Summary
本方案确定了猪气管的拉伸应力松弛和破坏特性。这些方法的结果可以帮助提高对气管粘弹性和衰竭阈值的理解，并有助于提高肺系统计算模型的能力。
Abstract
气管的生物力学特性直接影响气流，并有助于呼吸系统的生物功能。了解这些性质对于了解该组织中的损伤机制至关重要。该协议描述了一种实验方法，用于研究猪气管的应力松弛行为，该气管被预先拉伸至0%或10%应变300秒，然后进行机械拉伸载荷直至失效。本研究详细介绍了猪气管生物力学测试的实验设计、数据采集、分析和初步结果。使用该协议中提供的详细步骤和数据分析MATLAB代码，未来的研究可以研究气管组织的时间依赖性粘弹性行为，这对于了解其在生理，病理和创伤条件下的生物力学反应至关重要。此外，对气管生物力学行为的深入研究将极大地有助于改善相关医疗设备的设计，例如在手术过程中广泛使用的气管内植入物。
Introduction
尽管其在肺部疾病中起着关键作用，但最大的气道结构气管对其粘弹性的研究有限1.深入了解气管的时间依赖性粘弹性行为对于肺力学研究至关重要，因为了解气道特异性材料特性可以帮助推进肺病的损伤预防，诊断和临床干预的科学，肺病是美国第三大死亡原因2，3，4。
现有的组织表征研究已经报道了气管5，6，7，8的刚度特性。尽管时间依赖性机械反应在组织重塑中很重要，但对时间依赖性机械反应的研究很少，病理学9，10也改变了这种反应。此外，缺乏时间依赖性响应数据也限制了目前诉诸于使用通用本构定律的肺力学计算模型的预测能力。需要通过进行应力松弛研究来解决这一差距，这些应力松弛研究可以提供所需的材料特性，为气管的生物物理研究提供信息。目前的研究提供了测试方法，数据采集和数据分析的详细信息，以研究猪气管的压力松弛行为。
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Protocol
所描述的所有方法都得到了德雷克塞尔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。所有尸体动物都是从位于美国宾夕法尼亚州的美国农业部（USDA）批准的农场获得的。本研究使用了一头雄性约克郡猪（3周龄）的尸体。
1. 组织采集
- 从批准的农场获取猪的尸体，并在安乐死后2小时内进行实验。将尸体放在冰上，直到组织收获完成，以确保新鲜的组织生物力学性质得到保护。
注意：在已发表的文献中，动物的新鲜组织测试通常在安乐死后2小时内进行。有关详细信息，请参阅参考文献11、12、13、14、15、16、17、18、19。 - 将尸体置于仰卧位，沿颈部做一个垂直的中线切口，并将甲状腺软骨、环状软骨和气管从舌骨暴露到胸骨上切口。
- 使用#10刀片收获喉部和全长气管（图1A）。
- 将气管样品从喉部分离出来，然后使用#10刀片沿一侧的整个长度纵向切割气管管（图1B）。
- 使用获取的横截面图像（使用ImageJ20获得，参见 材料表）测量气管的厚度（图1C）。在数据分析期间，使用测量的组织厚度来计算横截面积。
- 将气管切成两条约5毫米宽（近端）的圆周条带和两条约5毫米宽（远端）的纵向条带，这些条带的最小长度为25毫米（图1D）。
- 在标尺旁边获取四个样品（即切割的气管条）的图像。使用这些图像通过图像J提供样品宽度的数字化测量（图1E）。然后，在数据分析期间使用此测量宽度计算样品的横截面积。
- 在整个研究过程中，确保所有组织样品使用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液保持水合。将样品保持在PBS浸泡的纱布中水合，直到准备好测试。在测试适当的水合作用之前，将组织浸入PBS中。
2. 生物力学测试
- 将每个样品连接到定制设计的夹具上（参见先前的报告11，12，13，14，15，16，17，18，19），以便样品纵向保持在夹具之间（图1F）。
- 小心地将夹具（不引起任何拉伸）固定在材料试验机上（参见 材料表），该机器的顶部致动器上连接有一个50 N称重传感器（图1G）。
- 使用尺子测量夹具之间的距离（即夹具）。使用此距离作为应变计算的初始组织长度。
- 通过以 1%/s 的应变率将每个样品拉伸加载五次以进行预处理，以 1% 的应变率进行。
- 将每个样品保持在0%或10%的峰值伸长率下300秒，以研究组织的粘弹性应力 - 松弛反应。
- 应力松弛试验后，立即以1%/s的速度拉伸组织，直到发生机械故障。
- 记录故障现场，并通过确保夹具内存在样品来确认没有滑倒（图1H）。
3. 数据采集
- 在预处理过程中不要获取任何数据。
- 使用任何数码相机以至少30帧/秒的速度录制应力松弛和失效测试视频。
- 在应力松弛和失效测试期间，使用数据采集软件（参见 材料表）以250个样本/秒的采样率采集时间（s）、载荷（N）和位移（mm）数据。
- 将采集的数据另存为.csv文件，并按照步骤4中的详细说明将其用于数据分析。
- 在应力松弛之前，应力松弛之后和失败后获取夹紧组织的静止图像（图2）。
4. 数据分析
- 数据输入
- 下载并安装 MATLAB 数据分析软件（参见 材料表），包括“优化”和“图像处理”工具箱。
- 下载压缩文件夹（补充编码文件 1），其中包含 MATLAB 代码和将用于解释数据分析步骤的示例数据集。
- 导航到下载的压缩文件夹并解压缩其内容。
- 打开 MATLAB 并将解压缩的文件夹设置为工作目录。确保工作目录具有以下文件夹和文件，如下面的注释中所述。确保此工作目录中没有其他文件夹或文件，因为它们可能会干扰代码并导致错误。
注：（1） 失败（松弛后），（2） 仅失效，（3） 松弛，（4） calc_relax_failure，（5） main_relax_failure，（6） 测试日期.xlsx。 - 导航到“ 仅失败” 文件夹。
注意：此文件夹中包含的数据来自本研究中的对照组，即来自气管样品的生物力学数据，这些样品在伸长0%后受到机械故障的影响。 - 使用以下文件命名约定将特定日期测试的样本中的数据存储在一个 Microsoft Excel 文件中： mmddyy。例如，2022 年 4 月 30 日测试的所有对照组气管样本的数据必须存储在 “仅失败|043022.xlsx.
注意：请注意，在目前的研究中，所有生物力学测试都是在一天内进行的;但是，如果数据派生自多个测试日期，则为每个测试日期创建一个新的 Microsoft Excel 文件，该文件按照所述约定命名。 - 仅打开失败|043022.xlsx并认识到有多个工作表选项卡，每个选项卡都包含在此特定日期（即2022年4月30日）遭受机械故障的每个样品的原始数据。
- 确保使用以下约定标记样品： [样品类型]_[样品编号]_[插入拉伸前应变水平]%。
注：例如，在目前的研究中，对照组气管样本在轴向或圆周载荷下进行了机械失效测试，没有任何先前的应力松弛。因此，这些样本按以下格式命名：分别为 TA_1_0% 和 TC_1_0%。0% 表示没有预拉伸。首先将实验组气管样品在轴向或圆周载荷为10%的固定伸长率下进行，以评估粘弹性应力松弛响应，然后进行机械失效。因此，这些样品按以下格式命名： TA_1_10% 和 TC_1_10% （请参阅步骤4.1.16和步骤4.1.23，分别代表轴向和圆周载荷条件）。 - 选择工作表选项卡 TA_1_0%。确保原始数据标题列的标记与以下注释中以粗体键入的内容完全相同。
注：（1） 时间（秒）、（2） 载荷 （N）、（3） 位置（毫米）、（4） 直径（毫米） （步骤 1.7）、（5） 平均截面积 （厚度 x 宽度，毫米2）（在步骤 1.5 和步骤 1.7 中获得），（6） 初始长度 （毫米） （步骤 2.3）。 - 关闭当前 Microsoft Excel 文件， 仅失败|043022.xlsx.
- 返回到数据分析软件的工作目录。
- 导航到“ 放松”文件夹。
注意：此文件夹中包含的数据来自本研究中的实验组，即来自气管样品的生物力学数据，这些样品在300秒内以10%的固定伸长率进行应力松弛测试。 - 使用以下标记约定将特定日期测试的实验组样本中的数据存储在一个 Microsoft Excel 文件中： mmddyy。
注意：例如，2022年4月30日测试的所有实验组气管样本的数据必须存储在 松弛|043022.xlsx.有关其他详细信息，请参阅步骤 4.1.6 中的注释。 - 开放式 放松|043022.xlsx 并认识到有多个工作表选项卡，每个选项卡都包含在此特定日期（即2022年4月30日）测试的实验组中每个样品的原始载荷松弛数据。
- 暂停并注意，正如此Microsoft Excel文件中包含的工作表选项卡所示，每个样品随后在拉伸机械载荷下都遭受了机械故障。
注意：每个样品的相应故障数据必须存储在 “故障（松弛后）” 文件夹中，步骤 4.1.20 中对此进行了进一步说明。 - 确保使用步骤 4.1.8 中描述的约定对样品进行标记。
- 切换当前 Microsoft Excel 文件中的每个工作表选项卡，并参考步骤 4.1.9，以确保每个示例的原始载荷松弛数据（由任何给定的工作表选项卡指示）的格式正确。
- 保存并关闭当前的 Excel 文件， 放松|043022.xlsx.
- 返回到数据分析软件的工作目录。
- 导航到“ 失败（放松后）”文件夹。
- 确保存在一个日期 与文件夹中存在的文件相同的日期（有关命名与每个测试日期相对应的微软Excel文件的详细信息，请参阅步骤4.1.6）。
注：当前文件夹“ 失效（松弛后）”中包含的数据是气管样品的相应原始机械失效数据，这些样品在300秒内以10%的固定伸长率进行应力松弛测试。 - 开放 失败（松弛后）|043022.xlsx 并识别多个工作表选项卡，每个选项卡都包含来自 松弛|中存在的相同样品的原始机械故障数据043022.xlsx.
- 确保使用步骤 4.1.8 中提到的约定对样品进行标记，并且标签与 松弛|043022.xlsx.
注意：例如，当前 Microsoft Excel 文件中 TA_1_10% 的数据表示气管试样 #1 在轴向载荷下的原始机械失效数据，该试样以前在 300 秒内以 10% 的固定伸长率进行了应力松弛测试。 - 切换每个工作表选项卡并参考步骤 4.1.9，以确保每个样本的原始机械故障数据的标题列格式正确。
- 关闭当前 Excel 文件， 失败（松弛后）|043022.xlsx.
- 返回到数据分析软件的工作目录。
- 对其他测试日期（如适用）重复步骤 4.1.5-4.1.26。
- 打开“ 测试日期.xlsx”的 Excel 文件，该文件将指示代码分析用户指定的测试日期。
- 在第一列中按以下格式列出测试日期： mm/dd/yy。
- 在第二列中，使用 Y （是）或 N （否）指示此特定测试日期的任何样品是否来自实验组（应力松弛后跟机械失效）组。
- 在第三列中，使用 Y （表示是）或 N （否）指示此特定测试日期的任何样品是否来自对照组（直接机械故障）组。
- 对其他测试日期重复步骤 4.1.29-4.1.31。
- 保存并关闭当前的 Excel 文件， 测试日期.xlsx。
- 返回到数据分析软件的工作目录。
- 打开主脚本文件 ，main_relax_failure。
- 选择软件界面上的 绿色大箭头 以运行代码。或者，在命令 窗口中键入 run main_calc_relax 。
- 出现提示时，输入逗号分隔的固定伸长率水平（以 %为单位），然后按 OK。
注：在目前的研究中，只使用了一种应力松弛伸长率，即输入 10。对照组不包括 0%。但是，如果数据来自多个伸长率，例如 10% 和 20%，则输入 10，20。 - 出现提示时，输入各种实验组的逗号分隔的应力松弛测试持续时间（以秒为单位），然后按 OK。
注：在目前的研究中，气管样本以固定伸长率保持300秒，因此输入 300秒。但是，如果数据来自多个应力松弛持续时间，例如 90 秒和 300 秒，则输入 90，300。
- 粘弹性应力松弛反应
- 使用以下等式19 使用代码 （main_relax_failure.m） 将载荷时间数据（代码行 144）转换为标称应力-时间数据：
，其中 σ 表示应力（兆帕斯卡 [MPa]），F 表示圆周或轴向载荷（牛顿 [N]），A0 表示初始横截面积（毫米平方 [mm2]）。 - 使用代码（main_relax_failure.m），确定峰值载荷和应力幅度（代码行138和146），以响应在300 s松弛试验开始时对样品施加10%固定伸长率。
注：这些值以下分别称为初始峰值载荷和初始峰值应力。 - 使用代码（main_relax_failure.m），使用以下等式计算300秒时应力（或载荷）的减少百分比（代码行141和149）：
其中 Rel%表示松弛百分比，σ（0+）表示初始峰值应力（或初始峰值载荷），σ（300）表示松弛超过300秒后记录的应力（或载荷）水平。 - 请参阅使用两项 Prony 级数指数衰减模型对粘弹性应力松弛响应（代码行 152-161）进行建模的代码 （main_relax_failure.m）。该模型通常用于描述各种生物组织的粘弹性行为，包括各种软骨气道水平（气管，大支气管和小支气管）21，22。
注意：计算出的应力值 [σ（t）] 被归一化以产生以下简化松弛函数：
并且 G（0） = 1。为了比较粘弹性应力 - 松弛响应， G（t）使用非线性最小二乘回归进行曲线拟合，如下所示： 
，其中 t 是应力松弛保持期间的时间， g 是松弛系数，τ1 和τ2 ，分别表示描述组织的短期（初始）和长期（平衡）行为的松弛时间（以秒为单位）。
- 使用以下等式19 使用代码 （main_relax_failure.m） 将载荷时间数据（代码行 144）转换为标称应力-时间数据：
- 机械故障响应
- 使用代码（main_relax_failure.m）使用下面注释中提到的方程将拉伸试验机记录的载荷-位移数据（代码行143-144）转换为标称应力-应变数据。
注：，其中 σ 表示标称应力 （MPa），F 表示圆周或轴向载荷 （N），A0 表示初始横截面积 （mm2）; 
，其中
表示合计应变，ΔL 表示位移，L0 表示样品的初始长度。对于在应力松弛保持后进行失效拉伸测试的样品，L0表示组织的预拉伸长度。例如，将样品3（初始长度为8 mm）预拉伸至10%，因此，对于计算结果应变值19，L0被认为是8.8 mm。 - 使用函数 （calc_relax_failure.m） 识别最大载荷（即失效载荷）和相应的失效位移，以及最大应力（即失效应力）和相应的失效应变（代码行 33 和 61-63）。
- 使用函数 （calc_relax_failure.m） 在故障载荷之后丢弃载荷位移数据（第 34 行）。
- 使用函数 （calc_relax_failure.m） 绘制载荷-位移曲线，并在出现提示时，手动选择曲线线性区域中的两个点以近似组织刚度 （N/mm）（代码行 37-58）。
注：由于载荷-位移曲线由样品的横截面积和初始长度归一化以产生应力-应变曲线，因此代码利用用户从载荷-位移曲线中选择的 x 和 y 坐标来计算弹性模量 （MPa），使用以下等式19 计算弹性模量：
其中 E 表示弹性模量， x 和 y 表示载荷-位移曲线上的选定坐标， A0 表示横截面积， L0 表示机械失效开始时样品的长度，Δσ和Δ 分别表示应力和应变在失效响应的线性区域的变化。 - 对每个样品重复步骤 4.3.4。
- 使用代码（main_relax_failure.m）使用下面注释中提到的方程将拉伸试验机记录的载荷-位移数据（代码行143-144）转换为标称应力-应变数据。
- 数据输出
- 成功运行代码后，请确保计算结果在数据分析软件的工作目录中作为 Microsoft Excel 文件提供，并采用以下命名约定： relax_failure_results_mmddyy.xlsx，其中 mmddyy 将替换为代码运行的日期。
，其中 σ 表示应力（兆帕斯卡 [MPa]），F 表示圆周或轴向载荷（牛顿 [N]），A0 表示初始横截面积（毫米平方 [mm2]）。
其中 Rel%表示松弛百分比，σ（0+）表示初始峰值应力（或初始峰值载荷），σ（300）表示松弛超过300秒后记录的应力（或载荷）水平。
并且 G（0） = 1。为了比较粘弹性应力 - 松弛响应， G（t）使用非线性最小二乘回归进行曲线拟合，如下所示： 
，其中 t 是应力松弛保持期间的时间， g 是松弛系数，τ1 和τ2 ，分别表示描述组织的短期（初始）和长期（平衡）行为的松弛时间（以秒为单位）。
，其中
表示合计应变，ΔL 表示位移，L0 表示样品的初始长度。对于在应力松弛保持后进行失效拉伸测试的样品，L0表示组织的预拉伸长度。例如，将样品3（初始长度为8 mm）预拉伸至10%，因此，对于计算结果应变值19，L0被认为是8.8 mm。
其中 E 表示弹性模量， x 和 y 表示载荷-位移曲线上的选定坐标， A0 表示横截面积， L0 表示机械失效开始时样品的长度，Δσ和ΔSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图1显示了夹紧部位附近的失效组织和夹钳内组织的存在，确认在拉伸测试期间没有打滑。图2显示了在被测样品的拉伸测试期间观察到的各种失效部位，包括顶部或底部夹紧部位或沿组织长度。数据分析结果总结在图3-4和表1-2中。气管样品在轴向或圆周预拉伸至10%应变后的应力松弛响应如图3所示。根据这些弛豫曲线计算了2项Prony级松弛函数中的初始峰值载荷和应力，300 s保持期间应力的百分比降低以及时间常数t1和t2。这些粘弹性参数包含在表1中。图4显示了气管样品在没有预拉伸或10%预拉伸后在轴向或圆周载荷下进行失效测试的应力 - 应变响应。根据这些曲线，确定了失效应力和相应的失效应变，以及弹性模量，并列于表2中。
初步测试成功地表征了气管组织的应力松弛反应。在这些初始实验中，10%的拉伸前应力-松弛响应报告初始峰值应力在轴向载荷方向上较高，而与轴向载荷方向相比，圆周载荷方向的应力降低百分比更高（表1）。与相同的10 %预拉伸组的圆周载荷方向相比，轴向载荷方向上的弛豫时间（描述组织的短期[初始]和长期[平衡]行为的τ 1和τ2 ）也更高。比较失效数据时，在0%和10%预拉伸组中，周向载荷方向的失效应力和 E 值都较高，而轴向载荷方向报告的失效应变较高（表2）。这些初步发现需要进一步的实验来进一步表征气管组织中的应力松弛和失效反应，以更好地了解其在拉伸载荷条件下的应力松弛响应，无论是轴向还是圆周。此协议中概述的步骤可以帮助实现此目标。
图1：组织收获和机械测试细节，请点击此处查看此图的大图。
图2：故障站点。 由黄色箭头指示的示例故障站点。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：在 300 秒的气管样品保持下，应力松弛响应预先拉伸至 10% 应变（A） 轴向或 （B） 圆周载荷（每个载荷条件 n = 1）。请点击此处查看此图的大图。
图 4：在没有预拉伸或 10% 预拉伸（每个载荷条件 n = 1）的情况下，气管样本在轴向或圆周载荷下失效测试的应力-应变响应。
| 样本 | 拉伸前应变 | 装载方向 | 初始峰值负载 （N） | 初始峰值应力 | % 减少压力 | τ1 （秒） | τ2 | 调整后的 R2 （%） | |
| 3 | 10% | 轴的 | 0.56 | 0.089 | 33.93 | 11.59 | 152.44 | 98.79 | |
| 4 | 环 | 0.26 | 0.057 | 42.31 | 1.58 | 14.86 | 99.08 | ||
表1：经受10%应变预拉伸300秒的气管样品的测量和计算应力松弛参数值。
| 样本 | 拉伸前应变 | 装载方向 | 失效应力（兆帕） | 失效应变 | 弹性模量 |
| 3 | 10% | 轴的 | 0.89 | 0.38 | 2.9 |
| 4 | 环 | 1.78 | 0.51 | 3.74 | |
| 5 | 0%（仅失败） | 轴的 | 1.02 | 0.86 | 2.3 |
| 6 | 环 | 2.15 | 0.57 | 6.3 |
表2：不同实验组下气管样本的失效响应。
补充编码文件1：研究气管应力松弛行为的自定义代码。请按此下载此档案。
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Discussion
很少有研究报告气管21，23的应力松弛特性。需要研究来进一步加强我们对气管组织的时间依赖性反应的理解。本研究报告提供了进行此类调查的详细步骤。然而，为了确保可靠的测试，必须确保方案内的以下关键步骤：（1）适当的组织水合作用，（2）圆周和纵向样品中的相似组织类型（软骨环和肌肉的数量）分布，（3）在没有预拉伸的情况下夹紧样品，（4）使用样品厚度和宽度来估计用于计算生物力学拉伸测试期间组织应力的横截面积， （5）正确夹紧组织样品，6）使用夹紧样品的量规长度输入1%/s的应变率进行拉伸试验，以及（7）在测试后确认夹具中存在组织时无打滑。此外，故障排除可能需要重新启动数据采集软件，以重新建立与测试设备控制器的通信。
目前的研究还提供了测试方法，数据分析和为研究气管的应力松弛行为而创建的自定义MATLAB代码（补充编码文件1）的详细说明。先前没有研究提供如此全面的信息。此外，在教育方面，当前研究中描述的方法可以很容易地整合到传统和虚拟现实格式的工程课程中压力放松实验室的教学模块24，25，26，27。
目前可用的气管和其他软组织的应力松弛研究符合两项Prony系列28，29，30的松弛功能。目前的研究也使用此功能;然而，未来的研究可以通过利用准线性粘弹性建模技术来表征粘弹性行为来扩展他们的研究。这些研究不仅有助于创建气道生物力学的强大预测计算模型，还有助于设计需要组织材料特性进行性能测试的植入物，例如气道支架。
最后，本研究中描述的方法不仅可以用于评估年龄和物种对气管应力松弛行为的影响，还可以应用于其他软硬组织，如韧带，椎间盘和骨骼。这种粘弹性数据可以被整合以改进现有的高保真有限元计算模型31、32、33。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本出版物中报道的研究得到了美国国立卫生研究院尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康和人类发展研究所的支持，奖项编号为R15HD093024，美国国家科学基金会CAREER奖编号1752513。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable safety scalpels | Fine Science Tools Inc | 10000-10 | |
| eXpert 7600 | ADMET Inc. | N/A | Norwood, MA |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Gauge Safe | ADMET Inc. | N/A | Free Download |
| Image J | NIH | N/A | Open Source |
| Proramming Software - MATLAB | Mathworks | N/A | version 2018A |
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Sterile phosphate buffer solution | Millipore, Thomas Scientific | MFCD00131855 |
References
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