Summary
Den nuværende protokol beskriver brugen af isotermisk titreringskalorimetri (ITC) til at analysere sammenhængen og dissociationskinetikken af bindingen mellem en DNA-aptamer og tetracyclin, herunder prøveforberedelse, løbende standarder og prøver og fortolkning af de resulterende data.
Abstract
Bestemmelsen af bindende affinitet og adfærd mellem en aptamer og dens mål er det mest afgørende trin i valg og brug af en aptamer til anvendelse. På grund af de drastiske forskelle mellem aptameren og små molekyler skal forskere lægge stor vægt på at karakterisere deres bindingsegenskaber. Isotermisk titreringskalorimetri (ITC) er en kraftfuld tilgang til dette formål. ITC går ud over bestemmelse af disassociationskonstanter (Kd) og kan tilvejebringe entalpiændringer og bindende støkiometri af interaktionen mellem to molekyler i opløsningsfasen. Denne tilgang udfører kontinuerlig titrering ved hjælp af etiketfrie molekyler og registrerer frigivet varme over tid ved bindingshændelserne produceret af hver titrering, så processen følsomt kan måle bindingen mellem makromolekyler og deres små mål. Heri introducerer artiklen en trin-for-trin procedure for ITC-måling af en udvalgt aptamer med et lille mål, tetracyclin. Dette eksempel beviser teknikkens alsidighed og dens potentiale til andre applikationer.
Introduction
Aptamere er ssDNA- eller RNA-fragmenter udvalgt gennem en evolutionsproces med høj bindingsaffinitet og specificitet til de ønskede mål 1,2, som kan fungere som avancerede genkendelseselementer eller kemiske antistoffer 3,4,5. Således spiller aptamers bindingsaffinitet og specificitet til deres mål en afgørende rolle i udvælgelsen og anvendelsen af en aptamer, og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) er blevet anvendt i vid udstrækning til disse karakteriseringsformål. Mange tilgange er blevet brugt til at bestemme affiniteten af aptamerer, herunder ITC, overfladeplasmonresonans (SPR), kolorimetrisk titrering, mikroskala termoforese (MST) og Bio-Layer Interferometri (BLI). Blandt dem er ITC en af de nyeste teknikker til bestemmelse af den termodynamiske og kinetiske forening af to molekyler i opløsningsfasen. Denne fremgangsmåde udfører kontinuerlig titrering ved hjælp af etiketfrie molekyler og registrerer frigivet varme over tid ved bindingshændelserne produceret af hver titrering 6,7. I modsætning til andre metoder kan ITC tilbyde bindingsaffinitet, flere bindingssteder og termodynamisk og kinetisk association (figur 1A). Fra disse indledende parametre bestemmes Gibbs frie energiændringer og entropiændringer ved hjælp af følgende forhold:
ΔG = ΔH-TΔS
Det betyder, at ITC tilbyder en komplet termodynamisk profil af den molekylære interaktion for at belyse bindingsmekanismerne (figur 1B). Det er vanskeligt at bestemme bindingsaffiniteten for små molekyler med en aptamer på grund af de drastisk forskellige størrelser mellem aptamer og mål. I mellemtiden kan ITC levere følsom måling uden mærkning og immobilisering af molekyler, hvilket giver et middel til at bevare den naturlige struktur af aptameren og målet under måling. Med de nævnte attributter kan ITC bruges som standardmetode til karakterisering af binding mellem en aptamer og små mål.
Efter udvælgelse af Gu-gruppen blev denne aptamer integreret med forskellige platforme, herunder elektrokemiske aptamerbaserede biosensorer, et konkurrencedygtigt enzymbundet aptamerassay og en mikrotiterplade, som kan opnå detektion af tetracyclin 8,9,10 med høj kapacitet. Dens bindende egenskaber er imidlertid ikke blevet belyst godt nok til at vælge den rigtige platform8; det er værd at karakterisere bindingen af aptameren til tetracyclin ved hjælp af ITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Figur 2 viser de vigtigste trin i ITC-eksperimentet til bestemmelse af den termodynamiske og kinetiske association af en DNA-aptamer og tetracyclin.
1. Forberedelse af prøver
BEMÆRK: Prøver til ITC skal fremstilles i samme buffer for både aptamer og ligand for at undgå varmefrigivelse forårsaget af blanding af forskellige buffere fra prøvecellen og sprøjten. Dette opnås typisk gennem dialyse af alle materialer i samme buffer. Bufferen udveksles ved hjælp af en protokol tilpasset fra protokollen for en 3 kDa molekylvægtsafskæring (MWC) koncentrator med nogle ændringer, som nedenfor:
- Dialysesøjlens membran (3 kDa MWC) aktiveres med 1x PBS, pH 7,4, købt hos producenten, ved hjælp af følgende trin: fyld med 1x buffer (PBS), ækvilibrer i 10 minutter ved RT og centrifuge ved 5.000 x g i 15 min.
- Fjern bufferen, og indlæs 500 μL aptamerprøver i kolonnen, centrifuge ved 5.000 x g, og gentag den 4x for at udveksle den oprindelige buffer til 1x PBS. Når bufferen går gennem membranen, vil alle molekyler med en masse mindre end 3 kDa gå gennem membranen, og aptameren forbliver på oversiden af membranen.
- Saml den dialyserede DNA-aptamer ved hjælp af en pipet, og overfør den til det eller de nye 1,5 ml rør.
- Saml den sidste gennemstrømningsbuffer for at opløse tetracyclin. Tetracyclinpulver er rent og lille, så dialyse er ikke nødvendig. Brug dog den tidligere dialyserede buffer for DNA til målet for at sikre, at bufferen til eksperimentet i sprøjten matcher bufferen i referencecellen.
- Aptamerkoncentrationen bestemmes igen ved hjælp af et UV-synligt spektrometer. Brug den sidste udvekslingsbuffer til at justere koncentrationen til 40 μM tetracyclin og 2 μM aptamer.
- Dna-aptameren foldes ved at opvarme ved 90 °C i 10 min., afkøle ved 4 °C i 10 minutter og derefter vende tilbage til RT i 20 min.
- Afgasning af den foldede aptamer og dialyserede tetracyklin ved hjælp af en afgasningsstation eller vakuumpumpe, der er indstillet til 600 mmHg ved 25 °C i 25 minutter for at eliminere opløste gasser.
2. Vask af instrumentet og kør testkittet
- Rengør opløsningsmiddelportene for at sikre, at hele prøveforløbet er ryddet. Rengør ved at kassere affaldsopløsningen og fylde dem med ren methanol, vand og buffer. Hver port indeholder mere end 250 ml for at sikre tilstrækkelig løsning til rengøring.
BEMÆRK: Rengøringsprocessen udføres automatisk af brugerprogrammerbar ITC-styringssoftware. - Test maskinens renhed ved at køre ITC ved hjælp af buffer til en buffer (dvs. 1x PBS til 1x PBS).
BEMÆRK: En normal støjbaseline er synlig mellem den lille buffer i bufferinjektionstoppe. Når titreringssprøjten og kanylerne er tilstrækkeligt rengjort og helt tørre, vil basislinjen være stabil; en stigning eller et fald i basislinjen afspejler snavset instrumentering eller bobler inde i instrumentet, som skal korrigeres, før der køres egentlige prøver. - Test maskinens nøjagtighed med et standardsæt, der inkluderer EDTA og CaCl2 (figur 3), ved hjælp af standardprogrammet og efter instruktionerne fra producenten.
3. Prøveudtagning for at bestemme bindingen mellem aptamer og tetracyclin
- Konfigurer løbeparametrene: en omrøringshastighed på 200 o / min, der kører ved 25 ° C, 2 μM aptamer og 40 μM tetracyclin, 30 injektioner med 2,0 μL hver, en forsinkelsestid på 180 s.
- Kontroller de nødvendige mængder ved hjælp af en kørende programberegner. Med denne kørende parameter udføres ITC-måling med 230 μL 40 μM tetracyklin i ITC-sprøjten og 485 μL 2 μM aptamer i ITC-prøvecellen ved hjælp af ITC.
- Læg de dialyserede tetracyklinsprøjteplader og den foldede aptamer i prøvecellen, undgå bobler ved hjælp af en pipette.
- Begynd at køre ITC-instrumentet ved at klikke på startknappen på softwaren.
BEMÆRK: ITC-instrumentets køreproces er fuldt automatiseret efter manuel påfyldning af referencecellen og titrantprøvepladerne.
4. Analyse af data ved hjælp af software
- Åbn dataanalysesoftwaren ved at dobbeltklikke for at begynde at analysere dataene.
- Åbn stien til de gemte rådata for at kende tendensen til binding.
- Åbn fanen Modellering, og brug forskellige bindingsmodeller til at finde den bedste pasform til datakurven. Derefter beregner softwaren automatisk ITC-termogrammet og forskellige termodynamiske parametre, herunder entalpi (ΔH), entropi (ΔS), fri energi (ΔG), ligevægtsbindingskonstant (Ka) og støkiometri.
- Indsaml de termodynamiske parametre, der bestemmes ud fra dataene og tilpasningsmodeloplysningerne.
- Opret en rapport, herunder billeder af ITC-termogrammet og forskellige termodynamiske parametre, som vist i figur 4 og tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ITC tilvejebringer en nøjagtig disassociationskonstant (Kd), bindingsstøkiometrien og de termodynamiske parametre for tomolekyleinteraktioner6. I dette eksempel binder aptameren valgt af Kim et al.9,11 til tetracyclin med bindingsaffiniteter på K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Interessant nok blev denne binding bestemt ved hjælp af ligevægtsfiltreringsmetoden og en rapporteret Kd på 63, 3 nM, hvilket ikke er meget forskelligt fra det gunstige bindingssted (sted 2). Tilpasningsmodellen og støkiometrien fra ITC afspejler, at aptameren binder til tetracyklin gennem et 2: 1 bindingsforhold med den sekventielle bindingsmodel (figur 4, tabel 1).
De termodynamiske parametre bestemt ved ITC-måling for sted 2 (ΔH = -1200 kcal/mol og -TΔS = 99,75 kcal/mol) indikerede, at entalpi, der overvinder relativt signifikant entropisk tab, driver den stærke binding. Den entalpidrevne binding med entropitab vedrører RNA-konformationsændringerne, som er blevet rapporteret som bindingsadfærd mellem RNA og et lille molekyle. For eksempel rapporterede Thoa et al. en sådan bindingsadfærd (ΔH = -27 kcal / mol og -TΔS = +17 kcal / mol) mellem en RNA-aptamer og Ru (bpy) 312. Desuden indikerede Horowitz et al., at entropidrevet binding er forbundet med interkalering af proflavin til et oligonukleotid (ΔH = -2,6 kcal/mol og -TΔS = -3,3 kcal/mol)13. Baseret på disse sammenligninger fungerer aptameren med switching-strukturel adfærd ved entalpidrevet binding, hvilket gør det muligt at bruge aptameren som anerkendelse for udviklingen af en ligetil sensor.
Figur 1: Bindingsdisassociationskonstant (Kd) og termodynamisk profil. (A) ITC identificerer den bindende disassociationskonstant (Kd) og termodynamiske profil, herunder ændring i entalpi (ΔH) og ændring i entropi (ΔS). (B) Den termodynamiske profil giver styrken og mekanismen for interaktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Hovedtrin i ITC-eksperimentet. Skemaet viser de vigtigste trin i ITC-eksperimentet til bestemmelse af den termodynamiske og kinetiske forening af en DNA-aptamer og tetracyclin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: ITC-standardtest mellem EDTA og CaCl2. Ca2 +-EDTA-kelationen er blevet brugt som en standardreaktion til at validere ITC. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: ITC-termogram af en DNA-aptamer og tetracyclin. Tilpasningsmodellen for termodynamisk og kinetisk forening afspejler, at bindingen har to uafhængige bindingssteder. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Sekventielt to websted | Kd (M) | 1.359 x 10-5 |
| Kd (M) | 5.378 x 10-8 | |
| ΔH (kcal/mol) | 1223 | |
| ΔH (kcal/mol) | -1200 | |
| Ka (Mˉ¹) | 7.358 x 104 | |
| Ka (Mˉ¹) | 1.859 x 107 | |
| ΔS (cal/mol K) | 4.123 x 103 | |
| ΔS (cal/mol K) | -3.992 x 103 |
Tabel 1: Parametre for bindingen mellem aptamer og tetracyclin. Forskellige termodynamiske parametre, herunder entalpi (ΔH), entropi (ΔS), fri energi (ΔG), ligevægtsbindingskonstant (Ka) og støkiometri, kan bestemmes ved bindingsmekanismen for to molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden, der præsenteres her, blev ændret i henhold til instruktion fra TA Instruments og er tilstrækkelig til at bestemme bindingsaffiniteten og termodynamikken for mange udvalgte aptamerer og mål i vores center. Afgørende trin fra denne procedure inkluderer udveksling af bufferen for at have et mål, der matcher liganden, kører prøver med korrekte parametre og finder den passende bindingstilpasningsmodel til at analysere dataene. Kontinuerlig registrering af varmefrigivelse kræver, at al støjvarme elimineres, såsom fra uoverensstemmelse mellem bufferen, snavs i cellen og sprøjten og bobler inde i prøverne. I bufferudvekslingstrinnet er det bedre at bruge den sidste dialysebuffer eller gennemstrømningsbuffer i dialysemembranen eller spinkolonnen til at opløse liganden, fordi det er dyrt at udveksle små molekyler direkte.
De fleste andre metoder til bestemmelse af bindingsaffinitet antager et bindingsforhold på 1: 1 mellem aptamer og ligand. På grund af bindingsadfærden og den drastisk forskellige størrelse mellem små molekyler og aptamerer er 1:1-bindingsmodellen imidlertid ikke altid nøjagtig14,15. I dette aspekt kan ITC give data om bindingsstøkiometrien for at kende antallet af bindingssteder og give oplysninger om bindingsadfærd 7,15. Denne avancerede funktion kan leveres ved hjælp af den korrekte bindingsmodel fra ITC-analysesoftwaren, enten en- eller to-site-bindingsmodellen. Et mættet punkt kan analyseres ved et andet bindingsforhold på 1: 1 (1 bindingssted), 1: 2 eller 0, 5: 1 (to bindingssteder). For den sekventielle model er der ikke noget særskilt mættet sted, men kun et samlet antal mættede steder. Hvis webstederne er identiske, passer dataene med sekventiel mætning. Der har det første bindingssted flere tomme kopier af samme art at vælge imellem end det andet sted, som det fremgår af faldet i frigivet varmeenergi fra sted til sted14,15,16. Bindingsparametrene bestemmer bindingskonstanten K for hvert bindingssted. I dette tilfælde viser det bindingen med to sekventielle bindingssteder, hvilket bekræfter konformationsændringen i det samlede molekyle. Selvom ITC tilbyder mange avancerede funktioner til at karakterisere bindingen mellem aptameren og små molekyler, koster optimeringsprocessen med gode forhold tid 7,16,17. Desuden er ITC-udstyr i sammenligning med andre instrumenter dyrt og kræver håndtering af en veluddannet tekniker.
I de fleste tilfælde er det udfordrende at bestemme bindingsaffiniteten mellem en aptamer og en lille molekyleligand. ITC kan betragtes som en avanceret metode til dette formål, fordi ITC giver meget nøjagtige bindingsaffiniteter såvel som termodynamisk information. Ud fra disse oplysninger kan vi forudsige dens adfærd for at bruge den til klinisk brug eller detektion. For eksempel kan vi med den valgte aptamer med to bindingssteder afkorte den for at beholde et bindingssted, hvis et sted ikke er gunstigt for binding, eller vi kan opdele aptameren i to aptamers, hvis begge bindingssteder har samme adfærd. Med konformationsstrukturændringsadfærd kan vi også kombinere aptameren med en slukningsplatform for at udvikle en sensor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af forsknings- og udviklingsfinansieringen fra Aptagen LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
