Summary
Escherichia coli forårsaker sepsis hos nyfødte som inntar bakteriene rundt fødselen. Prosessen involvert i E. colis evne til å reise fra enterisk kanal til blodet er dårlig forstått. Denne in vitro-modellen vurderer evnen til E. coli-stammer til å reise gjennom tarmepitelcellene.
Abstract
Nyfødte inntar mors E. coli-stammer som koloniserer tarmkanalen rundt leveringstidspunktet. E. coli-stammer med evnen til å translokere over tarmen invaderer den nyfødte blodet, forårsaker livstruende bakteriemi. Metodikken som presenteres her benytter polariserte tarmepitelceller dyrket på semipermeable innsatser for å vurdere transcytose av neonatale E. coli-bakteriemiisolater in vitro. Denne metoden bruker den etablerte T84 tarmcellelinjen som har evnen til å vokse til sammenløp og danne tette kryss og desmosomer. Etter å ha nådd sammenløp utvikler modne T84 monolag transepitelresistens (TEER), som kan kvantifiseres ved hjelp av et voltmeter. TEER-verdiene er omvendt korrelert med den paracellulære permeabiliteten til ekstracellulære komponenter, inkludert bakterier, over tarmmonolaget. Den transcellulære passasjen av bakterier (transcytose) endrer derimot ikke nødvendigvis TEER-målingene. I denne modellen kvantifiseres bakteriell passasje over tarmmonolaget i opptil 6 timer etter infeksjon, og gjentatte målinger av TEER gjøres for å overvåke den paracellulære permeabiliteten. I tillegg letter denne metoden bruken av teknikker som immunostaining for å studere strukturelle endringer i tette kryss og andre celle-til-celle-adhesjonsproteiner under bakteriell transcytose over det polariserte epitelet. Bruken av denne modellen bidrar til karakterisering av mekanismene der neonatal E. coli transcytose over tarmepitelet for å produsere bakteriemi.
Introduction
Escherichia coli er den vanligste årsaken til tidlig begynnende sepsis hos nyfødte 1,2,3. Dødeligheten av neonatal E. coli-bakteriemi kan nå 40%, og meningitt er en mulig komplikasjon som er forbundet med alvorlige nevrodevelopmental funksjonshemninger2. Inntak av mors E. coli-stammer av nyfødte kan produsere neonatal bakteriemi; Denne prosessen har blitt replikert i dyremodeller 2,4. Når de er inntatt, reiser patogene bakterier fra neonatal tarmlumen over tarmbarrieren og går inn i blodet og forårsaker septikemi. Neonatale invasive E. coli-stammer som produserer bakteriemi varierer i deres evne til å invadere tarmepitelceller 1,5. Imidlertid har deres evne til å transcytose tarmepitelet etter invasjon ikke blitt fullstendig karakterisert.
Denne intestinale transcytosemodellen er en nyttig in vitro-metode for å etterligne bakteriell passasje over tarmepitelet. Det overordnede målet med metodene som presenteres i dette manuskriptet er å sammenligne neonatale E. coli-isolaters evne til å transcytose tarmepitelet. Modellen beskrevet her benytter T84-celler, som er udødeliggjorte humane intestinale adenokarsinomceller 6,7. T84-celler dyrkes for å konfluens på en semipermeabel membran med to separate rom. Begrunnelsen for å bruke denne teknikken er at, som det skjer in vivo, polariserer disse tarmcellene og utvikler modne tette kryss 6,8. Siden i kontakt med membranen blir basalsiden. Den motsatte siden av cellene blir den apikale siden, som ligner tarmlumen hvor inntatte patogener holder seg og invaderer. Transwellmembranen er gjennomtrengelig for bakterier, men de polariserte tarmcellene danner tette kryss, noe som svekker bakteriell paracellulær bevegelse9. Dermed gir denne metoden fordelen av et kontrollert in vitro-miljø som bruker en human cellelinje for å studere prosessen med bakteriell transcytose, inkludert den transcellulære ruten. Mens det finnes andre metoder for å undersøke transcytose av bakterier over tarmepitelet, gir transwell-metoden som presenteres her større letthet og tilgjengelighet. Alternative teknikker, for eksempel de som bruker ex vivo-prøver satt opp i Ussing-kammersystemer, er tilgjengelige. Imidlertid bruker de vevsprøver som kanskje ikke er lett tilgjengelige, spesielt hvis forskningen har til hensikt å studere menneskelig fysiologi10. Tarmorganoider representerer et annet eksempel på et in vitro-alternativ for å studere verts-bakterieinteraksjoner11. Mens organoide monolag også kan brukes i transwell-systemet for å studere bakteriell transcytose, krever de isolasjon og vekst av stamceller og bruk av spesifikke vekstfaktorer for å indusere differensiering12. Dermed er bruken av dem mer tidkrevende og forbundet med større kostnader sammenlignet med transwell-metoden beskrevet i dette manuskriptet.
Vurderingen av bakteriell passasje over tarmepitelet ved bruk av dette in vitro transwell-systemet har blitt utført for forskjellige patogener. Disse studiene har vist nytten av transwell-systemet ved bruk av T84-celler for å karakterisere transcytose av bakterier over det polariserte tarmepitelet13,14,15. Anvendelsen av denne transwellmetoden for å sammenligne transcytoseevnen til bakteriemiproduserende neonatale E. coli-stammer er imidlertid ikke beskrevet i detalj. Dette manuskriptet gir andre forskere en standard transwellprotokoll som er pålitelig og enkel å bruke og ikke krever ressurser som er for dyre.
For å sammenligne evnen til neonatale invasive E. coli-stammer til å transcytose tarmepitelet, kan den apikale siden av tarmepitelmonolaget infiseres med et kjent antall bakterieceller. Etter inkubasjon kan mediet på basalsiden av epitelet samles og bakteriene kvantifiseres for å bestemme mengden bakteriell transcytose over tid. I dette manuskriptet brukes metodene som presenteres for å studere transcytoseevnen til neonatale E. coli kliniske stammer gjenopprettet fra nyfødte innlagt på sykehus med bakteriemi. Inklusjonskriteriene for utvelgelse av disse neonatale kliniske isolatene for transcytosestudier er tidligere publisert 1,2,16. Når denne metoden utføres ved bruk av forskjellige E. coli-stammer, kan deres transcytose evner sammenlignes. Gjennom denne prosessen gir tarmtranscytosemodellen verdifulle data for å karakterisere virulensfaktorene til E. coli som bidrar til flertrinnsprosessen som kulminerer i utviklingen av neonatal bakteriemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Utfør alle manipulasjoner av T84-celler, bakterier, plater og reagenser i et sikkerhetsskap på biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) for å unngå forurensning. Bruk separate områder og inkubatorer for alt arbeid som involverer sterile T84-celler, infiserte T84-celler og E. coli. De kliniske E. coli-isolatene som ble testet med metodene beskrevet her, ble oppnådd i henhold til retningslinjene fra Institutional Review Board ved vår institusjon 1,16.
1. Forberedelse av transcytoseinnlegg med T84-celler (ca. 1-2 uker før forsøket)
- Grow American Type Culture Collection (ATCC) T84-celler i vevskulturmedium (TCM + antibiotika) bestående av Dulbeccos modifiserte Eagle Medium: Hams F-12 næringsblanding (1: 1, endelig konsentrasjon: 50% hver), 5% føtalt bovint serum og 1% (100 U / ml) penicillin / streptomycin dobbel antibiotikablanding. Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2.
MERK: En variant av denne mediumformuleringen uten penicillin/streptomycin (TCM m/o antibiotika) brukes for de senere trinnene (avsnitt 2 og videre) i prosedyren. Forsikre deg om at riktig formulering brukes for hvert trinn. - Arbeider inne i et biosikkerhetsskap (BSC), frø T84-cellene til polyetylentereftalat membrancellekulturtranswell innsatser med 3 μm porer laget for 24-brønnplater. Inkluder transwell insert replicates for hver ønsket eksperimentell tilstand pluss uinfiserte kontroller for å overvåke mulig forurensning.
- I en 24-brønns plate designet for å holde transwell innsatser, fyll ønsket antall samlebrønner med 1 ml TCM + antibiotika.
- I hver brønn plasserer du en transwell-innsats.
- Frø disse innsatsene med 1 x 105 T84 celler suspendert i 500 μL TCM + antibiotika. Kvantifiser antall celler ved hjelp av et hemocytometer med trypanblå flekk eller en automatisert celleteller17.
- Inkuber transwellplatene som inneholder seedede innsatser under de samme forholdene som cellene ble dyrket i.
- Kontroller med lysmikroskopi at monolagene har begynt å bli sammenflytende etter sådd av innsatsen, ca. 48 timer etter sådd.
- Hver 2. dag etter sådd, måle og registrere transepitelial elektrisk motstand (TEER) ved hjelp av en epithelial volt / ohm meter (EVOM) for å vurdere modenheten til monolaget. Når innsatsene når en TEER på minst 1000 Ω·cm2, anses de som klare for analysen18.
MERK: Innsatsene tar vanligvis 7-10 dager å nå denne TEER etter sådd. T84-cellene vil vise 100% sammenløp under lysmikroskopi når denne motstanden er nådd.- Oppbevar EVOM-sonden med elektrodene nedsenket i 0,15 M KCl når den ikke er i bruk.
- Før måling av TEER, dekontaminerer elektrodesonden ved å senke den i 5 ml 70% etanol i et 50 ml konisk rør i 10-15 minutter. Fjern sonden, rist av overflødig etanol, og la den lufttørke inne i BSC i 10 minutter. Behold røret av etanol.
- Test EVOM og sonden ved å plassere den tørre dekontaminerte sonden i en steril brønn som inneholder 1 ml TCM + antibiotika med en steril innsats inne som inneholder 500 μL TCM + antibiotika. Sørg for at EVOM-avlesningen er <200 Ω. Registrer denne tomme verdien for å bruke den i de senere motstandsberegningene som er beskrevet i trinn 1.3.6.
- Fjern sonden fra røret av TCM + antibiotika. Behold dette røret for lagring av sonden gjennom hele forsøket.
- Senk sonden forsiktig ned i det første innlegget med den lange elektroden i oppsamlingsbrønnen og den korte elektroden inne i innsatsen. La den lange elektroden berøre bunnen av oppsamlingsbrønnen, men ikke skyv ned, da dette kan forstyrre epitelmonolaget.
- Gjenta denne prosessen for å måle og registrere motstanden i Ohms (Ω) for hver innsats. Når du er ferdig, dekontaminerer sonden i etanolen ved å senke den i ytterligere 10-15 minutter. Flytt deretter den dekontaminerte sonden tilbake til KCl-løsningen for lagring. Trekk den tomme motstanden oppnådd i trinn 1.3.3 fra hver verdi oppnådd fra hver innsats som inneholder T84-celler. Multipliser den resulterende motstanden (Ω) for hver innsats med arealet av bunnen av hver innsats (cm 2) for å oppnå den endelige TEER-målingen (Ω · cm2).
- Når TEER når minst 1000 Ω · cm2, er epitelmonolaget modent og klar for infeksjonsanalyser.
- Etter hvert som TEER modnes, gi cellene friskt medium hver 1-2 dag.
- I en ny 24-brønns plate, legg til 1 ml TCM + antibiotika til en brønn for hver frøede innsats som tilberedes.
- Bruk steril tang, overfør innsatsene forsiktig til de nylig etterfylte brønnene.
- Bytt ut mediet i innleggene.
- Fjern det gamle mediet fra innsatsene ved å vippe platen og bruke en intern vakuumsuger til å fjerne mediet forsiktig med en pipettespiss langs siden av innsatsen. Aspiratoren tillater regulering av sug på lavt nivå for å forhindre forstyrrelse av cellene. Ikke la pipettespissen berøre bunnen av innsatsen, da dette vil forstyrre det utviklende epitelmonolaget.
- Tilsett 500 μL TCM + antibiotika til innsatsene. Visualiser monolaget med lysmikroskopi for å bekrefte at det forblir intakt.
- Hver 1-2 dag måler du TEER på tvers av hvert innlegg som beskrevet ovenfor i trinn 1.3.2-1.3.6.
2. Forbereder T84-cellene 1 dag før forsøket ved bruk av TCM uten antibiotika
- Mål og registrer TEER dagen før eksperimentet.
- Erstatt TCM på samme måte som under tidligere cellepreparering og vedlikehold. Imidlertid brukes TCM w / o antibiotika i stedet for forberedelse til infeksjonen (1 ml i platebrønnen og 500 μL i innsatsen).
3. E. coli kulturer (startet 1 dag før forsøket)
FORSIKTIG: Bruk forholdsregler for biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) ved arbeid med patogene kliniske E. coli-stammer.
- Ta et merket 15 ml konisk rør med 5 ml steril lysogenibuljong (LB), og bruk en steril sløyfe for å inokulere buljongen med en koloni fra en bakteriestamme (E. coli). Gjenta denne prosessen, og lag ett kulturrør over natten for hver stamme som skal testes.
- Inkuber nattkulturen, med hettene på rørene løsnet, i en inkubatorshaker (250 o / min, 37 ° C).
4. Forbereder E. coli inoculum, epitelceller og materialer (på morgenen av forsøket)
MERK: Bruk TCM uten antibiotika oppvarmet opp til 37 °C fra dette tidspunktet.
- Tilsett 250 μL fra hver nattlige LB-kultur til 25 ml TCM uten antibiotika i et 50 ml konisk rør (en per individuell stamme). Hold hettene på rørene løsnet. Plasser disse nye kulturrørene i shakeren ved de samme innstillingene (250 o / min, 37 ° C) i nøyaktig 2 timer. Utfør de resterende undertrinnene mens du venter.
- Mål TEER på tvers av hver innsats, som beskrevet i trinn 1.3.2-1.3.6. Registrer disse som TEERs på tidspunktet (t) = 0 h.
- Flytt innsatsene til brønner i en ny plate, og bytt medium ved hjelp av teknikken beskrevet i trinn 1.4.3. Men denne gangen fyller du de nye oppsamlingsbrønnene med 500 μL TCM m/o antibiotika, og fyller innsatsene med 400 μL TCM m/o antibiotika. Hold innsatsene inne i vevskulturinkubatoren til infeksjonstidspunktet.
- Sett ut et tilstrekkelig antall firkantede LB-agarplater for å varme til romtemperatur (RT) for senere plating og bakteriell kvantifisering.
5. Inokulering av cellene (starten av forsøket)
- Etter nøyaktig 2 timer, fjern morgenbakteriekulturene fra shakeren, og sentrifuger dem i 10 minutter (1.900 x g, 4 ° C).
MERK: For alle de følgende trinnene, hold alle bakterielle suspensjoner på is for å minimere veksten. - Resuspendere bakteriepelleten i TCM uten antibiotika. Bruk et spektrofotometer for å justere den optiske tettheten (OD) til 0,7-0,9, og fortynn ytterligere med TCM uten antibiotika til en konsentrasjon på 1 x 106 kolonidannende enheter (CFU)/ml (ca. 1:100 fortynning). Bruk denne bakteriesuspensjonen til å infisere hver innsats med 1 x 105 CFU per 100 μL volum.
- Merk transwellplaten, og infiser hver innsats med 100 μL av det OD-justerte inokulumet (totalt 1 x 105 CFU per innsats). Analysen har nå begynt. Noter klokkeslettet, og registrer det som t = 0 h.
- Plate inokulumbakteriesuspensjonen for å kvantifisere CFU / ml ved hjelp av sporfortynningsmetoden, plating 10 μL aliquots på firkantede LB-agarplater19.
6. Kvantifisering av transcytose
- Hvert 30. minutt etter inokulasjon, fyll nye brønner med 500 μL TCM uten antibiotika. Overfør innsatsene til disse nye brønnene ved hjelp av et annet sett med sterile tang for hver forskjellige bakteriestamme.
- Samle mediet fra den brukte oppsamlingsbrønnen for hver innsats i separate merkede rør. Plasser disse rørene på is. Sett transwellplatene tilbake til inkubatoren mellom tidspunktene.
- For hver innsats kombinerer du det innsamlede mediet fra t = 0,5 h, t = 1 t, t = 1,5 h og t = 2 t, og virvel kort. Plate det oppsamlede mediet på LB-agarplater ved hjelp av sporfortynningsmetoden for å kvantifisere mengden bakterier transcytosert i de første 2 timene av forsøket.
MERK: Å hente bakteriene hvert 30. minutt og holde dem på is sikrer at bakterieveksten i oppsamlingsbrønnene minimeres og målinger gjøres på overveiende transcytoserte bakterier. - Plasser den merkede sporfortynningen LB-agarplater i bakterieinkubatoren ved 37 °C uten supplerende CO2, og returner T84-transbrønnplaten til vevskulturinkubatoren.
- Ved t = 4 timer gjentar du trinn 6.3 ved å kombinere det innsamlede mediet fra t = 2,5 timer, t = 3 timer, t = 3,5 timer og t = 4 timer.
- Ved t = 6 timer gjentar du trinn 6.3 ved å kombinere det innsamlede mediet fra t= 4,5 timer, t = 5 timer, t = 5,5 timer og t = 6 timer. I tillegg, ved t = 6 timer, plate media fra kontrollbrønnene.
7. Slutten av eksperimentet
- Mål og registrer TEER på slutten av eksperimentet, t = 6 timer. Bruk fremgangsmåten som er beskrevet i trinn 1.3.2-1.3.6.
- Dekontaminerer sonden ved å senke den i 70% etanol i 10-15 minutter. Kast innleggene, eller lagre/behandle dem for ytterligere applikasjoner, hvis ønskelig. La LB-agarplatene ruge over natten, og desinfiser og/eller kast alle andre brukte materialer på en sikker måte.
- Etter inkubering over natten, tell bakteriekoloniene manuelt på sporet fortynning LB-plater for å bestemme inokulummengden og mengden E. coli-transcytose. Sørg for at kontrollplatene ikke viser bakterievekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: T84 TEER over tid. Når T84-cellelaget modnes på innsatsen, øker monolagets elektriske motstand. Ved en TEER på minst 1000 Ω·cm2 er cellelaget tilstrekkelig utviklet til å redusere den paracellulære bakterietransporten og tillate måling av primært transcellulær bakteriell transitt. Feilfeltene angir standardavviket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Under proliferasjonen av de sterile T84-cellene beskrevet i avsnitt 1, stiger TEER-ene over T84-monolagene kontinuerlig over tid, og overstiger 1000 Ω cm2 omtrent etter 7 dager fra såing (se figur 1). Selv om epitelcellepolariseringen og modningen av TEER er mer robust med T84-celler enn med andre tarmceller, som Caco-2, kan det fortsatt være nødvendig med feilsøking6. TEER av en innsats bør ikke reduseres dramatisk mellom målingene. En slik nedgang i TEER kan indikere en mekanisk forstyrrelse av epitelmonolaget. Man bør sørge for at under mediumendringen berører aspiratorens spiss aldri bunnen av cellekulturinnsatsen. Hvis denne typen skade mistenkes, kan den visualiseres ved lysmikroskopi som fravær av epitelceller nær aspirasjonsstedet. I tillegg til skader fra håndtering, kan en reduksjon i TEER indikere forurensning.
Figur 2 Transcytose av neonatale E. coli-isolater over tid. Etter infeksjon av T84-innsatsene kvantifiseres neonatale E. coli-kliniske isolater som lykkes med å nå oppsamlingsbrønnen ved hjelp av sporfortynningsmetoden. Ulike E. coli-stammer kan sammenlignes med hensyn til deres evne til å transcytose tarmepitelet. Den ikke-patogene E. coli DH5 alfa ble inkludert som komparator. Plottene viser gjennomsnittlige CFUer og standardfeil på hvert tidspunkt. Sammenligningene av gjennomsnittlige transcytoseverdier ble gjort med ensidige t-tester, som viste signifikante forskjeller mellom neonatale E. coli-isolater #1 versus #2 ved 2 timer (*p < 0,05), 4 timer (**p < 0,04) og 6 timer (***p < 0,04) etter infeksjon. I motsetning til dette gjennomgikk den ikke-patogene E. coli-stammen DH5 alfa minimal transcytose, som vist i det tredje plottet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Den kvantifiserte transcytosen kan representeres som vist i figur 2. I dette eksemplet ble forsøkene utført ved hjelp av tre innlegg, hver infisert med to forskjellige neonatale invasive E. coli-isolater. En ikke-patogen stamme, DH5 alfa, ble også testet for sammenligning. To sterile kontrollinnlegg ble også inkludert (ingen tomt er vist siden ingen bakterier ble isolert). Dataene fra denne prosedyren er nyttige for å beskrive evnen til en enkelt E. coli-stamme til å transcytose tarmepitelet. Dataene kan også gjøre det mulig å sammenligne transcytoseevnene til forskjellige stammer (se diskusjonsdelen for ytterligere applikasjoner).
Figur 3: TEER rett før infeksjon og 6 timer etter infeksjon. TEER av innsatsene øker vanligvis etter infeksjon med neonatal E. coli bakteriemiproduserende stammer2. De infiserte innsatsene viser en større økning i TEER enn de uinfiserte kontrollinnsatsene. TEER var signifikant større i T84 monolag etter 6 timers infeksjon med neonatal E. coli-stamme #1 (*p < 0,01) og E. coli-stamme #2 (**p < 0,03), beregnet ved t-tester. TEER i de ikke-infiserte kontroll-T84-monolagene økte også, men forskjellen mellom preinfeksjons- og postinfeksjonsverdiene var ikke statistisk signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 viser typiske TEER-resultater før og etter infeksjon med to neonatale E. coli kliniske isolater med ulik evne til å transcytose tarmepitelceller. Frekvensen og mengden transcytose varierer mellom stammer, som vist i figur 2, men TEER øker betydelig etter infeksjon med begge patogene stammer.
Resultatene kan endres i nærvær av forurensning i dette eksperimentet. De neonatale E. coli-stammene som ble brukt, forårsaket ikke tilstrekkelig skade på epitelmonolaget for å gi en reduksjon i TEER, men bakteriene var i stand til å transcytose. Det er plausibelt at en forurensende organisme, hvis den er tilstede, kan forårsake skade på tarmcellene og en påfølgende reduksjon i TEER. De sterile kontrollinnsatsene tjener til å identifisere slik mulig forurensning. Vevskulturmediet som brukes i denne prosedyren inneholder fenolrød pH-indikator. Generelt virker mediet en klar rosa når den er steril eller infisert med et lite inokulum. Med betydelig vekst eller forurensning kan mediet bli uklart, gult eller illeluktende. Før infeksjon virker mediene i alle T84-innleggene vanligvis klarrosa.
Etter inkubasjon over natten er det siste stedet å sjekke for forurensning på LB-agarplatene. Kontrollplatene skal ikke vise noen vekst. Platene laget av samlebrønnene til E. coli-infiserte innsatser skal inneholde homogene, runde, gule E. coli-kolonier. For å minimere risikoen for forurensning, bør alt arbeidet utføres i biosikkerhetsskap. Separate skap og inkubatorer skal brukes til steril vevsdyrking, E. coli-infisert vevsdyrking og bakteriell manipulasjon. Arbeidsområdene skal holdes rene, og en steril teknikk skal brukes hele veien.
Figur 4: Diagrammatisk fremstilling av transwellsystemet og relevante tarmcellestrukturer. (A) Seksjonsvisning av transwell-innsatsen (blå); De vertikale linjene nederst på innsatsen indikerer de permeable porene. De polariserte tarmepitelcellene danner et monolag i bunnen av innsatsen. Vevskulturmediet er vist i rosa, med en todelt EVOM-sonde nedsenket i den. Sondeledningene på motsatt side er koblet til EVOM-apparatet (ikke vist). (B) Forenklet diagram over de tette krysskomponentene i tarmepitelceller. De vertikale pilene representerer mulige ruter for bakteriell passasje fra apikal til basolateral side av det polariserte tarmepitelmonolaget. Forkortelser: ZO = zona okkluderer proteiner; JAM = kryssadhesjonsmolekyler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Apikal vekst av neonatale E. coli-isolater over tid. Målinger av E. coli i supernatanter som ligger over T84-celler i transwellinnsatser kan utføres som et valgfritt, ekstra endepunkt. Figuren viser at den apikale veksten av begge patogene E. coli-stammene som ble testet for transcytose, ikke var signifikant forskjellig over tid. Feilfeltene angir standardavvik. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden er avledet fra teknikker som brukes i gastroenterologi og smittsomme sykdommer20. In vitro-modeller av tarmepitelbarrieren har blitt brukt til å belyse mekanismene der luminalinnholdet interagerer med denne relevante komponenten av medfødt immunitet 6,8. Vertspatogeninteraksjonene til invasiv neonatal E. coli har også blitt separat karakterisert gjennom genetisk analyse, studier av antimikrobiell resistens og immunologiske teknikker 1,5,16,21. Imidlertid er lite kjent om de molekylære mekanismene som ligger til grunn for E. coli neonatale isolaters evne til å komme inn i blodet gjennom tarmen3.
Transcytoseteknikken som er demonstrert her, muliggjør en mer detaljert karakterisering av de neonatale E. coli-invasive stammene som produserer septikemi etter enteral oppkjøp. Neonatal bakteriemi er en flertrinnsprosess, og transcytose er et av de relevante trinnene. Sammenlignet med invasjonsmodeller gir denne transcytosemetoden ytterligere informasjon om mekanismene som er involvert i patogenesen av bakteriemi. I noen tilfeller invaderer patogen E. coli tynntarmen uten å nå blodet, og begrenser infeksjonen til å forårsake lokalisert sykdom22. Dermed kan bakteriens evne til å bare invadere tarmepitelet ikke gjenspeile deres evne til å passere helt gjennom epitelbarrieren. Denne modellen kan brukes til å studere prosessen med bakteriell passasje over tarmepitelet gjennom transcellulære eller paracellulære ruter, spesielt hvis ytterligere teknikker som elektronmikroskopi er innlemmet20. Sammenlignet med in vivo dyremodeller er denne in vitro-modellen mer effektiv og gir bedre kontroll over flere potensielle variabler. Videre bidrar det til dyrevelferd ved å gi et alternativ til in vivo eksperimentering.
Til tross for disse fordelene har dette eksperimentet fortsatt sine begrensninger. For det første tar denne analysen ikke hensyn til forskjeller i bakterievekst på den apikale siden av epitelet under inkubasjon. Slike vekstforskjeller kan påvirke mengden transcytose for hver stamme. Brukere kan velge å måle apikal vekst for en mer omfattende karakterisering av resultatene oppnådd med denne modellen. Et eksempel på apikal vekst av de to E. coli-isolatene som ble brukt til transcytoseforsøkene i metodene presentert i dette manuskriptet, er vist i supplerende figur 1. I tillegg, selv om denne modellen med rimelighet gjenskaper tarmepitelmonolaget, representerer den ikke helt alle komponentene i tarmbarrieren som beskytter blodet mot inntatte patogener. Likevel kan noen egenskaper av tarmepitelet studeres med denne modellen. For eksempel utskiller T84-celler klorid og produserer mucin23. Invasjon av diaréproduserende E. coli er assosiert med økt kloridsekresjon i T84-celler og en signifikant reduksjon i TEER utover 6 timer etter infeksjon24. Det er mulig at invasjon av bakteriemiproduserende E. coli-stammer også øker kloridsekresjonen i denne modellen, og at en reduksjon i TEER kan oppstå etter 6 timers infeksjon. Denne modellen kan tilpasses for studier av forholdet mellom ionetransport og bakteriell invasjon hvis andre forskere ønsker det. Mucin er en fysisk barriere som beskytter epitelet mot patogener. Infeksjon med andre E. coli-stammer reduserer mucinuttrykk av T84-celler25. Rollen av mucin i patogenesen av neonatal E. coli-transcytose over tarmepitelet kan også studeres med denne modellen. En annen bruk av denne modellen kan være å studere de cytotoksiske effektene av bakterielle cyklomoduliner og deres mulige rolle i prosessen med transcytose av neonatale E. coli-stammer. For eksempel er cytotoksisk nekrotiserende faktor-1 (CNF-1), som produseres av noen patogene E. coli-stammer, rettet mot Rho GTPases, som er avgjørende for å regulere tett kryssfunksjon og apoptose av infiserte eukaryote celler26. Denne transwellmodellen kan tilpasses for å bedre forstå mekanismene som disse cytotoksinene påvirker tarmepitelet27. Ved bruk av denne modellen for å studere samspillet mellom neonatale E. coli-stammer og tarmepitelet, er det viktig å vurdere at T84-cellene som brukes til å modellere tarmepitelet, er hentet fra en lungemetastase av kolonadenokarsinom hos en voksen6. Mens studier i T84-celler har reprodusert spesifikke effekter på intestinal permeabilitet som har oversatt til lignende effekter i humane nyfødte og neonatale dyrs tarmceller28,29, kan foster- og neonatal tarmepitel oppføre seg annerledes i nærvær av invasiv E. coli.
Noe feilsøking kan være nødvendig for å optimalisere denne modellen og kvaliteten på dataene den gir. Bruk av sterile kontrollinnsatser er nærmere omtalt i avsnittet om representative resultater. Andre ikke-invasive E. coli-stammer kan også inkluderes som negative/minimale transcyktosekontroller. Videre kan en annen cellelinje, som Caco-2, brukes til å vurdere evnen til de neonatale E. coli-stammene til å transcytose polarisert tarmepitel. Invasjonen og transcytose av E. coli har vist seg å være større for T84-celler sammenlignet med Caco-2-celler30. Derfor må disse forskjellene vurderes når denne modellen brukes til å evaluere bakteriell transcytose med disse og andre epitelceller som polariserer og danner tette kryss. Å ta TEER-målinger av hver enkelt transwell-innsats krever flere sekunder, og når flere stammer testes, må den ekstra operatørtiden tas i betraktning. Mer effektive metoder for overvåking av TEER i transwell-systemer fortsetter å bli utviklet. Disse nyere enhetene gjør det mulig å overvåke TEER samtidig i flere transwell-innsatser og i sanntid31. Forskere som vurderer disse alternativene, må avgjøre om den sparte tiden potensielt kan kompensere for den økte prisen på disse nyere enhetene sammenlignet med enkeltelektrodemålingene beskrevet her.
Til tross for noen mulige utfordringer, tillater denne analysen forskere å studere spesifikke mekanismer involvert i patogenesen av E. coli-bakteriemi utover bare mengden transcytose. Når det kombineres med molekylære mikrobiologiteknikker, kan denne prosessen brukes til å fastslå effekten av individuelle gener på E. colis evne til å transcytose tarmepitelet, som det har blitt forsøkt i dyremodeller32. Denne modellen kan også modifiseres ved samtidig dyrking av immunceller eller tilsetning av cytokiner, vekstfaktorer og farmasøytiske inngrep for å simulere mer komplekse immun- og farmakodynamiske responser33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et Sarah Morrison studentstipend utstedt av University of Missouri-Kansas City School of Medicine til AI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
- Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
- Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
- Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
- Schoultz, I., Keita, Å The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
- Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
- Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
- Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
- Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
- Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
- Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
- McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
- Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
- Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
- El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
- Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
- Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
- Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6'-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
- Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
- Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
- McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
- Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).
