ikke viser bakterievækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: T84 TEER over tid. Efterhånden som T84-cellelaget modnes på indsatsen, øges monolagets elektriske modstand. Ved en TEER på mindst 1.000 Ω·cm2 er cellelaget tilstrækkeligt udviklet til at mindske den paracellulære bakterietransport og muliggøre måling af primært transcellulær bakterietransit. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Under spredningen af de sterile T84-celler, der er beskrevet i afsnit 1, stiger TEER'erne på tværs af T84-monolagene kontinuerligt over tid og overstiger 1.000 Ω·cm 2 ca. 7 dage efter såning (se figur 1). Selvom epitelcellepolariseringen og modningen af TEER er mere robust med T84-celler end med andre tarmceller, såsom Caco-2, kan der stadig kræves en vis fejlfinding6. TEER af et skær bør ikke falde dramatisk mellem målingerne. Et sådant fald i TEER kunne indikere en mekanisk forstyrrelse af epitelmonolaget. Man bør sikre, at aspiratorens spids aldrig rører bunden af cellekulturindsatsen under medieændringen. Hvis denne type skade mistænkes, kan den visualiseres ved lysmikroskopi som fravær af epitelceller nær aspirationsstedet. Ud over skader fra håndtering kan et fald i TEER indikere forurening.
Figur 2: Transcytose af neonatale E. coli-isolater over tid. Efter infektion af T84-indsatserne kvantificeres neonatale E. coli kliniske isolater, der med succes når indsamlingsbrønden, ved hjælp af sporfortyndingsmetoden. Forskellige E. coli-stammer kan sammenlignes med hensyn til deres evne til at transcytose tarmepitelet. Den ikke-patogene E. coli DH5 alpha blev inkluderet som komparator. Plottene viser de gennemsnitlige CFU'er og standardfejl på hvert tidspunkt. Sammenligningerne af de gennemsnitlige transcytoseværdier blev udført med ensidede t-tests, som viste signifikante forskelle mellem de neonatale E. coli-isolater #1 versus #2 ved 2 timer (*p < 0,05), 4 timer (**p < 0,04) og 6 timer (***p < 0,04) efter infektion. I modsætning hertil gennemgik den ikke-patogene E. coli-stamme DH5 alfa minimal transcytose, som vist i det tredje plot. Klik her for at se en større version af denne figur.
Den kvantificerede transcytose kan repræsenteres som vist i figur 2. I dette eksempel blev eksperimenterne udført ved hjælp af tre indsatser, hver inficeret med to forskellige neonatale invasive E. coli-isolater. En ikke-patogen stamme, DH5 alfa, blev også testet til sammenligning. To sterile kontrolindsatser blev også inkluderet (intet plot er vist, da ingen bakterier blev isoleret). Dataene fra denne procedure er nyttige til at beskrive evnen hos en enkelt E. coli-stamme til at transcytose tarmepitelet. Dataene kan også give mulighed for en sammenligning af transcytoseevnen hos forskellige stammer (se diskussionsafsnittet for yderligere anvendelser).
Figur 3: TEER umiddelbart før infektion og 6 timer efter infektion. TEER af indsatserne øges typisk efter infektion med neonatal E. coli bakteriæmi-producerende stammer2. De inficerede skær viser en større stigning i TEER end de uinficerede kontrolindsatser. TEER var signifikant større i T84 monolag efter 6 timers infektion med neonatal E. coli stamme #1 (*p < 0,01) og E. coli stamme #2 (**p < 0,03), beregnet ved t-test. TEER i de ikke-inficerede kontrol T84 monolag steg også, men forskellen mellem værdierne før og efter infektion var ikke statistisk signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 viser typiske TEER-resultater før og efter infektion med to kliniske neonatal E . coli-isolater med forskellige evner til at transcytose intestinale epitelceller. Hastigheden og mængden af transcytose varierer mellem stammer, som vist i figur 2, men TEER øges signifikant efter infektion med begge patogene stammer.
Resultaterne kan ændres i tilfælde af kontaminering i dette forsøg. De anvendte neonatale E. coli-stammer forårsagede ikke tilstrækkelig skade på epitelmonolaget til at producere et fald i TEER, men bakterierne var i stand til at transcytose. Det er plausibelt, at en kontaminerende organisme, hvis den er til stede, kan forårsage skade på tarmcellerne og et efterfølgende fald i TEER. De sterile kontrolindsatser tjener til at hjælpe med at identificere en sådan mulig kontaminering. Vævskulturmediet, der anvendes i denne procedure, indeholder den phenolrøde pH-indikator. Generelt fremstår mediet en klar lyserød, når den er steril eller inficeret med et lille inokulum. Med betydelig vækst eller forurening kan mediet blive grumset, gult eller ildelugtende. Før infektion ser mediet i alle T84-indsatser normalt klar-pink ud.
Efter inkubation natten over er det sidste sted at kontrollere for forurening på LB-agarpladerne. Kontrolpladerne må ikke vise nogen vækst. Pladerne fremstillet af opsamlingsbrøndene af E. coli-inficerede indsatser skal indeholde homogene, runde, gule E. coli-kolonier. For at minimere risikoen for kontaminering skal alt arbejde udføres i biosikkerhedsskabe. Separate skabe og inkubatorer bør anvendes til steril vævsdyrkning, E. coli-inficeret vævsdyrkning og bakteriel manipulation. Arbejdsområderne skal holdes rene, og der skal anvendes en steril teknik hele vejen igennem.
Figur 4: Diagrammatisk gengivelse af transwellsystemet og relevante tarmcellestrukturer. A) Snitbillede af transwell-indsatsen (blåt) De lodrette linjer i bunden af indsatsen angiver de permeable porer. De polariserede intestinale epitelceller danner et monolag i bunden af indsatsen. Vævskulturmediet er vist i lyserødt med en tobenet EVOM-sonde nedsænket i den. Sondetrådene på den modsatte side er tilsluttet EVOM-apparatet (ikke vist). (B) Forenklet diagram over de tætte forbindelseskomponenter i intestinale epitelceller. De lodrette pile repræsenterer mulige ruter for bakteriel passage fra den apikale til den basolaterale side af det polariserede intestinale epitelmonolag. Forkortelser: ZO = zona occludens proteiner; JAM = junctional adhæsionsmolekyler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Apikal vækst af neonatal E. coli-isolater over tid. Målinger af E. coli i supernatanter, der ligger over T84-celler i transwell-indsatser, kan udføres som et valgfrit, yderligere endepunkt. Figuren viser, at den apikale vækst af begge patogene E. coli-stammer , der blev testet for transcytose, ikke var signifikant forskellig over tid. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelser. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode er afledt af teknikker, der anvendes i gastroenterologi og infektionssygdomme20. In vitro-modeller af tarmepitelbarrieren er blevet brugt til at belyse de mekanismer, hvormed luminalindholdet interagerer med denne relevante komponent af medfødt immunitet 6,8. Værtspatogeninteraktionerne mellem invasiv neonatal E. coli er også blevet karakteriseret separat gennem genetisk analyse, undersøgelser af antimikrobiel resistens og immunologiske teknikker 1,5,16,21. Imidlertid er der lidt kendt om de molekylære mekanismer, der understøtter E. coli neonatale isolaters evne til at komme ind i blodbanen gennem tarmen3.
Transcytoseteknikken demonstreret heri giver mulighed for en mere detaljeret karakterisering af de neonatale E. coli invasive stammer, der producerer septikæmi efter enteral erhvervelse. Neonatal bakteriæmi er en flertrinsproces, og transcytose er et af de relevante trin. Sammenlignet med invasionsmodeller giver denne transcytosemetode yderligere information om de mekanismer, der er involveret i patogenesen af bakteriæmi. I nogle tilfælde invaderer patogen E. coli tyndtarmen uden at nå blodbanen, hvilket begrænser infektionen til at forårsage lokaliseret sygdom22. Således kan bakteriernes evne til simpelthen at invadere tarmepitelet muligvis ikke afspejle deres evne til fuldstændigt at passere gennem epitelbarrieren. Denne model kan bruges til at studere processen med bakteriel passage over tarmepitelet gennem de transcellulære eller paracellulære ruter, især hvis yderligere teknikker såsom elektronmikroskopi er inkorporeret20. Sammenlignet med in vivo dyremodeller er denne in vitro-model mere effektiv og giver mulighed for bedre kontrol af flere potentielle variabler. Desuden bidrager det til dyrevelfærd ved at udgøre et alternativ til in vivo-forsøg .
På trods af disse fordele har dette eksperiment stadig sine begrænsninger. For det første tager dette assay ikke højde for forskelle i bakterievækst på den apikale side af epitelet under inkubation. Sådanne vækstforskelle kan påvirke mængden af transcytose for hver stamme. Brugere kan vælge at måle apikal vækst for en mere omfattende karakterisering af resultaterne opnået med denne model. Et eksempel på den apikale vækst af de to E. coli-isolater, der blev anvendt til transcytoseforsøgene i de metoder, der præsenteres i dette manuskript, er vist i supplerende figur 1. Derudover, selvom denne model med rimelighed genskaber tarmepitelmonolaget, repræsenterer den ikke fuldstændigt alle komponenterne i tarmbarrieren, der beskytter blodbanen mod indtagne patogener. Ikke desto mindre kan nogle egenskaber ved tarmepitelet studeres med denne model. For eksempel udskiller T84-celler chlorid og producerer mucin23. Invasion af diarréproducerende E. coli er forbundet med øget chloridsekretion i T84-celler og et signifikant fald i TEER ud over 6 timer efter infektion24. Det er muligt, at invasion af bakteriæmiproducerende E. coli-stammer også øger chloridsekretionen i denne model, og at et fald i TEER kan forekomme efter 6 timers infektion. Denne model kan tilpasses til undersøgelser af forholdet mellem iontransport og bakterieinvasion, hvis andre forskere ønsker det. Mucin er en fysisk barriere, der beskytter epitelet mod patogener. Infektion med andre E. coli-stammer nedsætter mucinekspression med T84-celler25. Mucins rolle i patogenesen af neonatal E. coli transcytose på tværs af tarmepitelet kan også studeres med denne model. En anden anvendelse af denne model kunne være at studere de cytotoksiske virkninger af bakterielle cyclomoduliner og deres mulige rolle i processen med transcytose af neonatale E. coli-stammer. For eksempel er cytotoksisk nekrotiserende faktor-1 (CNF-1), som produceres af nogle patogene E. coli-stammer, målrettet mod Rho GTPaser, som er afgørende for regulering af tæt forbindelsesfunktion og apoptose af inficerede eukaryote celler26. Denne transwell-model kan tilpasses for bedre at forstå de mekanismer, hvormed disse cytotoksiner påvirker tarmepitelet27. Når man bruger denne model til at studere interaktionen mellem neonatal E. coli-stammer med tarmepitelet, er det vigtigt at overveje, at T84-cellerne, der bruges til at modellere tarmepitelet, stammer fra en lungemetastase af colon adenocarcinom hos en voksen6. Mens undersøgelser i T84-celler har reproduceret specifikke virkninger på tarmpermeabilitet, der har oversat til lignende virkninger i humane nyfødte og neonatale dyretarmceller28,29, kan føtal og neonatal tarmepitel opføre sig forskelligt i nærvær af invasiv E. coli.
Det kan være nødvendigt med en vis fejlfinding for at optimere denne model og kvaliteten af de data, den leverer. Anvendelsen af sterile kontrolindsatser diskuteres detaljeret i afsnittet om repræsentative resultater. Andre ikke-invasive E. coli-stammer kan også indgå som negative/minimale transcykutosekontroller. Desuden kan en anden cellelinje, såsom Caco-2, bruges til at vurdere de neonatale E. coli-stammers evne til transcytose polariseret tarmepitel. Invasionen og transcytosen af E. coli har vist sig at være større for T84-celler sammenlignet med Caco-2-celler30. Derfor skal disse forskelle overvejes, når denne model bruges til at evaluere bakteriel transcytose med disse og andre epitelceller, der polariserer og danner tætte kryds. At foretage TEER-målinger af hver enkelt transwell-indsats tager flere sekunder, og når flere stammer testes, skal den ekstra operatørtid tages i betragtning. Der udvikles fortsat mere effektive metoder til overvågning af TEER i transwellsystemer. Disse nyere enheder giver mulighed for overvågning af TEER samtidigt i flere transwell-skær og i realtid31. Forskere, der overvejer disse muligheder, skal beslutte, om den sparede tid potentielt kan opveje den øgede pris på disse nyere enheder sammenlignet med de enkeltelektrodemålinger, der er beskrevet heri.
På trods af nogle mulige udfordringer giver dette assay forskere mulighed for at studere specifikke mekanismer involveret i patogenesen af E. coli-bakteriæmi ud over blot mængden af transcytose . Når det kombineres med molekylære mikrobiologiske teknikker, kan denne proces bruges til at lokalisere virkningerne af individuelle gener på E. coli's evne til at transcytose tarmepitelet, som det er forsøgt i dyremodeller32. Denne model kan også modificeres ved immuncelle-co-dyrkning eller tilsætning af cytokiner, vækstfaktorer og farmaceutiske interventioner for at simulere mere komplekse immun- og farmakodynamiske reaktioner33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et Sarah Morrison-studiestipendium udstedt af University of Missouri-Kansas City School of Medicine til AI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
- Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
- Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
- Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
- Schoultz, I., Keita, Å The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
- Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
- Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
- Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
- Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
- Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
- Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
- McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
- Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
- Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
- El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
- Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
- Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
- Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6'-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
- Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
- Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
- McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
- Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).
