Summary
小鼠和大鼠通过手术植入远程温度应答器，然后习惯于测试环境和程序。肌肉温度的变化是根据对家庭笼子中的药理学或上下文刺激或在规定的身体活动（即跑步机匀速行走）期间做出反应而测量的。
Abstract
骨骼肌产热为更好地了解代谢稳态和能量消耗的机制提供了一种潜在的途径。令人惊讶的是，很少有证据表明产热的神经、肌细胞和分子机制与肌肉温度的可测量变化直接联系起来。本文描述了一种利用温度应答器直接检索小鼠和大鼠骨骼肌温度测量值的方法。
远程应答器通过手术植入小鼠和大鼠的肌肉中，并给予动物恢复的时间。然后必须反复习惯小鼠和大鼠的测试环境和程序。测量肌肉温度的变化以响应家庭笼子中的药物或上下文刺激。肌肉温度也可以在规定的身体活动（即跑步机以恒定速度行走）期间测量，以排除活动的变化，作为这些刺激引起的肌肉温度变化的贡献因素。
该方法已成功用于阐明大脑、交感神经系统和骨骼肌水平肌肉产热控制的基础机制。提供了使用捕食者气味（PO;雪貂气味）作为上下文刺激和注射催产素（Oxt）作为药理学刺激的这种成功的证明，其中捕食者气味诱导肌肉产热，而Oxt抑制肌肉温度。因此，这些数据集显示了该方法在检测肌肉温度快速变化方面的功效。
Introduction
在代谢研究中，骨骼肌产热的检查是探测体重稳态的有前途的新途径。已发表的文献支持这样一种观点，即人体最大的器官系统之一 - 骨骼肌 - 的产热反应为增加能量消耗和其他代谢效应提供了途径，从而有效地重新平衡肥胖等疾病的系统1，2，3。如果肌肉可以被认为是产热器官，研究必须利用实用的方法来研究该器官内的产热变化。了解骨骼肌吸热影响的愿望以及该方法用于研究非颤抖肌肉产热的效用并不是代谢研究所特有的。包括进化4，比较生理学5和生态生理学6，7在内的学科在了解肌肉产热可能导致吸热的方式以及这种机制如何适应环境方面表现出既得利益。所提出的协议提供了解决这些问题所需的关键方法。
所提供的方法可用于评估肌肉温度的上下文和药理学刺激调节，包括提供捕食者气味（PO）以转移环境以复制捕食者威胁的独特技术。先前的报告已经证明PO能够迅速诱导肌肉产热的显着增加8。此外，药理刺激也可以改变肌肉温度。这已经在PO诱导的肌肉产热的背景下得到证实，其中使用纳多洛尔对外周β肾上腺素能受体的药理学阻断抑制了PO诱导肌肉产热的能力，而不会显着影响跑步机行走期间的收缩产热8。大鼠中黑皮质素受体激动剂的中枢给药也被用于辨别改变产热的大脑机制9，10。
这里提供的是对神经激素催产素（Oxt）改变小鼠肌肉产热能力的初步研究。与捕食者威胁类似，与同性同种的社交接触会增加体温，这种现象被称为社交热疗11。鉴于Oxt与社会行为的相关性12，有人推测Oxt是小鼠社会热疗的中介。事实上，催产素受体拮抗剂降低了小鼠的社交热疗11，缺乏Oxt的小鼠幼崽在体温调节的行为和生理方面表现出缺陷，包括产热13。鉴于 Harshaw 等人 （2021） 没有发现支持 β3 肾上腺素能受体依赖性棕色脂肪组织 （BAT） 产热与社交热疗的证据11，有人认为社交热疗可能是由 Oxt 诱导肌肉产热驱动的。
为了测量骨骼肌产热，以下协议使用在小鼠或大鼠8，10，14，15内与感兴趣的肌肉相邻的预编程IPTT-300应答器植入。这些应答器是玻璃封装的微芯片，使用相应的应答器读取器读取。几乎没有研究以这种能力使用这项技术，尽管研究表明需要这种方法提供的特异性16，17。先前的研究已经表明该方法的可靠性，以及与其他温度测试方法18或与手术方法（例如，插管19）结合使用的温度应答器的各种方式。然而，这种性质的研究依赖于不同的策略放置来测量整体体温20，21，22或指定的组织，如BAT 23，24，25。
不是从这些位置或在使用耳或直肠温度计26时测量温度，这里描述的方法为感兴趣的肌肉提供特异性。通过在感兴趣的肌肉附近直接植入应答器来靶向一个部位的能力对于探测肌肉产热更有效。除了表面红外测温法27，28或通过热电偶29进行皮肤温度测量之外，它还提供了一条新的途径。此外，通过这种方法提供的数据提供了一系列研究途径，避免了对大型，昂贵，高科技设备和软件的需求，例如红外热成像30，31，32。
该方法已成功用于单侧或双侧测量股四头肌和腓肠肌的温度。该方法与立体定位手术联合使用也有效14，15。在应答器肢体 ~7-10 cm 范围内，便携式应答器读取器 （DAS-8027/DAS-7007R） 用于扫描、测量和显示温度。这个距离对于先前的调查至关重要和有价值8，9，10，因为它最大限度地减少了潜在的压力源和温度变化变量，例如测试过程中的动物处理。使用计时器，可以在一段时间内记录和收集测量值，而无需与动物直接互动。
为了进一步减少测试过程中对小鼠的干扰，该方法描述了组装和使用由PVC管道制成的立管，以使实验者在测试期间能够进入家庭笼子的底部。将立管与数字阅读器配合使用，可以在放置刺激物后无需任何动物相互作用即可对应答器肢体进行温度测量。以最低的成本，这种方法可以与药理学和上下文刺激结合使用，使研究人员很容易获得。此外，该方法可以一次用于大量受试者（~16只小鼠或~12只大鼠），从而节省了增加任何研究项目整体通量的时间。
该方法介绍了一种使用不锈钢网状茶浸泡器球向小鼠呈现气味的精心制作的机制，从现在开始称为“茶球”。虽然这些茶球是含有任何气味物质的理想选择，但在这些研究中，在每个治疗茶球内放置了在 2-3 周内用作雪貂（小鼠和老鼠的天敌）笼内垫料的毛巾。每条毛巾被切成 5 厘米 x 5 厘米的正方形。这种等分试样也用其他相同的无味对照毛巾重复。在没有屏障（即茶球）的情况下呈现这些气味导致小鼠切碎笼内的纤维，增加体力活动。这种行为在大鼠中并不那么明显。茶球为毛巾提供了一个通风的外壳，可以完全接触气味，同时在整个实验试验中保持保护。这些茶球可以根据动物使用方案进行消毒，制备并在手术后直接引入，以开始使动物适应结构以及控制刺激。然后，小鼠可以忍受额外的富集，降低急性刺激呈现的显着性。
习惯茶球的存在只是习惯化的一个方面，对这种方法至关重要。所描述的习惯化方案还包括反复暴露于测试程序以使测试环境正常化（即，人员，运输和移动到测试位置，暴露于刺激）。这种扩展的习惯化最大限度地减少了动物的细微反应，并将测量重点放在所需的因变量（例如，药理学或上下文刺激）上。先前对该协议的评估已经确定了四项试验，作为大鼠在家笼内进行温度测试之前所需的最小习惯数量8.如果测试间隔很长时间（超过2-3周），则必须再次习惯动物。对于反复习惯，至少一到两次试验就足够了。但是，如果温度测试间隔更长的时间，则可能需要重复更多的试验。
在使小鼠和大鼠习惯测试程序的持续努力中，每个实验试验都应包括刺激呈现之前的适应期。该适应时间对于转移到测试位置后重新平衡温度和活动至关重要。啮齿动物往往由于易位而温度急剧升高。适应应包括至少1小时，在添加任何药物或上下文刺激之前，在测试当天没有来自实验者的相互作用。这是每天测试所必需的。
在概述的家笼温度测试中，小鼠有家笼的自由范围来漫游以响应测试的刺激。这可能导致活性的可变变化，影响温度读数的准确性，从而影响自变量（例如，药理学或上下文刺激）的产热效应分析。为了识别由于活动水平引起的温度的潜在变化，下面包括一个协议，描述在跑步机行走期间使用温度。已发表的文献描述了该程序在大鼠中的成功使用，目前正在8，10，14，15小鼠中使用。跑步机行走为测试对象保持恒定的活动速度。在这项研究中，跑步机被严格用于控制活动水平，因此，被设置为跑步机上的最低可用速度，以促进小鼠的行走和老鼠的类似低设置。
以下程序概述了小鼠单侧腓肠肌的温度测量和捕食者气味呈现。该设计可与药理学试剂结合使用，并可转移到小鼠的大鼠和其他骨骼肌群（即股四头肌）。对于大鼠，应答器可以放置在双侧腓肠肌和棕色脂肪组织中。由于尺寸和距离限制，每只鼠标只能使用一个应答器。可以进行微小的修改（例如，去除上下文刺激）以评估对药物的产热反应。
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Protocol
这些方法可以应用于大鼠和小鼠模型，并在机构批准下进行（肯特州立大学，IACUC批准#359和#340 CN 12-04）。在实施议定书之前，应按照《 实验动物护理和使用指南》饲养动物。
1. 准备应答器阅读器
注意：使用前，必须设置应答器阅读器;以下步骤仅包括本研究所需的设置更改。协议的这一部分与DAS-8027-IUS便携式阅读器直接相关;其他阅读器型号应遵循手册提供的说明以获得编程结果。
- 将 音频蜂鸣音 设置为 关。
- 按 扫描 按钮打开设备，然后等待 OLED 显示屏上出现照明。按住 返回/ 菜单按钮进入 菜单 屏幕。
- 使用“ 下一步/输入 ”按钮，滚动浏览选项，直到 “操作设置”。在这里，切换向上或向下箭头以转到 “是 ”并打开操作子菜单。
- 使用“下一步/输入”按钮，滚动到“音频哔哔声”。由于默认设置为 ON，因此切换向上或向下箭头并将设置更改为 OFF。
- 按 下一步/回车 按钮保存此设置更改。
- 将“读取时振动”设置为“打开”。
- 按照步骤 1.1 到步骤 1.2 进行操作，或在步骤 1.4 之后直接完成下一步。
- 使用 “下一步/输入 ”按钮，滚动到“ 阅读时振动”。由于默认设置为 OFF，因此切换向上和向下箭头并将设置更改为 ON ，以便在读数完成时通过振动 感受 ，而不管是否能够查看屏幕。
2. 程序应答器
注意：每个植入的应答器应首先使用动物识别（动物ID或应答器ID）进行编程。该命名法可用作测试对象的辅助标识（例如，四位数字表示小鼠品系缩写、应答器位置，另外三到四位数字表示动物编号）。编程可以在手术前几天完成，同时在手术前保持应答器无菌。
- 在应答器上输入 ID 代码。
- 将升压线圈应用于读卡器头，这是 DAS 8027-IUS 型号的特定附件，有助于编程过程。
- 戴手套的手将应答器（在涂抹器内）放入增压线圈中。
- 按 扫描 按钮打开设备，然后等待 OLED 显示屏亮起。按住 返回/ 菜单按钮进入 菜单 屏幕。
- 使用“下一步”/“输入”按钮，滚动浏览选项，直到“写入应答器 ID”。在这里，切换向上或向下箭头以转到 YES。
- 使用“ 下一步/ 输入”按钮，切换到 “输入 ID 代码”。
- 使用向上和向下箭头键滚动数字和字母。在每个字符选择后按 NEXT/ENTER 移动到以下字符。
- ID码完成后，按 扫描 写入应答器。
- 从升压线圈上拆下应答器，然后根据需要重复上述步骤。通过在戴手套的手之间加热封闭的应答器并使用温度扫描仪进行测量来检查应答器是否读取温度变化。
注意： 自动多次写入 和 顺序计数 设置可以设置为 ON ，以允许在会话期间进行多个或顺序转发器编程。每个应答器应在编程过程中进行测试。
3.准备“家庭笼球”
- 将 5 厘米 x 5 厘米无味/对照毛巾放入茶球中。
- 手术后将这些家庭笼球放入新的家庭笼子中，以开始使动物习惯于在测试期间呈现上下文刺激的方法。每 2 周更换一次这些家庭笼球。
4. 手术和术后护理
- 称重并记录受试者的术前体重。使用诱导室，为动物提供麻醉（例如，2-5%异氟醚）。
- 使用电剪，完全剃掉后肢。根据机构指南给予镇痛（例如，5 mg/kg 酮洛芬，皮下）。
注意：如果此手术与其他手术方法结合使用，则可能需要额外的镇痛。 - 用70%酒精（或市售无菌酒精湿巾）和聚维酮碘清洗液（或市售无菌，单独包装的βdine拭子）交替清洁该区域至少三次，以聚维酮碘结束。
- 将动物送回诱导室，并将动物麻醉至手术水平。然后，将鼠标放在面罩中以继续暴露于麻醉中。将新霉素眼药膏涂抹在动物的眼睛上，以防止麻醉时干燥。
注意：在鼠标没有显示疼痛接收的证据（即角膜反射、尾巴捏反应、脚趾捏反射）之前，不应开始该过程。 - 仅使用手术剪刀，在右后肢的皮肤上做一个浅切口。
- 平行于腓肠肌移动，将预先编程和无盖的无菌应答器的锋利边缘放入切口中。确保绿色柱塞朝上且可见。继续将应答器涂抹器推入切口，直到不再可见应答器涂抹器的开口。
注意：在步骤 4.6 期间，请勿意外按下应答器涂抹器上的绿色柱塞。应答器过早放电会导致放置不当。 - 将涂抹器旋转 180°，导致绿色柱塞朝下朝向小鼠的肢体，实验者不再可见。将应答器涂抹器推入最终位置。一旦处于理想位置，与腓肠肌相邻或部分封闭，推动绿色柱塞，让施药器的压力引导研究者的手远离小鼠。
- 使用镊子将打开的皮肤固定在一起，并用无菌自动夹或无菌缝合线放置伤口夹。如果需要，在无菌自动夹之前使用可吸收的缝合线来闭合筋膜层。使用应答器阅读器检查小鼠肌肉的温度。
- 将鼠标从麻醉中取出，并将其放在干净的家用笼子中，笼子放在设置为 低 的水循环加热垫上以进行恢复。确保家庭笼子包括一个茶球和无味毛巾，以开始习惯。
注意：鼠标应在 15 分钟内从手术中唤醒。食物可以放在笼子的底部，以便在恢复日方便取用。 - 术后护理
- 手术后至少2天使用应答器阅读器每天记录小鼠体重和温度，或直到小鼠恢复或稳定体重。
- 在手术后至少2天向小鼠施用非麻醉性镇痛药（例如，5mg / kg酮洛芬，皮下），并根据需要提供额外剂量。
注意：小鼠和大鼠应在手术后5-8天内完全恢复，并可以进行习惯化和测试程序。
5. 测试准备 - 家庭笼子
- 建造立管
注意：以下步骤基于 194 mm x 181 mm x 398 mm 鼠标过滤器顶部保持架。为了适合较大的笼子（例如，大鼠家笼），需要调整宽度。- 用棘轮PVC切割机将PVC管切成八个部分，并按照 图1C组装。这将提供一个开放的桌面结构，可以容纳大约四个笼子。制作所需数量的立管。
- 房间布置
- 为测试室内的每个立管分配一个位置。将设置为接收不同上下文刺激（即气味）的立管至少分开 2 m，以避免混淆变量。
注意：每只小鼠都应尽可能在测试室内和物理立管上指定测试位置，以避免在不同位置和产热刺激之间建立关联。 - 使用磁条，在立管上贴上手术单或长袍，在研究人员和测试对象之间形成视觉屏障。设置此屏障以最大程度地减少观察实验者向笼子或测试室周围移动时由鼠标活动引起的温度变化。
- （可选）将镜子放置在立管下方的表面上，以便在测试期间轻松查看保持架底部。
注意：立管可以通过笼式清洗系统进行消毒。布或手术片应在习惯化和测试之前清洗。
- 为测试室内的每个立管分配一个位置。将设置为接收不同上下文刺激（即气味）的立管至少分开 2 m，以避免混淆变量。
- 茶球准备
- 用对照和PO毛巾（约5厘米x 5厘米）准备茶球。为避免交叉污染，请先准备控制气味的茶球。
注意：捕食者气味的毛巾在使用前应进行病原体检测。这些毛巾也应妥善保管，与它们相互作用的材料应立即消毒（即笼子清洗），防止气味暴露给其他动物。
- 用对照和PO毛巾（约5厘米x 5厘米）准备茶球。为避免交叉污染，请先准备控制气味的茶球。
6. 温度测试-家用笼子
注意：动物需要习惯于整个测试过程，不包括实验背景或药理学刺激。这应该在测试前至少完成 4 次。
- 将动物转移到准备好的测试室。将动物放在立管上的预先指定位置。该位置在所有习惯和测试过程中应相同。
- 从小鼠笼中取出“家庭笼球”，然后用布或手术片重新盖住笼子。让小鼠适应测试空间1-2小时。
- 适应完成后，使用扫描仪测量并记录每个受试者的基线温度。在测量过程中避免操纵布覆盖物。
注意：药理学试剂可以在这里应用。在测试之前，可以根据需要添加注射或应用程序后的等待时间。建议在添加药物以监测对药物刺激的反应后，在测试前直接记录次要基线。如果没有测试气味反应，则可以在注射后直接开始对小鼠进行温度测量。在提供任何刺激时，应采用随机化。 - 揭开笼子的盖子，将茶球（控制或PO）放在笼子的地板上。更换笼盖和布盖。
- 启动秒表。以与茶球放置相同的顺序测量测试对象的温度。记录所需时间点之后的测量温度和时钟时间。
- 实验完成后，取出处理球。将收到PO的小鼠放入带有原始“家庭笼球”的新家庭笼子中。将“家庭笼球”放回接收控制气味的小鼠的笼子中。将小鼠转移到住房位置。
注意：上述程序可以转换为适当尺寸笼子内的大鼠模型。可能需要对 图1C 中建议的测量进行调整，以便更好地进入主笼的底部。
图 1：应答器和家用笼子温度测试。 （A）用于测试小鼠腓肠肌温度的单侧应答器放置图。一旦编程和放置，应答器阅读器（DAS-8027-IUS，如图所示）可用于测量温度。（B）左，一个开放式网状不锈钢茶球和一条5厘米x 5厘米毛巾的照片。右图，封闭式茶球，用于在家用笼子测试中盛放习惯性和气味毛巾。（C） 用PVC管道建造的用于家用笼子测试的立管示意图。（四）主笼测试协议工作流程。（五）家笼测试区域的设施图片。左图，四个老鼠笼子放在一个立管上。磁条位于相邻的墙上，磁铁和手术布在手术台上。对，立管上有盖的老鼠笼子。（A）、（C） 和 （D） 是用 Biorender.com 创建的。请点击此处查看此图的大图。
7.温度测试-跑步机行走
- 为每只动物分配一台跑步机作为其习惯化和测试程序的指定位置。
- 准备跑步机进行测试，确保电击器正常工作。
注意：对于跑步机行走，跑步机应设置为最低可用速度，以促进连续运动，但不跑步用于习惯和测试。对于1012M-2模块化封闭式代谢跑步机，小鼠为5.2米/分钟，大鼠为7米/分钟。这个速度可能需要根据受试者的肥胖情况进行调整。冲击器的强度和重复率应设置为 5.0。 - 习惯
- 将小鼠移至测试室。让小鼠1-2小时适应其家庭笼子中的房间转移。
- 适应后，引导小鼠打开其指定的跑步机并关闭跑步机。启动皮带、减震器和秒表。
- 让小鼠在跑步机上行走15分钟，使用冲击刺激作为运动的动机。如果动物长时间处于主动电击器状态，请立即停止测试。
- 测试后，取出小鼠并将它们放回家笼。
- 使用液体清洁剂和水清洁跑步机。
- 测试
- 将小鼠移至测试室。让小鼠1-2小时适应其家庭笼子中的房间转移。
- 在将鼠标移动到跑步机之前测量并记录基线温度。
注意：对于包括药物在内的测试，请按照图 2A所示的原理图在此处应用或注射它们。注射后的等待时间可以根据需要添加，然后再将小鼠放在跑步机上。在提供任何刺激时，应采用随机化。 - 将 5 厘米 x 5 厘米的正方形对照毛巾或 PO 毛巾放在最靠近跑步机前部的跑步机内。将毛巾粘在跑步机的天花板上或下面，以便于放置和取出。
- 引导小鼠进入指定的跑步机。打开跑步机皮带和电击器。
- 启动秒表。按照小鼠在跑步机中设置的相同顺序对测试对象进行测量。记录所需时间点之后测量的温度和时钟时间。
注意：在步行活动期间，当鼠标在封闭的跑步机内时，可以从跑步机外部可靠地测量温度。对于大鼠来说，跑步机的尺寸和应答器-阅读器的距离限制可能需要实验者保持跑步机的背面打开，以便将阅读器插入跑步机内，更接近受试者。 - 测试完成后，关闭减震器和跑步机;将小鼠放回它们的家笼。将小鼠转移到住房位置。
- 使用液体清洁剂和水清洁跑步机，特别注意去除任何残留的PO。
- 实验完成后，对动物实施安乐死（例如，使用CO2 吸入），并目视确认应答器位置。
图 2：活动控制温度测试。 （A） 使用跑步机行走的药物进行活动控制温度测试的工作流程。（B）跑步机的设施图像。左图为完整设备设置图。右，单个跑步机和休克器的近距离图像。（A） 是用 Biorender.com 创建的。请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
将应答器单方面植入十只4-6个月大的野生型（WT）小鼠的右腓肠肌中，这些小鼠由SF1-Cre菌株（Tg（Nr5a1-cre）7Lowl/J，菌株#012462，C57BL / 6J和FVB背景;雌性N = 5;雄性N = 5）繁殖。恢复后，小鼠习惯于不包括上下文刺激（例如PO）的家笼温度测试程序。使用应答棒的温度测量值记录在他们的住房室内，并在转移到测试地点后记录。给予小鼠1-2小时以适应测试室和位置。在驯化完成后，记录每只小鼠1小时的基线和连续测量。这个程序完成了四次。
总体而言，没有观察到性别差异。将小鼠移至测试室后，肌肉温度显着升高，然后在测试环境中花费60分钟后通过基线测量降低。试验4的综合性别分析显示，“移动前”和“基线”温度测量值（双尾，配对 t检验，p > 0.10）之间没有显着差异，显示了1小时适应测试环境的有效性。此外，基线和60分钟温度的统计比较显示温度显着降低（双尾，配对 t检验，p < 0.01），提供了小鼠在测量过程中习惯于研究者运动的证据。然而，女性（但不是男性）表现出增量反应，其中连续习惯化试验中测得的5分钟至15分钟温度较低（图3）。当观察基线后移动或温度升高的急性影响时，小鼠在连续的习惯试验中对运输到测试室的反应往往较小（补充文件1，试验分析）。
用药理学试剂Oxt测试上述习惯化的成年WT小鼠。小鼠以随机顺序腹膜内注射（ip，2mg / kg）的Oxt或载体（无菌盐水），并在进入测试室之前和注射5，10，15，30，45，60，90，120，150和180分钟后测量肌肉温度。每只小鼠都接受了两种治疗。重复测量方差分析（ANOVA）揭示了Oxt和时间的显着主效应，其中Oxt相对于车辆降低了肌肉温度。Oxt在注射后5分钟相对于基线快速降低肌肉温度，注射后30分钟最大下降（图4）。肌肉温度在Oxt注射后60分钟标准化（双尾，配对 t检验，p >0.10）。
双侧植入腓肠肌中的应答器的成年雄性Sprague-Dawley大鼠（N = 4，年龄~6个月）习惯化，然后在带有PO（雪貂气味）刺激的家庭笼环境中进行测试。记录基线测量值，并以毛巾的形式向每只大鼠展示PO。然后在暴露10分钟后去除气味;在去除刺激之前和之后进行连续测量。这些初步数据（图5）表明，在去除刺激后，PO对骨骼肌产热有持续的影响。
先前发表的数据评估了成年雄性Sprague-Dawley大鼠（年龄~6个月）骨骼肌产热的捕食者威胁激活8。植入双侧腓肠肌应答器的大鼠呈现捕食者（雪貂）气味。在家庭笼子设置中进行测量（N = 8， 图6A）。这些数据显示，与控制气味相比，温度大幅升高。为了分析出对雪貂气味的厌恶或应激产热反应，雄性大鼠（N = 7， 图6B）呈现厌恶气味（丁酸），新气味（2-甲基苯并恶唑）或狐狸气味，或在测试前限制1分钟（中度压力）。在家庭笼子环境中进行测量2小时。对这些数据的分析表明，与所有其他条件相比，雪貂气味产生并保持产热的强烈变化。总之，这些数据提供了控制气味对骨骼肌产热的最小和短暂影响的证据。
图3：习惯化期间的肌肉温度分析，用于家庭笼子温度测试。 在右侧腓肠肌中单方面植入应答器的小鼠习惯于测试程序。在动物饲养室“移动前”，在测试室“移动后”中测量小鼠，在适应1-2小时后测量“基线”，然后连续超过1小时。显示的所有统计比较均在试验1和试验4之间进行，* p < 0.05，** p < 0.01（t检验，N = 10）;† p < 0.05， †† p < 0.01， ‡ p < 0.001 主效应试验（方差分析， N [试验] = 4）。显示的误差线显示平均值的标准误差 （SEM）。 请点击此处查看此图的大图。
图4：小鼠催产素药理刺激期间的肌肉温度。 习惯性小鼠，单方面植入应答器，给予2mg / kg（ip）催产素或载体（无菌盐水）。注射催产素后5分钟观察到肌肉温度显着降低，并在60分钟后恢复正常，**p < 0.01，*** p < 0.001（双尾配对 t检验，N = 9）。显示的误差线显示平均值的标准误差。 请点击此处查看此图的大图。
图5：大鼠笼子温度测试中的捕食者气味产热。 暴露于捕食者（雪貂）气味10分钟后，将应答器双侧植入腓肠肌的大鼠的温度测量。暴露10分钟后，如箭头所示，取出含有刺激的毛巾。大鼠在去除刺激物后20分钟保持升高的温度。显著大于基线温度，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001（t检验，N = 4）。显示的误差线显示平均值的标准误差。 请点击此处查看此图的大图。
图6：与对照组相比，雪貂气味引起肌肉温度快速升高。 （A）与雄性大鼠对照暴露相比，捕食者（雪貂）气味后腓肠肌温度显着升高（双尾配对t检验，N = 8）。（B）与对照组相比，新颖，厌恶或狐狸气味没有显着改变肌肉温度。中等应力引起的温度变化在5 min后迅速下降。与其他条件相比，雪貂气味在整个测试中保持了强烈的反应（方差分析，N = 7）。† p < 0.05，雪貂气味>所有其他条件下;* p < 0.025，雪貂气味和中等胁迫与对照气味之间的点比较。该图经Gorrell等人8许可修改。请点击此处查看此图的大图。
补充文件1： 图3 习惯化分析的R标记。 用于习惯化分析的 Markdown 文件与 R 代码显示了示例编码方法和方式，其中性别可以在数据中探测。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
该温度测试协议为该领域提供了直接测量骨骼肌产热的途径。当研究深入研究确定肌肉产热的机制时，这一点至关重要33。该方法提供了两种具有成本效益的方案，用于在上下文和药理学条件下测量骨骼肌产热。该协议强调了这些程序中习惯化和适应的重要性。习惯化用于在不引入任何药理学或上下文刺激的情况下反复将测试对象引入测试程序;它是家用保持架和跑步机温度测试的关键组成部分。这为动物提供了熟悉环境的时间，同时降低了实验环境的显著性。省略此步骤可能导致与实验刺激的偏差关联，以及对控制刺激的产热反应升高8。动物必须学习该程序，以减少对这些协议下测试动物所需的一般运动和操作的应激反应。收集的示例数据提供了重复习惯必要性的证据（图3）。在类似的努力中，每次试验都需要在测试当天适应环境。驯化是一种日常同化工具，让动物有时间从易位到测试室的压力中放松。跳过适应可能会给出不准确的基线温度测量值，与任何以后的评估产生相互作用。
在这里，肌肉产热测量用于证明腹膜内Oxt对小鼠的低温作用。考虑到支持中枢Oxt在产热中的作用的证据，特别是在社会热疗中的作用，这一结果令人惊讶11，13。然而，其他人已经证明了Oxt和加压素抑制大鼠核心温度和心率的能力，这是由Avpr1a受体34介导的作用。这个明显的悖论尚未调和。Oxt在不同情况下升高或降低温度的能力可能源于Oxt的中心与外围作用或暴露时间13，35，36，37。无论如何，在这里，我们证明小鼠肌肉温度在外周Oxt注射后温度迅速显着下降（图4），与Hicks等人（2014）报告的大鼠核心温度变化一致33。
根据美国国立卫生研究院（NIH）的期望，研究人员将性别作为生物变量，在小鼠和大鼠的雄性和雌性中测量肌肉产热。可以比较雄性和雌性的产热数据，尽管以前和目前的研究未能确定雌性大鼠整个发情周期中背景产热和变化的强烈性别差异8。一个例外是基线时和运输到测试区域后肌肉温度的明显性别差异，特别是在习惯化之前8.这可能源于运输后运动的差异，因为与雄性相比，雌性大鼠对一些压力刺激的运动反应更高，可与潜在的焦虑措施分开38。这强调了反复习惯于实验环境的必要性，在这种情况下，以避免歪曲产热的性别差异，这可能归因于实验刺激而不是应激反应的潜在差异。
动物笼内温度测试的主要方法有一些局限性，其中之一是控制可变的活动水平。这可能至关重要，因为活动增加会导致肌肉温度升高。为了解决这个问题，已经概述了小鼠和老鼠跑步机行走的程序。控制动物的运动可以最大限度地减少活动对温度的影响，从而排除收缩产热的差异。虽然跑步机行走可以作为单独测试完成，但这种方法可以与家庭笼子温度评估结合使用。综合分析为骨骼肌温度变化源于药理学或上下文刺激而不是继发于这些刺激引起的活动变化的断言提供了进一步的证据8，14，15。此外，这种方法是有限的，因为它是轻度侵入性的，不能满足一些研究的需要。然而，这种方法只需要一次手术，使研究人员能够在测试过程中避免持续的动物操作，同时保持测量的特异性。此外，IPTT-300应答器的当前可用尺寸不允许将应答器直接放置在小鼠的腓肠肌内。这可以在大鼠模型中完成，因为它们的尺寸较大。该方法提供了一种与感兴趣肌肉相邻的测量机制;然而，能够测量温度的应答器的改造或更小版本将是该领域和未来研究的重要资产。
在我们的研究计划中广泛使用所描述的方法使我们有机会管理响应应答器植入和测试程序的差异8，10，14，15。植入应答器后，建议在手术后和恢复期间立即监测动物的温度。虽然这首先可以深入了解动物的健康状况（例如，奇怪的低温是疾病或即将死亡的迹象），但它也提供了应答器仍然活跃并固定在原位的证据。大鼠或小鼠可能会在切口位置划伤，可能导致应答器部分或完全脱落。根据机构指南，这种手术被认为是轻微的。因此，在单侧应答器放置的情况下，如果小鼠失去应答器或小鼠的应答器不再起作用，则可以在备用肢体上重复手术。建议使用标记（即识别新位置，或“R”表示更换），以指示在应答器编程期间记录的重复手术，作为动物识别名称的一部分。此外，由于动物的笼子有自由放养，研究人员可能很难找到动物来阅读。建议研究人员利用习惯化阶段来练习测量并评估其设置。改变可能包括增加实验者和应答器扫描仪的数量，或减少立管的数量，从而减少每次试验中测试的动物的数量。
该协议为肌肉的直接温度测量提供了指导，而无需额外的软件分析，从而为通常使用红外相机的研究提供了一种可行且相对低成本的途径。此外，该程序能够收集数据，缩小一些研究试图将基因或蛋白质变化与肌肉产热联系起来的差距37。总而言之，通过直接评估目标肌肉中产生的热量，促进了对肌肉产热及其机制的兴趣增加。所描述的程序通过提供研究小鼠和大鼠骨骼肌的机制，直接解决了该领域的这种方法空白。
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Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由R15 DK097644和R15 DK108668支持。我们感谢Chaitanya K Gavini博士和Megan Rich博士之前的贡献，感谢Stanley Dannemiller博士确保我们遵守机构动物使用指南。特别感谢Tim Bartness博士为构建该方法及其相关研究提供了必要的基础研究。图1A、C、D和图2A是使用 Biorender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter | BrassCraft | ||
| 1 mL Syringes | Fisher Scientific | BD 309659 | |
| Betadine Swabs | Fisher Scientific | 19-898-945 | |
| Booster Coil | BioMedic Data Systems | Transponder Accessory | |
| Electric Clippers | Andis | 40 Ultraedge Clipper Blade | |
| Flexible Mirror Sheets | Amazon | Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles | |
| Forceps | Fisher Scientific | 89259-940 | |
| Heating Pad | |||
| Induction Chamber (isoflurane) | Kent Scientific | VetFlo-0730 | 3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers |
| Ketoprophen | Med-Vet Intl. | RXKETO-50 | |
| Magnetic Strips | Amazon | ||
| Magnets | Amazon | DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs | |
| Needles | Med-Vet Intl. | 26400 | |
| Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g | Med-Vet Intl. | RXNPB-HC | |
| Oasis Absorbable Suture | Med-Vet Intl. | MV-H821-V | |
| Predator (Ferret) Odor Towels | Marshall BioResources | ||
| PVC pipe | |||
| Reflex Wound Clip Remover | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | ||
| Srerile Autoclip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (mouse) | |
| Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser | Amazon | ||
| Sterile Autoclip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (rat) | |
| Sterile Saline | Med-Vet Intl. | RX0.9NACL-10 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| Surgical Sheets | |||
| Towels (Control/Habituation) | Amazon | 100% Cotton Towels, white | |
| Transponders | BioMedic Data Systems | Model: IPTT-300 | |
| Transponders Reader | BioMedic Data Systems | Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R | |
| Versaclean | Fisher Scientific | 18-200-700 | liquid detergent |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 22-246-073 | |
| Wedge pieces for PVC pipe |
References
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