Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

Published: July 12, 2022 doi: 10.3791/64273
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1
1Cardiovascular Regeneration Program, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Cardiovascular Development Group, Department of Experimental Biology, University of Jaén, Jaén, 3Fundación Medina, Granada

Summary

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבית והדמיית עוברי עכבר המאפשר הדמיה תלת ממדית + זמן של תאי אב לבביים. ערכת כלי וידאו זו מתייחסת למיומנויות המפתח הנדרשות להדמיה חיה מוצלחת שאחרת קשה לרכוש מפרסומים של טקסט בלבד.

Abstract

השלבים הראשונים של התפתחות הלב מרמזים על שינויים דרסטיים בהתנהגות התאים ובהתמיינותם. בעוד ניתוח של עוברים קבועים מאפשר ללמוד בפירוט שלבים התפתחותיים ספציפיים בתמונת סטילס, הדמיה חיה לוכדת אירועים מורפוגנטיים דינמיים, כגון נדידת תאים, שינויי צורה והתמיינות, על ידי הדמיה של העובר תוך כדי התפתחותו. זה משלים ניתוח קבוע ומרחיב את ההבנה של איך איברים מתפתחים במהלך embryogenesis. למרות יתרונותיה, הדמיה חיה משמשת לעתים רחוקות במודלים של עכברים בגלל האתגרים הטכניים שלה. עוברי עכבר מוקדמים רגישים כאשר הם מתורבתים ex vivo ודורשים טיפול יעיל. כדי להקל על שימוש נרחב יותר בדימות חי במחקר התפתחותי של עכברים, מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט למיקרוסקופ חי של שני פוטונים המאפשר רכישה ארוכת טווח בעוברי עכברים. בנוסף לפרוטוקול, ניתנים טיפים על טיפול בעוברים ואופטימיזציה של תרבית. זה יעזור להבין אירועי מפתח באורגנוגנזה מוקדמת של עכברים, וישפר את ההבנה של ביולוגיה של אבות לב וכלי דם.

Introduction

הלב נוצר מוקדם במהלך האמבריוגנזה כדי להתחיל לשאוב חומרים מזינים לעובר כולו, בעוד הוא ממשיך להתפתח1. בעוברי עכברים, יום וחצי לאחר תחילת הגסטרולציה, איבר לב בסיסי מתכנס בקוטב הקדמי 2,3. בשלב הפס המוקדם (ES), אבות הלב באפיבלסט חודרים דרך הפס הפרימיטיבי לשכבה המזודרמלית המתהווה 4,5,6 ומתחילים לנדוד לקוטב הקדמי, שם הם מתמיינים ליצירת צינור הלב הפרימיטיבי. במהלך התהליך הזה, אבות לב מוקדמים עוברים סידור מחדש של תאים, שינוי צורה והתמיינות, בנוסף לנדידה7 (איור 1).

אבות לב מוקדמים משכו חוקרים במשך כמעט מאה שנה בשל יכולתם יוצאת הדופן להבדיל ולבנות איבר פונקציונלי בו זמנית. במהלך שני העשורים האחרונים, ניתוח שבטים ומודלים של נוקאאוט מותנה הראו כי התפתחות לב מוקדמת מסבכת מקורות תאים שונים בתהליך דינמי מאוד 8,9,10. אולם המבנה התלת-ממדי של צינור הלב הפרימיטיבי והאופי הדינמי של המורפוגנזה שלו הופכים אותו למאתגר למחקר (איור 1), ואנו רחוקים מלהבין את מלוא מורכבותו11.

כדי לחקור את התהליכים התאיים הדינמיים האלה, שיטות הדמיה חיה מציעות כעת פירוט חסר תקדים 7,12,13,14. במודל העכבר, גישות חיות היו המפתח לחקר נושאים התפתחותיים שקשה לטפל בהם באמצעות ניתוח סטטי 7,13,15. בעוד תרבית אקס ויו ארוכת טווח ומערכי מיקרוסקופ חזקים מתקדמים במהירות16,17, רק לחוקרים מעטים יש את המומחיות לצלם בהצלחה עוברים חיים. למרות שפרסומים מבוססי נייר מספקים מספיק פרטים טכניים כדי לשחזר ניסויי הדמיה חיים, קשה לתפוס כמה מיומנויות וטריקים ללא דוגמאות חזותיות או סיוע עמית לעמית. כדי להאיץ את תהליך הלמידה הזה ולהפיץ את השימוש בהדמיה חיה בין מעבדות, הרכבנו פרוטוקול וידאו (איור 2) שאוסף את הכישורים הדרושים לביצוע הדמיה חיה על עוברי עכברים מגרדים.

Figure 1
איור 1: התמיינות מוקדמת של תאי אב לבביים בעובר עכבר מתחילת הגסטרולציה ועד לשלב שקדם להיווצרות צינור הלב הפרימיטיבי. תאי אב לבביים חודרים למזודרם זמן קצר לאחר תחילת הגסטרולציה, נודדים לצד הנגדי של העובר. שלב היום המורפולוגי והיום העוברי (E) כתובים על גבי התרשימים. חצים מקווקווים מתארים את מסלול הנדידה של אבות צינור הלב הפרימיטיביים במהלך הגסטרולציה. נתון זה הותאםמ-11. קיצורים: ES = פס מוקדם; MS = פס אמצעי; EHF = קיפול ראש מוקדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דיאגרמת זרימת עבודה עבור הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל נהלי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים של CNIC, על ידי קהילת מדריד (סימוכין PROEX 220/15) ותאמו להנחיית האיחוד האירופי 2010/63EU ולהמלצה 2007/526/EC בנוגע להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות אחרות, שנאכפו בחוק הספרדי תחת צו אמיתי 1201/2005.

פרוטוקול זה כולל שימוש בשני זכרים מקו העכבר המהונדס הפלואורסצנטי המדווחים על פעילות NOTCH Tg(CBF:H2BVenus,+)18. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על חומרים, בעלי חיים וציוד המשמש בפרוטוקול זה.

1. כלים והתאמה אישית של המחזיק

  1. חותכים חתיכות חוט טונגסטן באורך 1 ס"מ ומחדדים אותן לקוטר 0.02-0.05 מ"מ בכל אחת מהשיטות הפשוטות הקיימות, למשל, השקעת קצה החוט בתמיסת נתרן ניטריט רווי19.
  2. הכינו נימי זכוכית עם מרפקים.
    1. מניחים את נקודת האמצע של נימי זכוכית סטנדרטיים בקוטר 1.0 מ"מ מעל מצית בונזן למשך 3-6 שניות, מושכים באיטיות משני הקצוות עד שהנימים הופכים דקים וגמישים. בשלב זה, שברו את הנימים לשניים וחממו אותו לזמן קצר כדי לייצר כיפוף של 90 מעלות 2 ס"מ מהקצה.
  3. ראיתי חתיכת פולימתיל מתקרילט באורך של כ-7 מ"מ, רוחב של 4 מ"מ ועובי של 2 מ"מ (איור 3D).
    הערה: יריעות פולימתיל מתקרילט ניתן להשיג מציוד מעבדה ממוחזר או להזמין חדש.
  4. החזיקו את חתיכת המתאקרילט באמצעות ויזת ספסל. לאחר מכן, קדחו חורים בגודל מותאם אישית באופן רוחבי דרך כל היצירה (איור 3D).
    הערה: בדרך כלל, עוברי עכבר E6.5 עד E7.5 דורשים שימוש במקדחות בקוטר 0.2-0.5 מ"מ.
    1. סובב את המקדחה באיטיות תוך הפעלת לחץ נמוך אך קבוע. אם מקדחה נשברת בתוך המחזיק, השליכו את היצירה, מכיוון שלא ניתן להוציא את המתכת.
  5. השתמשו בקובץ עדין כדי להחליק את קצות המחזיק ולהתאים את גודלו. בנוסף, צרו שיפוע מתון בשולי המחזיק כדי להקל על מיקום העובר (איור 3D).
  6. מניחים את המחזיק המוגמר בכלי עם מים מזוקקים כדי לשטוף אותו.
  7. בדוק את המחזיק מתחת לסטריאומיקרוסקופ כדי לראות אם החורים מכילים אבק קידוח. אם קיים אבק, השתמש במחטי טונגסטן כדי להסיר אותו.
  8. כדי לעקר את המחזיק, הניחו אותו בצינור חרוטי מלא במים מזוקקים וניקו אותו למשך 20 דקות עם תפוקת חשמל מינימלית של 20 ואט.

2. הכנת מדיה

  1. כדי להשבית בחום את מערכת המשלים, השאירו שני עלי 500 מיקרוליטר של סרום 20 חולדות מסחרי או ביתי בטמפרטורה של 56°C למשך30 דקות.
    הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט כיצד להכין נסיוב חולדות, ראה21.
  2. במכסה מנוע של תרבית תאים, הכינו שני אליציטוטים של המדיום לגידול העוברים במיקרוסקופ. עבור כל אחד מהם, ערבבו 490 μL של DMEM להדמיית תאים חיים, 500 μL של נסיוב חולדות בלתי פעיל ו-10 μL של פניצילין-סטרפטומיצין כדי לקבל ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין22.
    הערה: נפח מדיום התרבית תלוי בזמן ובמספר העוברים שיש לתרבת. ככלל אצבע, גדילה אופטימלית דורשת מינימום של 200 מיקרוליטר לעובר ליום בעוברי E7.0.
  3. באמצעות מזרק 2 מ"ל, מסננים את התווך דרך מסנן קרום בגודל נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר לתוך צינור חדש ומניחים אותו פתוח באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C ו-7% CO2 למשך שעה אחת לפני תרבית עוברים23.
  4. הכינו את מדיום הדיסקציה על ידי הוספה ל-500 מ"ל DMEM בתוספת בקבוק L-גלוטמין את הדברים הבאים: 50 מ"ל של סרום בקר עוברי, 10 מ"ל של 25 מ"ל HEPES-NaOH (pH 7.2), ו-10 מ"ל פניצילין וסטרפטומיצין (50 מ"ג/מ"ל).
  5. לאחר מכן, להפריד אותו לתוך 50 מ"ל aliquots, מניחים שלושה aliquots באמבטיה 37 ° C ולאחסן את השאר ב 4 ° C במשך עד 3 חודשים.

3. דיסקציה של עוברים

  1. הרדימו עכבר בהריון E6.75-E7.5.
  2. מוציאים את הרחם ומניחים אותו על מגבון נייר יבש ונקי. לאחר מכן, חותכים את הרחם, מכניסים את קצה המספריים העדינים מהצד המזומטריאלי ומחליקים את הלהב לאורך כדי לחשוף את המספריים ולהעביר אותם למדיום הדיסקציה. לפרוטוקול מפורט, ראה24.
  3. נתחו את העוברים, תוך שמירה על חרוט השליה האקטושאלי שלם (איור 3A,B). לשיטת דיסקציה מפורטת, עיין בסעיף25.
  4. לאחר מכן, קלפו את קרום רייכרט, והשאירו חלק ממנו על האזור החוץ-עוברי (איור 3B).
    הערה: מלקחיים עדינים חיוניים לשלב זה. משתמשים לא מנוסים יכולים לנתח עוברים על כלים מצופים ג'ל אגרוז 2% כדי להימנע מכיפוף קצות המלקחיים כנגד משטח הצלחת (איור 3C).
  5. כדי לשמור על חום בינוני של הדיסקציה, החליפו אותה כל 10 דקות. יתר על כן, לנתח deciduae בקבוצות של 3-4 תוך שמירה על השאר בינוני דיסקציה ממוקם באמבטיה 37 מעלות צלזיוס. הניחו מיד את העוברים המנותחים במדיום התרבית.
  6. בחרו את העוברים בעלי התכונות הפלואורסצנטיות הרצויות באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי והניחו אותם בצינור המכיל מדיום תרבית באינקובטור תרבית התא.
  7. אם העוברים נמצאים בשלבי E6.5 עד E7.0, סגרו את המכסה והשאירו את העוברים להתאושש במשך שעתיים לפני ההדמיה.
    הערה: עוברים E6.5 עד E7.0 הם רגישים. ניתן גם למקם אותם ישירות מתחת למיקרוסקופ, אך הטיפוח מאפשר לבחור את אלה שמתאוששים בצורה הטובה ביותר מדיסקציה, מה שמגדיל את סיכויי ההצלחה.

4. הכנת מיקרוסקופ

  1. הפעל את כל רכיבי המיקרוסקופ, כולל לייזרים, מחשב ותוכנה. הפעל את בקרי הטמפרטורה והגדר ל- 37 ° C 3 שעות מראש כדי להבטיח איזון.
  2. אם אתם משתמשים במטרה לזיהוי טבילה, נקו אותה באמצעות מגבון חד פעמי ללא שאריות. טובלים את קצה המטרה במים מזוקקים פעמיים באמצעות צלחת בקוטר 60 מ"מ ומשאירים אותה עד לתחילת הרכישה.
  3. הפעל את בקר CO2 והגדר אותו ל- 7%.
  4. הניחו טיפה של שומן סיליקון בוואקום גבוה על צלחת בקוטר 35 מ"מ עם תחתית מכסה זכוכית (קוטר 14 מ"מ), הניחו את המחזיק על גבי הטיפה ולחצו בעדינות כדי לשתק אותו.
  5. תחת סטריאומיקרוסקופ, הוסיפו מדיום תרבית כדי למלא את החלק התחתון של הזכוכית. תוך כדי כך, כוונו את הזרם אל חורי המחזיק כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בהם.
  6. אם הבועות נשארות, השתמשו בנימי הזכוכית שהוכנו בשלב 1.2, מחוברים לצינור סיליקון עם פייה, כדי למצוץ את הבועות החוצה בעדינות.
    הערה: קצה המרפק של הנימים יאפשר גישה דרך החורים.

5. הרכבת עוברים

  1. העברת 2-3 עוברים שנותרו להתאוששות באינקובטור לצלחת עם המחזיק. השאירו את השאר בחממה כגיבוי.
  2. הניחו את העוברים בחורים באמצעות זוג מלקחיים ומחט טונגסטן מחודדת. השתמש במחט כדי לחבר את העובר על ידי חרוט השליה ולהחדיר אותו לתוך חור תואם גודל. כדי לשתק את העובר, סובבו את החרוט ב-90-120° כך שהקרום של רייכטר ייצמד לדפנות החור (איור 3C). לקבלת תיאור חלופי, ראה26.
  3. העבירו בזהירות את הצלחת המכילה את העוברים ואת המחזיק לצלחת המיקרוסקופ (איור 3F,G).
    הערה: אם לא זז ביציבות, העובר יכול לצאת מהמחזיק.
  4. מנמיכים את המטרה עד להיווצרות מניסקוס נוזלי בממשק הבינוני-אובייקטיבי.
  5. אתרו את העובר באמצעות האור המועבר מתחת למשקפת המיקרוסקופ והניחו את העובר בפוקוס.
  6. הרכיבו את תא הדגירה ואטמו אותו סביב המטרה באמצעות סרט הדבקה (איור 3F).
  7. באמצעות לכידה חיה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, התאם את פלט הלייזר ואת רמות הרווח.
    הערה: עבור רכישה של שני פוטונים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וכתבי Tdtomato, נעשה שימוש ב-30% עוצמת לייזר ב-980 ננומטר ו-70% בעלייה בגלאים שלא עברו סריקה (איור 3G).
  8. כדי למנוע אידוי, מכסים את המדיום בשמן פרפין על ידי טפטוף איטי על המטרה.
    הערה: זוהי הנקודה האחרונה שבה ניתן להרכיב עוברים נוספים במחזיק. לאחר כיסוי בשמן פרפין, יש לנקות את המחזיק ולהחליף את המדיום כדי לעשות זאת. לשיטות הרכבה חלופיות ראה27.

6. רכישת תמונות

  1. הגדר הקלטה בהילוך מהיר. הגדר מרווח זמן של 5-10 דקות עם רווח z של 3-5 מיקרומטר בין ערימות. השאירו חלל ריק מעל ערימת ה-z כדי לצפות את גדילת העובר, מינימום של 50 מיקרומטר, והוסיפו 30 מיקרומטר עבור כל שעה שהרכישה לא תהיה תחת פיקוח.
  2. אם זמינה, הפעל את אפשרות השמירה האוטומטית כדי לאפשר פיקוח על הרכישה ממחשב אישי כדי לאפשר התאמה של גודל מחסנית z, במידת הצורך, כך שיתאים לתחום העניין שבמוקד.

Figure 3
איור 3: כלי הדמיה חיה והגדרה . (A) ניתוח עוברי עכברים בעזרת צלחת מצופה אגרוז מתחת לסטריאומיקרוסקופ. (B) דיאגרמה של השלבים לניתוח עוברי עכברים לצורך הדמיה חיה. (ג) מיקום העובר במחזיק. (ד) עיצוב מחזיק העובר ותכונותיו. (ו) תא אינקובטור סביב מטרת הטבילה. (G) דיאגרמה של ההגדרה הסופית לרכישת קיטועי זמן. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר (A). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השתמשנו בפרוטוקול כדי להמחיש את הפעלת איתות NOTCH באבות לב מוקדמים העומדים להתמיין לתאי אנדותל במהלך מורפוגנזה פרימיטיבית של צינור הלב. לשם כך, חצינו עכברי בר מסוג C57BL/6-N עם עכברי Tg (CBF:H2BVenus,+)18 כדי להשיג עוברים המדווחים על פעילות NOTCH באמצעות חלבון פלואורסצנטי צהוב נוגה. ב-E7.5, פלואורסצנטיות של ונוס קיימת בכל האקטודרם העצבי, עם כמה גרעינים חיוביים במזודרם הספלנצ'ני והחוץ-עוברי. לאחר 4 שעות, אבות אנדותל מפעילים את ונוס ומתכנסים ליצירת צינור הלב ואבי העורקים שמתחתיו, שהופכים למבנים סגורים לאחר 7 שעות (איור 4).

Figure 4
איור 4: התפתחות לב עובר שלם חי באמצעות הדמיה מולטיפוטית. נקודות זמן נבחרות מתוך סרטון קיטועי זמן של עובר עכבר CBF:H2BVenus+/- בשלב מוקדם של ניצן (E7.5). (A) מקטעים אופטיים של Brightfield. (B) רצועת גלאי 480-510 ננומטר המראה ביטוי חלבון פלואורסצנטי של נוגה. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. ראשי חץ צהובים מצביעים על התפתחות לומן ואבי העורקים האנדוקרדיאלי. השעה מצוינת ב- h:min בפינה השמאלית העליונה של כל תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אבות הלב המוקדמים מתארגנים בצינור לב פרימיטיבי שמתחיל לפעום בזמן שהוא עדיין נוצר. הבנת האופן שבו תהליך זה מתרחש היא המפתח לאיתור הספקטרום הרחב של מומי לב מולדים לאירועים מורפוגנטיים ספציפיים. לשם כך, הדמיה חיה מציעה הזדמנות לחקור התפתחות עוברית תקינה ופגומית ברזולוציה טמפורלית מוגברת. זה שימושי במיוחד לחקר תאי אב לבביים מוקדמים כשהם עוברים במהירות דרך התנהגויות התמיינות והגירה מרובות7.

מכיוון שאנו יכולים לחקור שלבים עובריים שונים בדגימה אחת, פרוטוקול ההדמיה החיה המוצג כאן יכול לשמש לאישוש האינטרפולציה של אירועים מורפוגנטיים שנחקרו באנליזה סטטית. זה יעזור להבין את רצף האירועים ההתפתחותיים באופן רציף. יתר על כן, ניתוח חי מניב נתונים רב-ממדיים, המאפשרים סיווג של סוגי תאים בדיוק חסר תקדים על ידי מדידת התנהגויות תאיות28.

למרות יתרונותיה, לשיטה המוצעת כאן יש כמה מגבלות. למרות שהעוברים יכולים להתפתח היטב עד 48 שעות בתוך המיקרוסקופ, אזור העניין נוטה לצאת מהמסגרת ברכישות ארוכות. כדי למנוע זאת, על המשתמש לבדוק באופן קבוע את הסחף של העובר במהלך תהליך הרכישה. למרות שקיימות מערכות אוטומטיות לתיקון מיקוד הדגימה12, לא ניתן ליישם אותן ברוב המיקרוסקופים הזמינים מסחרית. לחלופין, שני משתמשים או יותר יכולים לפקח ולהתאים בתורות את מסגרת העובר ואת הערימה, כך שרכישות ארוכות לא יהיו מאתגרות באותה מידה. עם זאת, יש לזכור כי רכישות ארוכות יש סיכוי לא מבוטל לכישלון, במיוחד עבור משתמשים לא מאומנים. נזק קל לעובר במהלך דיסקציה ומיקום לקוי במחזיק הם שניים מהגורמים העיקריים. כדי לשפר מיומנויות אלה, אפשר להתחיל בגידול עוברים רכובים באינקובטור לפני שמנסים ניסויי הדמיה חיים. בדרך זו, ניתן לבדוק אם עוברים מתפתחים כראוי לפני בזבוז משאבי מיקרוסקופיה.

לסיכום, שיטות הדמיה חיה פותחות אפיקים חדשים לחקר התפתחות עוברית. הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר לנתח בפירוט את מקורם של פנוטיפים בעוברים מוטנטיים או לבדוק את תפקודם של מסלולים מולקולריים ספציפיים באמצעות מניפולציה פרמקולוגית. בעזרת ערכת כלי וידאו זו, אנו שואפים להקל על השימוש הרחב בו לקראת הבנת המורכבות של אבות לב מוקדמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לד"ר קנזו איבנוביץ' על עבודתו הקודמת על שיטה זו ולקבוצתו של ד"ר שיגנורי נונקה (המכונים הלאומיים למדעי הטבע, יפן) על מתן המומחיות הראשונית בהרכבת עוברים. מחקר זה נתמך על ידי Grant PGC2018-096486-B-I00 מ-Ministerio de Ciencia e Innovación הספרדי ומענק H2020-MSCA-ITN-2016-722427 מתוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי ל-MT ומענק 1380918 מתוכנית ההפעלה FEDER Andalucía 2014-2020 ל-JND. MS נתמכה על ידי מלגת La Caixa Foundation PhD (LCF / BQ / DE18/11670014) ומלגת הנסיעות של חברת הביולוגים (DEVTF181145). CNIC נתמך על ידי משרד המדע הספרדי וקרן ProCNIC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#55 Forceps Dumont  11295-51
35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter Mattek P35G-1.5-14-C
35 mm vise table  Grandado SKU 8798771617573
50 mL tubes BD Falcon 352070
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 11966025  with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate
Fetal Bovine Serum Invitrogen 10438-026
Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+)  JAX
Fluorobrite DMEM ThermoFisher A1896701  DMEM for live-cell imaging
High-vacuum silicone grease Dow Corning Z273554-1EA
Holder for wires Perlen Pressen pwb1
LSM 780 Upright microscope Zeiss 
MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm Spectra-Physics
Non Descanned Detectors equipped with the filter sets
cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710)		 Zeiss 
Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance Zeiss 
P1000 and P200 pipettes
Paraffin Oil Nidacon VNI0049
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15070-063 (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin)
Petri dishes 35 mm x 10 mm BD Falcon 351008
Pipette tips
Polymethyl methacrylate  Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD Janvier Labs 9979
Set of 160 mm fines RS PRO 541-6933
Standard 1.0 mm glass capillaries Anima Lab  1B100F-3
Sterile 0.22 μm syringe filter Corning 431218
Sterile 5 mL syringe Fisher Scientific 15809152
Tungsten needles
Ultrasonic homogeniser (sonicator) Bandelin BASO_17021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
  2. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
  3. Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
  4. Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), Cambridge, England. 1631-1642 (1997).
  5. Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
  6. Lawson, K. A. Fate mapping the mouse embryo. International Journal of Developmental Biology. 43 (7), 773-775 (1999).
  7. Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
  8. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
  9. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
  10. Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
  11. Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
  12. McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
  13. Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
  14. Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
  15. Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
  16. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  17. Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
  18. Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
  19. Cold Spring Harbor Protocols. Sharpened tungsten needles. Cold Spring Harbor Protocols. , (2012).
  20. Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
  21. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
  22. Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
  23. González Hinojosa, F. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental. , Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021).
  24. Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , Cold Harbor Laboratory Press. 814 (2014).
  25. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
  26. Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
  27. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
  28. Crainiciuc, G., et al. Behavioural immune landscapes of inflammation. Nature. 601 (7893), 415-421 (2022).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 185
הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sendra, M., Mañes, J.,… More

Sendra, M., Mañes, J., Domínguez, J. N., Torres, M. Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo. J. Vis. Exp. (185), e64273, doi:10.3791/64273 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter