Summary
Los ratones y las ratas se implantan quirúrgicamente con transpondedores de temperatura remotos y luego se habitúan al entorno y procedimiento de prueba. Los cambios en la temperatura muscular se miden en respuesta a estímulos farmacológicos o contextuales en la jaula del hogar o durante la actividad física prescrita (es decir, caminar en la cinta a una velocidad constante).
Abstract
La termogénesis del músculo esquelético proporciona una vía potencial para comprender mejor la homeostasis metabólica y los mecanismos subyacentes al gasto de energía. Sorprendentemente, hay poca evidencia disponible para vincular los mecanismos neurales, miocelulares y moleculares de la termogénesis directamente con cambios medibles en la temperatura muscular. Este documento describe un método en el que se utilizan transpondedores de temperatura para recuperar mediciones directas de la temperatura del músculo esquelético de ratón y rata.
Los transpondedores remotos se implantan quirúrgicamente dentro del músculo de ratones y ratas, y los animales tienen tiempo para recuperarse. Los ratones y las ratas deben habituarse repetidamente al entorno y procedimiento de prueba. Los cambios en la temperatura muscular se miden en respuesta a estímulos farmacológicos o contextuales en la jaula del hogar. La temperatura muscular también se puede medir durante la actividad física prescrita (es decir, caminar en la cinta a una velocidad constante) para tener en cuenta los cambios en la actividad como contribuyentes a los cambios en la temperatura muscular inducidos por estos estímulos.
Este método se ha utilizado con éxito para dilucidar los mecanismos subyacentes al control termogénico muscular a nivel del cerebro, el sistema nervioso simpático y el músculo esquelético. Se proporcionan demostraciones de este éxito utilizando el olor a depredador (PO; olor a hurón) como estímulo contextual e inyecciones de oxitocina (Oxt) como estímulo farmacológico, donde el olor a depredador induce la termogénesis muscular, y Oxt suprime la temperatura muscular. Por lo tanto, estos conjuntos de datos muestran la eficacia de este método para detectar cambios rápidos en la temperatura muscular.
Introduction
Dentro de la investigación metabólica, el examen de la termogénesis del músculo esquelético es una nueva vía prometedora para probar la homeostasis del peso corporal. La literatura publicada apoya la idea de que las respuestas termogénicas de uno de los sistemas de órganos más grandes del cuerpo, el músculo esquelético, proporcionan una vía para aumentar el gasto de energía y otros efectos metabólicos, reequilibrando así eficazmente los sistemas dentro de enfermedades como la obesidad 1,2,3. Si el músculo puede considerarse un órgano termogénico, los estudios deben utilizar una metodología práctica para estudiar los cambios termogénicos dentro de este órgano. El deseo de comprender el impacto endotérmico de los músculos esqueléticos y la utilidad de esta metodología para estudiar la termogénesis muscular sin temblores no son específicos de los estudios metabólicos. Disciplinas como la evolución4, la fisiología comparada5 y la ecofisiología 6,7 han mostrado un gran interés en comprender las formas en que la termogénesis muscular puede contribuir a la endotermia y cómo este mecanismo se adapta al medio ambiente. El protocolo presentado proporciona los métodos críticos necesarios para abordar estas preguntas.
El método proporcionado se puede utilizar en la evaluación de la modulación de estímulos contextuales y farmacológicos de la temperatura muscular, incluida la técnica única de proporcionar olor a depredador (PO) para cambiar el contexto para replicar la amenaza del depredador. Informes anteriores han demostrado la capacidad de PO para inducir rápidamente un aumento considerable en la termogénesis muscular8. Además, los estímulos farmacológicos también pueden alterar la temperatura muscular. Esto ha sido demostrado en el contexto de la termogénesis muscular inducida por PO, donde el bloqueo farmacológico de los receptores periféricos β-adrenérgicos, utilizando nadolol, inhibió la capacidad de PO para inducir la termogénesis muscular sin afectar significativamente la termogénesis contráctil durantela caminata en cinta 8. La administración central de agonistas del receptor de melanocortina en ratas también se ha utilizado para discernir los mecanismos cerebrales que alteran la termogénesis 9,10.
Aquí se proporciona una investigación preliminar de la capacidad de la neurohormona oxitocina (Oxt) para alterar la termogénesis muscular en ratones. Similar a la amenaza del depredador, los encuentros sociales con un conespecífico del mismo sexo aumentan la temperatura corporal, un fenómeno conocido como hipertermia social11. Dada la relevancia de Oxt para el comportamiento social12, se ha especulado que Oxt es un mediador de la hipertermia social en ratones. De hecho, un antagonista del receptor de oxitocina disminuye la hipertermia social en ratones11, y las crías de ratón que carecen de Oxt muestran déficits en los aspectos conductuales y fisiológicos de la termorregulación, incluida la termogénesis13. Dado que Harshaw et al. (2021) no encontraron evidencia que respalde la termogénesis del tejido adiposo marrón (BAT) dependiente del receptor adrenérgico β3 con hipertermia social11, se ha postulado que la hipertermia social puede ser impulsada por la inducción de Oxt de la termogénesis muscular.
Para medir la termogénesis del músculo esquelético, el siguiente protocolo utiliza la implantación de transpondedores IPTT-300 preprogramados adyacentes al músculo de interés dentro de un ratón o rata 8,10,14,15. Estos transpondedores son microchips encapsulados en vidrio que se leen utilizando los lectores de transpondedor correspondientes. Poca o ninguna investigación ha utilizado esta tecnología en esta capacidad, aunque los estudios han sugerido la necesidad de la especificidad proporcionada por este método16,17. Investigaciones anteriores han demostrado la fiabilidad de este método y una variedad de formas en que los transpondedores de temperatura pueden ser utilizados en comparación con otros métodos de prueba de temperatura18 o en conjunto con métodos quirúrgicos (por ejemplo, canulación19). Sin embargo, los estudios de esta naturaleza se basan en diferentes ubicaciones estratégicas para medir la temperatura corporal total 20,21,22 o tejidos específicos como BAT23,24,25.
En lugar de medir la temperatura desde estos lugares o mientras se usan termómetros de oído o rectales26, el método descrito aquí proporciona especificidad para el músculo de interés. La capacidad de apuntar a un sitio mediante la implantación directa de transpondedores adyacentes a los músculos de interés es más eficaz para sondear la termogénesis muscular específicamente. Proporciona una nueva vía además de las proporcionadas por la termometría infrarroja de superficie 27,28 o las mediciones de temperatura cutánea a través del termopar 29. Además, los datos proporcionados a través de este método ofrecen una gama de vías de investigación, evitando la necesidad de equipos y software grandes, costosos y de alta tecnología, como la termografía infrarroja30,31,32.
Este método se ha utilizado con éxito para medir la temperatura en los cuádriceps y gastrocnemios, ya sea unilateral o bilateralmente. Este método también ha sido efectivo en conjunto con la cirugía estereotáxica14,15. Dentro de ~7-10 cm de la extremidad del transpondedor, se utilizan lectores de transpondedor portátiles (DAS-8027/DAS-7007R) para escanear, medir y mostrar la temperatura. Esta distancia ha sido crítica y valiosa para investigaciones previas 8,9,10 porque minimiza los posibles factores estresantes y las variables que alteran la temperatura, como el manejo de los animales durante los procedimientos de prueba. Usando temporizadores, las mediciones se pueden registrar y recolectar durante un período de tiempo sin interacción directa con los animales.
Para minimizar aún más la perturbación de los ratones durante las pruebas, este método describe el ensamblaje y el uso de elevadores hechos de tuberías de PVC para dar al experimentador acceso al fondo de las jaulas domésticas durante la prueba. Usando los elevadores en conjunto con el lector digital, las mediciones de temperatura de la extremidad del transpondedor se pueden hacer sin ninguna interacción animal después de colocar el estímulo. A un costo mínimo, este método se puede utilizar junto con estímulos farmacológicos y contextuales, lo que lo hace bastante accesible para los investigadores. Además, este método se puede emplear con un número sustancial de sujetos (~ 16 ratones o ~ 12 ratas) a la vez, ahorrando tiempo en el aumento del rendimiento general para cualquier proyecto de investigación.
En este método se introduce un mecanismo diseñado para presentar olores a ratones utilizando bolas infusoras de té de malla de acero inoxidable, a partir de ahora denominadas "bolas de té". Aunque estas bolas de té son ideales para contener cualquier material de olor, en estos estudios, las toallas que sirvieron como ropa de cama en la jaula durante 2-3 semanas para hurones, un depredador natural de ratones y ratas, se colocan dentro de cada bola de té de tratamiento. Cada toalla se corta en cuadrados de 5 cm x 5 cm. Esta alícuota también se repite con toallas de control inodoras idénticas. Presentar estos olores sin una barrera (es decir, bola de té) llevó a los ratones a triturar las fibras dentro de sus jaulas, aumentando la actividad física. Este comportamiento no fue tan destacado en ratas. Las bolas de té proporcionan una carcasa ventilada a la toalla, dando acceso completo al olor mientras se mantienen protegidos durante la totalidad del ensayo experimental. Estas bolas de té pueden desinfectarse de acuerdo con los protocolos de uso de animales, prepararse e introducirse directamente después de la cirugía para comenzar a habituar a los animales a la estructura junto con el estímulo de control. Los ratones pueden entonces vivir con el enriquecimiento adicional, disminuyendo la prominencia de la presentación del estímulo agudo.
La habituación a la presencia de la bola de té es sólo un aspecto de la habituación que es crítico para este método. El protocolo de habituación descrito también consiste en la exposición repetida al procedimiento de prueba para normalizar el entorno de prueba (es decir, personal, transporte y movimiento al lugar de prueba, exposición al estímulo). Esta habituación prolongada minimiza las respuestas matizadas de los animales y centra las mediciones en las variables dependientes deseadas (por ejemplo, estímulos farmacológicos o contextuales). La evaluación previa de este protocolo ha identificado cuatro ensayos como el número mínimo de habituaciones necesarias antes de las pruebas de temperatura dentro de las jaulas domésticas en ratas8. Si las pruebas están separadas por largos períodos (más de 2-3 semanas), los animales deben estar habituados nuevamente. Para la habituación repetida, un mínimo de uno o dos ensayos son suficientes. Sin embargo, si las pruebas de temperatura están separadas por períodos de tiempo más prolongados, puede ser necesario repetir más ensayos.
En el esfuerzo continuo para acostumbrar a ratones y ratas al procedimiento de prueba, se debe incluir un período de aclimatación antes de la presentación del estímulo en cada ensayo experimental. Este tiempo de aclimatación es crítico para reequilibrar la temperatura y la actividad después de ser trasladado al lugar de prueba. Los roedores tienden a tener fuertes aumentos de temperatura debido a la translocación. La aclimatación debe consistir en un mínimo de 1 h sin interacción del experimentador el día de la prueba antes de cualquier adición de un agente farmacológico o estímulos contextuales. Esto es necesario cada día de prueba.
En las pruebas de temperatura de la jaula en el hogar descritas, los ratones tienen el rango libre de su jaula doméstica para vagar en respuesta al estímulo probado. Esto puede causar cambios variables en la actividad, afectando la precisión de las lecturas de temperatura y, por lo tanto, el análisis de los efectos termogénicos de la variable independiente (por ejemplo, estímulo farmacológico o contextual). En reconocimiento de los posibles cambios en la temperatura debido al nivel de actividad, a continuación se incluye un protocolo que describe el uso de la temperatura durante la caminata en la cinta rodante. La literatura publicada describe el uso exitoso de este procedimiento en ratas, y actualmente se está empleando con ratones 8,10,14,15. La caminata en cinta mantiene una velocidad constante de actividad para el sujeto de prueba. Para este estudio, las cintas de correr se utilizan estrictamente para controlar el nivel de actividad y, por lo tanto, se establecen a la velocidad más baja disponible en la cinta para promover la marcha de ratones y una configuración igualmente baja para las ratas.
El siguiente procedimiento se describe para la medición de la temperatura de gastrocnemio unilateral en ratones y la presentación del olor del depredador. El diseño se puede usar junto con agentes farmacológicos y es transferible a ratas y otros grupos de músculos esqueléticos (es decir, cuádriceps) en ratones. Para ratas, los transpondedores se pueden colocar en el gastrocnemio bilateralmente y en el tejido adiposo marrón. Debido a las limitaciones de tamaño y distancia, solo se puede utilizar un transpondedor por ratón. Se pueden hacer modificaciones menores (por ejemplo, la eliminación de estímulos contextuales) para evaluar las respuestas termogénicas a los agentes farmacológicos.
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Protocol
Estos métodos se pueden aplicar tanto a modelos de ratas como de ratones y se realizaron con aprobación institucional (Universidad Estatal de Kent, Aprobación IACUC # 359 y # 340 CN 12-04). Antes de la aplicación del protocolo, los animales deben alojarse de conformidad con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Preparación del lector de transpondedor
NOTA: Antes de su uso, el lector del transpondedor debe estar configurado; Los siguientes pasos solo incluyen los cambios de configuración necesarios para este estudio. Esta parte del protocolo está directamente asociada con los lectores portátiles DAS-8027-IUS; Otros modelos de lectores deben seguir las instrucciones proporcionadas por el manual para lograr resultados de programación.
- Establezca Audio Beep en OFF.
- Encienda el dispositivo presionando el botón SCAN y espere a que aparezca la iluminación en la pantalla OLED. Mantenga presionado el botón ATRÁS/MENÚ para acceder a la pantalla del menú .
- Con el botón NEXT/ENTER, desplácese por las opciones hasta OPERATIONAL SETUP. Aquí, alterne las flechas hacia arriba o hacia abajo para girar SÍ y abrir el submenú operativo.
- Con el botón NEXT/ENTER, desplácese hasta AUDIO BEEP. Como la configuración predeterminada es ON, cambie las flechas hacia arriba o hacia abajo y cambie la configuración a OFF.
- Pulse el botón NEXT/ENTER para guardar este cambio de configuración.
- Establezca Vibrar al leer en ON.
- Siga los pasos 1.1 a 1.2 o complete el siguiente paso directamente después del paso 1.4.
- Con el botón NEXT/ENTER, desplácese hasta VIBRAR AL LEER. Como la configuración predeterminada es OFF, alterne las flechas hacia arriba y hacia abajo y cambie la configuración a ON para sentir, a través de la vibración, cuando se ha completado la lectura, independientemente de poder ver la pantalla.
2. Programa de transpondedores
NOTA: Cada transpondedor implantado debe programarse primero con una identificación animal (identificación de animal o identificación de transpondedor). Esta nomenclatura se puede utilizar como identificación secundaria para el sujeto de prueba (por ejemplo, cuatro dígitos para la abreviatura de la cepa del ratón, la ubicación del transpondedor y tres o cuatro dígitos adicionales para indicar el número de animales). La programación se puede completar días antes de la cirugía mientras se mantienen los transpondedores estériles antes de la cirugía.
- Introduzca el código de identificación en el transpondedor.
- Aplique una bobina elevadora en el cabezal del lector, un accesorio específico para el modelo DAS 8027-IUS, que ayuda en el procedimiento de programación.
- Con una mano enguantada, coloque el transpondedor (dentro del aplicador) en la bobina de refuerzo.
- Encienda el dispositivo presionando el botón SCAN y espere a que se encienda la pantalla OLED. Mantenga presionado el botón ATRÁS/MENÚ para acceder a la pantalla del menú .
- Con el botón NEXT/ENTER, desplácese por las opciones hasta WRITE TRANSPONDER ID. Aquí, alterne las flechas hacia arriba o hacia abajo para girar SÍ.
- Con el botón NEXT/ENTER, cambie a ENTER ID CODE.
- Utilice las teclas de flecha arriba y abajo para desplazarse por los números y las letras. Pulse SIGUIENTE/ENTRAR después de cada selección de caracteres para desplazarse al siguiente carácter.
- Cuando se complete el código de identificación, presione SCAN para escribir el transpondedor.
- Retire el transpondedor de la bobina de refuerzo y repita según sea necesario. Compruebe que el transpondedor lee los cambios de temperatura calentando los transpondedores cerrados entre las manos enguantadas y midiendo con el escáner de temperatura.
NOTA: Los ajustes de AUTO MULTI WRITE y SEQUENTIAL COUNT se pueden establecer en ON para permitir la programación de transpondedor múltiple o secuencial durante una sesión. Cada transpondedor debe probarse durante la programación.
3. Prepara "pelotas de jaula caseras"
- Coloque una toalla inodora / control de 5 cm x 5 cm en una bola de té.
- Coloque estas bolas de jaula caseras en jaulas nuevas después de la cirugía para comenzar a habituar al animal al método en el que se presentarán los estímulos contextuales durante la prueba. Reemplace estas bolas de jaula caseras cada 2 semanas.
4. Cirugía y cuidados postoperatorios
- Pesar y registrar el peso corporal de los sujetos antes de la cirugía. Usando una cámara de inducción, proporcione anestesia (por ejemplo, 2-5% de isoflurano) al animal.
- Usando cortapelos eléctricos, afeite completamente la extremidad posterior. Administrar analgesia (p. ej., 5 mg/kg de ketoprofeno, s.c.) de acuerdo con las directrices institucionales.
NOTA: Es posible que se requiera analgesia adicional si este procedimiento se combina con otros métodos quirúrgicos. - Limpie el área con alcohol al 70% (o toallita con alcohol estéril disponible comercialmente) y lavado con povidona yodada (o hisopos de betadina estériles envueltos individualmente disponibles comercialmente) alternando al menos tres veces, terminando con povidona yodada.
- Devuelva al animal a la cámara de inducción y anestesie al animal a niveles quirúrgicos. Luego, coloque el ratón en una máscara facial para la exposición continua a la anestesia. Aplique ungüento oftálmico de neomicina en los ojos del animal para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
NOTA: El procedimiento no debe comenzar hasta que el ratón no muestre evidencia de recepción del dolor (es decir, reflejo corneal, respuesta de pellizco de la cola, reflejo de pellizco del dedo del pie). - Usando solo tijeras quirúrgicas, haga un corte poco profundo a través de la piel en la extremidad posterior derecha.
- Moviéndose paralelo al gastrocnemio, coloque el borde afilado de un transpondedor estéril preprogramado y sin tapa en la incisión. Asegúrese de que el émbolo verde mire hacia arriba y sea visible. Continúe empujando el aplicador del transpondedor en la incisión hasta que la abertura del aplicador del transpondedor ya no sea visible.
NOTA: No presione accidentalmente el émbolo verde del aplicador del transpondedor durante el paso 4.6. La descarga prematura del transpondedor conducirá a una colocación incorrecta. - Gire el aplicador 180°, lo que hace que el émbolo verde mire hacia abajo hacia la extremidad del ratón, que ya no es visible para el experimentador. Empuje el aplicador del transpondedor en la ubicación final. Una vez en la ubicación ideal, adyacente o parcialmente encerrado en el gastrocnemio, empuje el émbolo verde, permitiendo que la presión del aplicador guíe la mano del investigador hacia atrás lejos del ratón.
- Con fórceps, mantenga unida la piel abierta y coloque un clip para heridas con un autoclip estéril o una sutura estéril. Si es necesario, use suturas absorbibles antes del autoclip estéril para cerrar la capa de fascia. Usando el transpondedor-lector, verifique la temperatura del músculo del ratón.
- Retire el ratón de la anestesia y colóquelo en una jaula casera limpia colocada encima de una almohadilla térmica de circulación de agua configurada a baja para su recuperación. Asegúrese de que la jaula doméstica incluya una bola de té con una toalla inodora para comenzar la habituación.
NOTA: El ratón debe despertar de la cirugía dentro de los 15 minutos. Los alimentos se pueden colocar en el fondo de la jaula para facilitar el acceso durante los días de recuperación. - Cuidados postoperatorios
- Registre el peso y la temperatura del ratón diariamente usando un transpondedor-lector durante al menos 2 días después de la cirugía o hasta que los ratones recuperen o estabilicen el peso corporal.
- Administrar analgesia no narcótica (por ejemplo, 5 mg/kg de ketoprofeno, s.c.) una vez al día a los ratones durante al menos 2 días después de la cirugía, con dosis adicionales proporcionadas según sea necesario.
NOTA: Los ratones y las ratas deben recuperarse completamente dentro de los 5-8 días posteriores a la cirugía y pueden someterse a procedimientos de habituación y prueba.
5. Preparación de pruebas - jaula doméstica
- Construcción de elevadores
NOTA: El siguiente paso se basa en jaulas con filtro de ratón de 194 mm x 181 mm x 398 mm. Para adaptarse a jaulas más grandes (por ejemplo, una jaula casera para ratas), será necesario ajustar el ancho.- Corte la tubería de PVC con un cortador de PVC de trinquete en ocho secciones y ensamble siguiendo la Figura 1C. Esto dará una estructura de mesa abierta que puede contener aproximadamente cuatro jaulas. Haga el número deseado de elevadores.
- Configuración de la habitación
- Asigne una ubicación a cada elevador dentro de la sala de pruebas. Separe los elevadores configurados para recibir diferentes estímulos contextuales (es decir, olores) por un mínimo de 2 m para evitar variables de confusión.
NOTA: Cada ratón debe tener un lugar de prueba asignado dentro de la sala de pruebas y en los elevadores físicos tanto como sea posible para evitar el desarrollo de asociaciones entre diferentes ubicaciones y estímulos termogénicos. - Usando bandas magnéticas, coloque láminas quirúrgicas o batas a través de los elevadores, creando una barrera visual entre el investigador y los sujetos de prueba. Establezca esta barrera para minimizar los cambios de temperatura resultantes de la actividad del ratón al ver a los experimentadores moviéndose hacia la jaula o alrededor de la sala de pruebas.
- (Opcional) Coloque espejos en la superficie debajo de los elevadores para facilitar la visualización del fondo de la jaula durante la prueba.
NOTA: Los elevadores se pueden desinfectar a través de un sistema de lavado de jaula. La tela o las sábanas quirúrgicas deben lavarse antes de la habituación y las pruebas.
- Asigne una ubicación a cada elevador dentro de la sala de pruebas. Separe los elevadores configurados para recibir diferentes estímulos contextuales (es decir, olores) por un mínimo de 2 m para evitar variables de confusión.
- Preparación de bolas de té
- Preparar bolas de té con control y toallas PO (aproximadamente 5 cm x 5 cm). Para evitar la contaminación cruzada, prepare primero bolas de té de control de olor.
NOTA: Las toallas con olor a depredador deben someterse a pruebas de patógenos antes de su uso. Estas toallas también deben estar contenidas, y los materiales que interactúan con ellas deben desinfectarse inmediatamente (es decir, lavar la jaula), evitando la exposición del olor a otros animales.
- Preparar bolas de té con control y toallas PO (aproximadamente 5 cm x 5 cm). Para evitar la contaminación cruzada, prepare primero bolas de té de control de olor.
6. Prueba de temperatura - jaula doméstica
NOTA: Los animales deben estar habituados a todo el procedimiento de prueba, excluyendo los estímulos contextuales o farmacológicos experimentales. Esto debe completarse un mínimo de 4 veces antes de la prueba.
- Transfiera los animales a la sala de pruebas preparada. Coloque a los animales en un lugar preasignado en el elevador. Esta ubicación debe ser la misma en todos los procedimientos de habituación y prueba.
- Retire la "bola de la jaula casera" de la jaula casera del ratón y vuelva a cubrir las jaulas con un paño o una sábana quirúrgica. Permita que los ratones se aclimaten al espacio de prueba durante 1-2 h.
- Una vez completada la aclimatación, utilice el escáner para medir y registrar la temperatura de referencia de cada sujeto. Evite manipular los revestimientos de tela durante las mediciones.
NOTA: Los agentes farmacológicos se pueden aplicar aquí. El tiempo de espera posterior a la inyección o la aplicación se puede agregar según sea necesario antes de la prueba. Se recomienda registrar una línea de base secundaria directamente antes de la prueba después de la adición de un agente farmacológico para monitorear la respuesta a los estímulos farmacológicos. Si no se está probando la respuesta al olor, las mediciones de temperatura de los ratones pueden comenzar directamente después de la inyección. La aleatorización debe emplearse al proporcionar cualquier estímulo. - Destape la jaula y coloque la bola de té (control o PO) en el piso de la jaula doméstica. Reemplace la tapa de la jaula y la cubierta de tela.
- Comience el cronómetro. Mida las temperaturas de los sujetos de prueba en el mismo orden de colocación de la bola de té. Registre las temperaturas y el tiempo de reloj de las mediciones siguiendo los puntos de tiempo deseados.
- Cuando se complete el experimento, retire la bola de tratamiento. Coloque los ratones que recibieron PO en una nueva jaula doméstica con la "bola de jaula casera" original. Devuelva la "bola de jaula casera" a la jaula de los ratones que recibieron olor de control. Transfiera los ratones a la ubicación de la vivienda.
NOTA: El procedimiento anterior se puede traducir a modelos de ratas dentro de jaulas de tamaño apropiado. Es posible que se requieran ajustes a las mediciones sugeridas en la Figura 1C para permitir un mejor acceso al fondo de la jaula doméstica.
Figura 1: Transpondedores y pruebas de temperatura de jaulas domésticas . (A) Diagrama de colocación unilateral del transpondedor para probar la temperatura en un gastrocnemio de ratón. Una vez programado y colocado, el transpondedor-lector (DAS-8027-IUS, mostrado) se puede utilizar para medir la temperatura. (B) Izquierda, foto de una bola de té de acero inoxidable de malla abierta y una toalla de 5 cm x 5 cm. Derecha, bola de té cerrada, utilizada para sostener toallas de habituación y olor en las pruebas de jaula caseras. (C) Esquema de elevadores construidos con tuberías de PVC para pruebas de jaulas domésticas. (D) Flujo de trabajo del protocolo de prueba de jaulas en el hogar. (E) Imágenes de las instalaciones del área de prueba de jaulas domésticas. A la izquierda, cuatro jaulas para ratones encima de un elevador. Las tiras magnéticas se encuentran en la pared adyacente, y los imanes y la tela quirúrgica están sobre la mesa. Derecha, jaulas de ratón cubiertas en elevadores. (A), (C) y (D) fueron creados con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
7. Prueba de temperatura - caminar en cinta rodante
- Asigne a cada animal una cinta de correr como su ubicación asignada para los procedimientos de habituación y prueba.
- Prepare las cintas de correr para las pruebas, asegurándose de que los amortiguadores sean funcionales.
NOTA: Para caminar en cinta rodante, las cintas de correr deben ajustarse al ritmo más bajo disponible que promueva el movimiento continuo, pero no correr tanto para la habituación como para las pruebas. Para la cinta de correr metabólica cerrada modular 1012M-2, esto es de 5,2 m / min para ratones y 7 m / min para ratas. Este ritmo puede necesitar ser ajustado en función de la obesidad del sujeto. Los shockers deben ajustarse a una intensidad y tasa de repetición de 5.0. - Habituación
- Mueva los ratones a la sala de pruebas. Permita que los ratones de 1 a 2 h se aclimaten a la transferencia de la habitación en sus jaulas domésticas.
- Después de la aclimatación, guíe a los ratones a la apertura de su cinta de correr asignada y cierre la cinta de correr. Encienda el cinturón, el amortiguador y el cronómetro.
- Permita que los ratones caminen en las cintas de correr durante 15 minutos, utilizando el estímulo de choque como motivación para el movimiento. Detenga la prueba inmediatamente si un animal permanece en un choque activo durante un período prolongado.
- Después de la prueba, retire los ratones y devuélvalos a las jaulas domésticas.
- Limpie las cintas de correr con detergente líquido y agua.
- Ensayo
- Mueva los ratones a la sala de pruebas. Permita que los ratones 1-2 h se aclimaten a la transferencia de la habitación en sus jaulas domésticas.
- Mida y registre la temperatura de referencia antes de mover el mouse a la cinta de correr.
NOTA: Para pruebas que incluyan agentes farmacológicos, aplíquelos o inyéctese aquí, siguiendo el esquema que se muestra en la Figura 2A. El tiempo de espera después de la inyección se puede agregar según sea necesario antes de colocar los ratones en la cinta de correr. La aleatorización debe emplearse al proporcionar cualquier estímulo. - Coloque cuadrados de 5 cm x 5 cm de toallas de control o PO dentro de la cinta de correr más cercana a la parte delantera de la cinta de correr. Adhiera las toallas al techo de la cinta de correr o debajo para facilitar su colocación y extracción.
- Guíe a los ratones a la cinta de correr asignada. Encienda la correa de la cinta de correr y el amortiguador.
- Inicie el cronómetro. Tome medidas de los sujetos de prueba en el mismo orden en que los ratones se instalaron en las cintas de correr. Registre las temperaturas y la hora del reloj de las mediciones siguiendo los puntos de tiempo deseados.
NOTA: La temperatura se puede medir de manera confiable desde fuera de la cinta mientras un ratón está dentro de una cinta de correr cerrada durante la actividad de caminar. Para las ratas, el tamaño de la cinta de correr y las limitaciones de distancia del transpondedor-lector pueden requerir que un experimentador mantenga abierta la parte posterior de la cinta de correr para insertar el lector dentro de la cinta de correr, más cerca del sujeto. - Cuando se complete la prueba, apague los amortiguadores y las cintas de correr; Devuelva a los ratones a sus jaulas domésticas. Transfiera los ratones a la ubicación de la vivienda.
- Limpie las cintas de correr con detergente líquido y agua, prestando especial atención a eliminar cualquier PO residual.
- Cuando se completen los experimentos, eutanasia a los animales (por ejemplo, usando la inhalación deCO2 ) y confirme visualmente la ubicación del transpondedor.
Figura 2: Pruebas de temperatura controlada por actividad. (A) Flujo de trabajo de pruebas de temperatura controladas por actividad con un agente farmacológico utilizando caminata en cinta rodante. (B) Imágenes de las instalaciones de las cintas de correr. A la izquierda, una imagen de la configuración completa del equipo. A la derecha, una imagen más cercana de cintas de correr individuales y chocadores. (A) fue creado con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Los transpondedores se implantaron unilateralmente en el gastrocnemio derecho de diez ratones de tipo salvaje (WT) de 4-6 meses de edad criados a partir de la cepa SF1-Cre (Tg (Nr5a1-cre) 7Lowl / J, cepa # 012462, C57BL / 6J y fondos FVB; hembra N = 5; macho N = 5). Después de la recuperación, los ratones se habituaron a un procedimiento de prueba de temperatura en jaula en el hogar que no incluía un estímulo contextual (por ejemplo, PO). Las mediciones de temperatura con una varita de transpondedor se registraron dentro de su habitación de alojamiento y después de la transferencia al lugar de prueba. A los ratones se les dio 1-2 h para aclimatarse a la sala de pruebas y la ubicación. Al finalizar la aclimatación, se registraron mediciones basales y consecutivas durante 1 h para cada ratón. Este procedimiento se completó cuatro veces.
En general, no se observaron diferencias de sexo. Las temperaturas musculares aumentaron significativamente después de que los ratones fueron trasladados a la sala de pruebas, luego disminuyeron en la medición de referencia después de pasar 60 minutos en el contexto de prueba. El análisis de sexo combinado del ensayo 4 no mostró diferencias significativas entre las mediciones de temperatura "antes del movimiento" y "línea de base" (prueba t pareada de dos colas, p > 0,10), mostrando la efectividad de la aclimatación de 1 h al contexto de prueba. Además, la comparación estadística de las temperaturas al inicio y 60 min mostró una disminución significativa de la temperatura (prueba t pareada de dos colas, p < 0,01), proporcionando evidencia de que los ratones se habituaron al movimiento del investigador durante la medición. Sin embargo, las mujeres (pero no los hombres) mostraron respuestas incrementales donde la temperatura medida de 5 min a 15 min fue menor con sucesivos ensayos de habituación (Figura 3). Al observar los efectos agudos del movimiento o el aumento de la temperatura después de la línea de base, los ratones tienden a responder menos al transporte a la sala de pruebas durante los sucesivos ensayos de habituación (Archivo complementario 1, análisis del ensayo).
Los ratones WT adultos habituados descritos anteriormente se probaron con Oxt, un agente farmacológico. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales (i.p., 2 mg / kg) de Oxt o vehículo (solución salina estéril) en un orden aleatorio, y las temperaturas musculares se midieron antes del movimiento a la sala de pruebas y después de 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 y 180 min de inyección. Cada ratón recibió ambos tratamientos. Un análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA) reveló efectos principales significativos de Oxt y tiempo, donde Oxt disminuyó la temperatura muscular en relación con el vehículo. Oxt disminuyó la temperatura muscular en relación con la línea de base tan rápidamente como 5 min después de la inyección, con una disminución máxima observada 30 min después de la inyección (Figura 4). Las temperaturas musculares se normalizaron 60 min después de la inyección de Oxt (prueba t pareada de dos colas, p > 0,10).
Las ratas Sprague-Dawley macho adultas (N = 4, edad ~ 6 meses) implantadas bilateralmente con transpondedores en el gastrocnemio se habituaron y luego se probaron en una jaula casera con un estímulo PO (olor a hurón). Se registraron las mediciones basales y a cada rata se le presentó PO en forma de toalla. El olor se eliminó después de 10 minutos de exposición; Se tomaron mediciones consecutivas antes y después de la eliminación del estímulo. Estos datos preliminares (Figura 5) sugieren que la PO tiene un impacto continuo en la termogénesis del músculo esquelético después de la eliminación del estímulo.
Los datos publicados anteriormente evaluaron la activación de la amenaza depredadora de la termogénesis del músculo esquelético en ratas Sprague-Dawley macho adultas (edad ~ 6 meses)8. Las ratas con transpondedores gastrocnemios bilaterales implantados se presentaron con olor a depredador (hurón). Las mediciones se tomaron en una jaula domiciliaria (N = 8, Figura 6A). Estos datos revelaron un aumento robusto de la temperatura en comparación con los olores de control. Para analizar las respuestas termogénicas aversivas o estresantes al olor a hurón, a las ratas macho (N = 7, Figura 6B) se les presentó un olor aversivo (ácido butírico), un olor nuevo (2-metilbenzoxazol) o un olor a zorro, o se les restringió durante 1 minuto antes de la prueba (estrés moderado). Las mediciones se tomaron en una jaula domiciliaria durante un período de 2 horas. El análisis de estos datos mostró que el olor a hurón produce y mantiene un fuerte cambio en la termogénesis en comparación con todas las demás condiciones. Juntos, estos datos proporcionan evidencia de la influencia mínima y transitoria del olor de control en la termogénesis del músculo esquelético.
Figura 3: Análisis de la temperatura muscular durante la habituación para las pruebas de temperatura de la jaula en el hogar. Los ratones implantados unilateralmente con transpondedores en el gastrocnemio derecho se habituaron al procedimiento de prueba. Los ratones se midieron en la sala de alojamiento de animales, "Before Move", en la sala de pruebas, "After Move", después de la aclimatación durante 1-2 h, "Baseline", luego consecutivamente durante 1 h. Todas las comparaciones estadísticas mostradas se realizaron entre el ensayo 1 y el ensayo 4, * p < 0,05, ** p < 0,01 (prueba t, N = 10); † p < 0,05, †† p < 0,01, ‡ p < 0,001 ensayo de efectos principales (ANOVA, N [ensayos] = 4). Las barras de error mostradas muestran el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Temperatura muscular durante la estimulación farmacológica de oxitocina en ratones. Los ratones habituados, implantados unilateralmente con transpondedores, recibieron 2 mg / kg (i.p.) de oxitocina o vehículo (solución salina estéril). Se observaron disminuciones significativas en la temperatura muscular a los 5 min después de la inyección de oxitocina y se normalizaron a los 60 min, ** p < 0,01, *** p < 0,001 (prueba t pareada de dos colas, N = 9). Las barras de error mostradas muestran el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Termogénesis con olor a depredador en pruebas de temperatura de jaulas caseras de ratas. Mediciones de temperatura en ratas con transpondedores implantados bilateralmente en el gastrocnemio después de la exposición al olor a depredador (hurón) durante 10 min. Después de la exposición durante 10 minutos, se retiraron las toallas que contenían el estímulo, como lo indica la flecha. Las ratas mantuvieron el aumento de la temperatura 20 minutos después de la eliminación del estímulo. Significativamente mayor que la temperatura basal, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 (prueba t, N = 4). Las barras de error mostradas muestran el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: El olor a hurón induce un rápido aumento de la temperatura muscular en comparación con el control. (A) La temperatura de Gastrocnemius se elevó significativamente después del olor del depredador (hurón) en comparación con la exposición de control en ratas macho (prueba t pareada de dos colas, N = 8). (B) Los olores nuevos, aversivos o de zorro no cambiaron significativamente la temperatura muscular en comparación con el control. El cambio de temperatura inducido por el estrés moderado disminuyó rápidamente después de 5 min. El olor a hurón mantuvo una respuesta robusta, en comparación con otras condiciones, durante la totalidad de la prueba (ANOVA, N = 7). † p < 0,05, olor a hurón > todas las demás condiciones; * P < 0,025, punto de comparación entre olor a hurón y estrés moderado vs. olor control. Esta cifra fue modificada con permiso de Gorrell et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: R markdown para el análisis de habituación de la Figura 3 . El archivo Markdown para el análisis de habituación con código R muestra ejemplos de métodos de codificación y formas en que se puede sondear el sexo dentro de los datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este protocolo de prueba de temperatura proporciona al campo una vía para medir directamente la termogénesis del músculo esquelético. Esto es crítico a medida que la investigación profundiza en la identificación de los mecanismos subyacentes a la termogénesis muscular33. El método proporciona dos protocolos rentables para medir la termogénesis del músculo esquelético en condiciones contextuales y farmacológicas. Este protocolo enfatiza la importancia tanto de la habituación como de la aclimatación dentro de estos procedimientos. La habituación se utiliza para introducir repetidamente al sujeto de prueba en el procedimiento de prueba sin la introducción de ningún estímulo farmacológico o contextual; Es un componente crítico de las pruebas de temperatura de la jaula doméstica y la cinta de correr. Esto da tiempo para que los animales se familiaricen con el medio ambiente mientras disminuyen la prominencia del contexto experimental. Omitir este paso puede conducir a asociaciones sesgadas con el estímulo experimental, así como a respuestas termogénicas elevadas a los estímulos de control8. Los animales deben aprender el procedimiento para reducir las respuestas de estrés al movimiento general y la manipulación requerida para probar a los animales bajo estos protocolos. Los datos de ejemplo recopilados proporcionan evidencia de la necesidad de habituación repetida (Figura 3). En un esfuerzo similar, la aclimatación el día de la prueba es necesaria para cada prueba. La aclimatación es una herramienta de asimilación diaria, que da a los animales tiempo para relajarse de los factores estresantes de la translocación a la sala de pruebas. Omitir la aclimatación puede proporcionar mediciones de temperatura de referencia inexactas, interactuando con cualquier evaluación posterior.
Aquí, se utilizaron mediciones termogénicas musculares para demostrar el efecto hipotérmico de Oxt intraperitoneal en ratones. Este resultado fue sorprendente considerando la evidencia que apoya el papel de Oxt central en la termogénesis y, específicamente, en la hipertermia social11,13. Otros, sin embargo, han demostrado la capacidad tanto de Oxt como de la vasopresina para suprimir la temperatura central junto con la frecuencia cardíaca en ratas, efectos mediados por el receptor Avpr1a34. Esta aparente paradoja no se ha reconciliado. Es posible que la capacidad de Oxt para aumentar o disminuir la temperatura en diferentes contextos pueda provenir de la acción central versus periférica de Oxt o de la duración de la exposición 13,35,36,37. En cualquier caso, aquí demostramos que la temperatura muscular del ratón muestra una disminución considerable de la temperatura rápidamente después de la inyección periférica de Oxt (Figura 4), consistente con los cambios en la temperatura central de la rata reportados por Hicks et al. (2014)33.
De acuerdo con la expectativa del Instituto Nacional de Salud (NIH) de que los investigadores tengan en cuenta el sexo como una variable biológica, la termogénesis muscular se mide en machos y hembras tanto en ratones como en ratas. Los datos de termogénesis de machos y hembras pueden compararse, aunque estudios anteriores y actuales no han logrado identificar diferencias sexuales sólidas en la termogénesis contextual y la variación a lo largo del ciclo estral en ratas hembra8. Una excepción es la evidente diferencia de sexo en la temperatura muscular al inicio y después del transporte al área de prueba, particularmente antes de la habituación8. Esto puede deberse a diferencias en la locomoción después del transporte, ya que las ratas hembras tienen una mayor respuesta locomotora a algunos estímulos estresantes en comparación con los machos, separable de las medidas de ansiedad subyacentes38. Esto subraya la necesidad de una habituación repetida al contexto experimental, en este caso, para evitar tergiversar una diferencia de sexo en la termogénesis que puede atribuirse al estímulo experimental en lugar de las diferencias subyacentes en la respuesta al estrés.
El método principal de prueba de temperatura dentro de las jaulas domésticas de animales tiene algunas limitaciones, una de ellas es el control de niveles de actividad variables. Esto puede ser crítico ya que el aumento de la actividad conduce a un aumento de la temperatura muscular. Para abordar esto, se ha descrito un procedimiento para ratones y ratas que caminan en la cinta rodante. Controlar el movimiento del animal minimiza el potencial de un efecto de actividad sobre la temperatura, teniendo en cuenta las diferencias en la termogénesis contráctil. Si bien caminar en cinta rodante se puede completar como una prueba individual, este método se puede usar junto con la evaluación de la temperatura de la jaula en el hogar. El análisis combinado proporciona evidencia adicional para las afirmaciones de que los cambios en la temperatura del músculo esquelético provienen de estímulos farmacológicos o contextuales y no secundariamente de cambios en la actividad resultantes de estos estímulos 8,14,15. Además, este método es limitado en el sentido de que es ligeramente invasivo, lo que no satisface la necesidad de algunos estudios de investigación. Sin embargo, este método solo requiere una sola cirugía, lo que permite a los investigadores evitar la manipulación continua de animales durante las pruebas mientras se mantiene la especificidad de las mediciones. Además, el tamaño actualmente disponible del transpondedor IPTT-300 no permite que el transpondedor se coloque directamente dentro del gastrocnemio de un ratón. Esto se puede completar dentro de los modelos de ratas debido a su mayor tamaño. Este método proporciona un mecanismo de medición adyacente al músculo de interés; Sin embargo, las versiones remodeladas o más pequeñas de transpondedores capaces de medir la temperatura serían un gran activo para el campo y los estudios futuros.
El amplio uso del método descrito en nuestro programa de investigación nos ha dado la oportunidad de manejar la varianza en respuesta a los procedimientos de implantación y prueba del transpondedor 8,10,14,15. Después de la implantación del transpondedor, se recomienda controlar las temperaturas de los animales inmediatamente después de la cirugía y durante la recuperación. Si bien esto primero da una idea de la salud del animal (por ejemplo, temperatura extrañamente baja como un signo de enfermedad o muerte inminente), también proporciona evidencia de que el transpondedor aún está activo y asegurado en su lugar. Una rata o un ratón pueden rascarse en el lugar de la incisión, lo que puede provocar que el transpondedor se caiga parcial o completamente. De acuerdo con las directrices institucionales, esta cirugía se considera menor. Por lo tanto, en casos de colocación unilateral del transpondedor, si un ratón pierde su transpondedor o si el transpondedor del ratón ya no funciona, la cirugía puede repetirse en una extremidad alternativa. Se recomienda una marca (es decir, identificación de la nueva colocación, o "R" para el reemplazo) para indicar esta cirugía repetida observada durante la programación del transpondedor como parte del nombre de identificación del animal. Además, dado que los animales tienen libertad para su jaula, los investigadores pueden tener dificultades para encontrar al animal para tomar la lectura. Se sugiere que los investigadores utilicen la fase de habituación para practicar mediciones y evaluar su configuración. Las alteraciones pueden incluir aumentar el número de experimentadores y escáneres de transpondedor o disminuir el número de elevadores y, por lo tanto, animales probados en cada ensayo.
Este protocolo proporciona instrucciones para la medición directa de la temperatura del músculo sin análisis de software adicional, lo que resulta en una vía factible y de costo relativamente bajo para estudios donde normalmente se usan cámaras infrarrojas. Además, este procedimiento permite la recolección de datos que cierran la brecha observada por algunos estudios que buscan conectar cambios genéticos o proteicos con la termogénesis muscular37. Con todo, el aumento del interés en la termogénesis muscular y sus mecanismos se ve facilitado por la evaluación directa del calor generado en el músculo objetivo. El procedimiento descrito aborda directamente este vacío metodológico dentro del campo al proporcionar un mecanismo para estudiar el músculo esquelético de ratones y ratas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo es compatible con R15 DK097644 y R15 DK108668. Agradecemos al Dr. Chaitanya K Gavini y a la Dra. Megan Rich por sus contribuciones anteriores y al Dr. Stanley Dannemiller por garantizar nuestro cumplimiento con las pautas institucionales de uso de animales. Un agradecimiento especial al Dr. Tim Bartness por proporcionar la investigación fundamental necesaria para construir este método y sus estudios asociados. Las figuras 1A, C, D y 2A se crearon utilizando Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter | BrassCraft | ||
| 1 mL Syringes | Fisher Scientific | BD 309659 | |
| Betadine Swabs | Fisher Scientific | 19-898-945 | |
| Booster Coil | BioMedic Data Systems | Transponder Accessory | |
| Electric Clippers | Andis | 40 Ultraedge Clipper Blade | |
| Flexible Mirror Sheets | Amazon | Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles | |
| Forceps | Fisher Scientific | 89259-940 | |
| Heating Pad | |||
| Induction Chamber (isoflurane) | Kent Scientific | VetFlo-0730 | 3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers |
| Ketoprophen | Med-Vet Intl. | RXKETO-50 | |
| Magnetic Strips | Amazon | ||
| Magnets | Amazon | DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs | |
| Needles | Med-Vet Intl. | 26400 | |
| Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g | Med-Vet Intl. | RXNPB-HC | |
| Oasis Absorbable Suture | Med-Vet Intl. | MV-H821-V | |
| Predator (Ferret) Odor Towels | Marshall BioResources | ||
| PVC pipe | |||
| Reflex Wound Clip Remover | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | ||
| Srerile Autoclip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (mouse) | |
| Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser | Amazon | ||
| Sterile Autoclip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (rat) | |
| Sterile Saline | Med-Vet Intl. | RX0.9NACL-10 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| Surgical Sheets | |||
| Towels (Control/Habituation) | Amazon | 100% Cotton Towels, white | |
| Transponders | BioMedic Data Systems | Model: IPTT-300 | |
| Transponders Reader | BioMedic Data Systems | Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R | |
| Versaclean | Fisher Scientific | 18-200-700 | liquid detergent |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 22-246-073 | |
| Wedge pieces for PVC pipe |
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