Summary
Vi presenterer en detaljert protokoll for museembryokultur og avbildning som muliggjør 3D + tidsavbildning av hjerteprogenitorceller. Dette videoverktøysettet tar for seg de viktigste ferdighetene som kreves for vellykket live bildebehandling, ellers vanskelig å skaffe seg fra tekstpublikasjoner.
Abstract
De første trinnene i hjerteutvikling innebærer drastiske endringer i celleadferd og differensiering. Mens analyse av faste embryoer gjør det mulig å studere i detalj spesifikke utviklingsstadier i et stillbilde, fanger levende bildebehandling dynamiske morfogenetiske hendelser, for eksempel cellemigrasjon, formendringer og differensiering, ved å avbilde embryoet når det utvikler seg. Dette utfyller fast analyse og utvider forståelsen av hvordan organer utvikler seg under embryogenese. Til tross for fordelene brukes levende bildebehandling sjelden i musemodeller på grunn av tekniske utfordringer. Tidlige museembryoer er følsomme når de dyrkes ex vivo og krever effektiv håndtering. For å legge til rette for en bredere bruk av levende bildebehandling i museutviklingsforskning, presenterer dette papiret en detaljert protokoll for to-foton levende mikroskopi som muliggjør langsiktig oppkjøp i museembryoer. I tillegg til protokollen gis tips om embryohåndtering og kulturoptimalisering. Dette vil bidra til å forstå viktige hendelser i tidlig museorganogenese, og øke forståelsen av kardiovaskulær stamcellebiologi.
Introduction
Hjertet dannes tidlig under embryogenesen for å begynne å pumpe næringsstoffer til hele embryoet, mens det fortsetter å utvikleseg 1. I museembryoer, en og en halv dag etter initiering av gastrulasjon, samles et rudimentært hjerteorgan ved den fremre polen 2,3. Ved tidlig strekstadium (ES) kommer hjerteprogenitorer i epiblastingressen gjennom den primitive streken til det gryende mesodermale laget 4,5,6 og begynner å migrere til den fremre polen, hvor de differensierer for å danne det primitive hjerterøret. Gjennom denne prosessen gjennomgår tidlige hjerteprogenitorer celleomorganiseringer, formtransformasjoner og differensiering, i tillegg til migrasjon7 (figur 1).
Tidlige hjerteprogenitorer har tiltrukket forskere i nesten et århundre på grunn av deres bemerkelsesverdige evne til å differensiere og bygge et funksjonelt organ samtidig. I løpet av de siste to tiårene har klonal analyse og betingede knockout-modeller vist at tidlig hjerteutvikling impliserer forskjellige cellekilder i en svært dynamisk prosess 8,9,10. 3D-strukturen til det primitive hjerterøret og den dynamiske naturen til dets morfogenese gjør det imidlertid utfordrende å studere (figur 1), og vi er langt fra å forstå dets fulle kompleksitet11.
For å studere disse dynamiske cellulære prosessene, tilbyr levende bildebehandlingsmetoder nå en enestående detalj 7,12,13,14. I musemodellen har levende tilnærminger vært nøkkelen til å undersøke utviklingstemaer som er vanskelige å ta opp ved statisk analyse 7,13,15. Mens langsiktig ex vivo-kultur og robuste mikroskopoppsett utvikler seg raskt16,17, har få forskere ekspertisen til å lykkes med å avbilde levende embryoer. Selv om papirbaserte publikasjoner gir nok tekniske detaljer til å reprodusere live bildebehandlingseksperimenter, er noen ferdigheter og triks vanskelig å forstå uten visuelle eksempler eller peer-to-peer assistanse. For å akselerere denne læringsprosessen og spre bruken av levende bildebehandling blant laboratorier, samlet vi en videoprotokoll (figur 2) som samler de nødvendige ferdighetene til å utføre levende bildebehandling på gastrulating museembryoer.
Figur 1 Tidlig differensiering av hjerteprogenitorceller i museembryoet fra debut av gastrulering til stadium forut for primitiv hjerterørsdannelse. Hjerteprogenitorceller kommer inn i mesodermen kort tid etter starten av gastruleringen, og migrerer til motsatt side av embryoet. Morfologisk og embryonal dag (E) stadium er skrevet på toppen av diagrammene. Stiplede piler skildrer migrasjonsbanen til primitive hjerterørprogenitorer under gastrulasjon. Dette tallet ble tilpasset fra11. Forkortelser: ES = tidlig strek; MS = Midt strek; EHF = tidlig hodefold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflytdiagram for levende avbildning av tidlige hjerteprogenitorer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble godkjent av CNIC Animal Experimentation Ethics Committee, av Madrid-regionen (referanse PROEX 220/15) og i samsvar med EU-direktiv 2010/63EU og anbefaling 2007/526 / EC om beskyttelse av dyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål, håndhevet i spansk lov under Real Decreto 1201/2005.
Denne protokollen inkluderer bruk av to hanner fra den fluorescerende transgene muselinjen som rapporterer NOTCH-aktivitet Tg(CBF:H2BVenus,+)18. Se materialfortegnelsen for detaljer om materialer, dyr og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Verktøy og tilpasning av innehaver
- Klipp 1 cm lange wolframtrådstykker og skjerp dem til 0,02-0,05 mm diameter ved hjelp av en av de enkle metodene som er tilgjengelige, for eksempel å senke spissen av ledningen i en mettet natriumnitrittløsning19.
- Forbered albuede glasskapillærer.
- Plasser midtpunktet på en standard 1,0 mm glasskapillær over en Bunsen-lighter i 3-6 s, trekk sakte fra begge ender til kapillæren blir tynn og fleksibel. På det tidspunktet deler du kapillæren i to og varmer den kort opp for å produsere en 90° bøy 2 cm fra spissen.
- Så et stykke polymetylmetakrylat som måler omtrent 7 mm langt, 4 mm bredt og 2 mm tykt (figur 3D).
MERK: Polymetylmetakrylatplater kan enten fås fra resirkulert laboratorieutstyr eller bestilles nytt. - Hold metakrylatstykket med en benkvise. Deretter bor du hull i tilpasset størrelse på tvers gjennom hele stykket (figur 3D).
MERK: Vanligvis krever E6.5 til E7.5 museembryoer bruk av 0,2-0,5 mm diameterbor.- Roter boret sakte mens du påfører lavt, men konstant trykk. Hvis en bor går i stykker inne i holderen, kast stykket, da metallet ikke kan tas ut.
- Bruk en fin fil til å jevne ut holderkantene og justere størrelsen. I tillegg må du lage en mild skråning på kantene av holderen for å lette embryoposisjonering (figur 3D).
- Legg den ferdige holderen i en tallerken med destillert vann for å skylle den.
- Sjekk holderen under stereomikroskopet for å se om hullene inneholder borestøv. Hvis støv er til stede, bruk wolfram nåler for å fjerne den.
- For å sterilisere holderen, plasser den i et konisk rør fullt av destillert vann og sonicate det i 20 minutter med minimum 20 W utgangseffekt.
2. Media forberedelse
- For å varmeinaktivere komplementsystemet, la to 500 μL alikoter kommersielt eller hjemmelaget 20 rotteserum stå ved 56 °C i30 minutter.
MERK: For en detaljert protokoll om hvordan du tilbereder rotteserum, se21. - I en cellekulturhette, lag to alikoter av mediet for dyrking av embryoene i mikroskopet. For hver, bland 490 μL DMEM for levende celleavbildning, 500 μL inaktivert rotteserum og 10 μL penicillin-streptomycin for å oppnå en endelig konsentrasjon på 50 μg / ml penicillin og 50 μg / ml streptomycin22.
MERK: Volumet av kulturmedium avhenger av tid og antall embryoer som skal dyrkes. Som en tommelfingerregel krever optimal vekst minimum 200 μL per embryo per dag i E7.0-embryoer. - Bruk en 2 ml sprøyte, filtrer mediet gjennom et 0,22 μm porestørrelse membranfilter i et nytt rør og legg det lokket åpent i en cellekulturinkubator ved 37 ° C og 7% CO2 i 1 time før embryokultur23.
- Forbered disseksjonsmediet ved å tilsette til en 500 ml DMEM supplert med L-glutaminflaske følgende: 50 ml føtal bovint serum, 10 ml 25 mM HEPES-NaOH (pH 7,2) og 10 ml penicillin og streptomycin (50 mg / ml).
- Del den deretter i 50 ml alikoter, legg tre alikoter i et bad på 37 °C og oppbevar resten ved 4 °C i opptil 3 måneder.
3. Embryo disseksjon
- Avlive en E6.75-E7.5 gravid mus.
- Trekk ut livmoren og legg den på en tørr og ren papirserviett. Deretter kutter du livmoren, setter inn spissen av fin saks fra den mesometriale siden og skyver bladet sammen for å eksponere deciduae og overføre dem til disseksjonsmediet. For en detaljert protokoll, se24.
- Dissekere embryoene, hold ektoplacentalkjeglen intakt (figur 3A,B). For en detaljert disseksjonsmetode, se25.
- Deretter fjerner du Reicherts membran, og etterlater en del av den på den ekstraembryonale regionen (figur 3B).
MERK: Fintang er avgjørende for dette trinnet. Uerfarne brukere kan dissekere embryoer på 2% agarosegelbelagte retter for å unngå å bøye tangens spisser mot oppvaskoverflaten (figur 3C). - For å holde disseksjonsmediet varmt, bytt det ut hvert 10. minutt. Dissekere deciduae i grupper på 3-4 mens resten holdes i disseksjonsmedium plassert i et 37 °C bad. Plasser straks de dissekerte embryoene i kulturmedium.
- Velg embryoene med de ønskede fluorescensfunksjonene ved hjelp av et fluorescensstereomikroskop og plasser dem i det rørholdige kulturmediet i cellekulturinkubatoren.
- Hvis embryoene er på E6.5 til E7.0 stadier, lukk lokket og la embryoene komme seg i 2 timer før avbildning.
MERK: Embryoer fra E6.5 til E7.0 er sensitive. De kan også plasseres direkte under mikroskopet, men preculturing gjør det mulig å velge de som best gjenoppretter fra disseksjon, noe som øker sjansen for suksess.
4. Forberedelse av mikroskop
- Slå på alle mikroskopkomponenter, inkludert lasere, datamaskiner og programvare. Slå på temperaturregulatorene og still inn på 37 °C 3 timer på forhånd for å sikre likevekt.
- Hvis du bruker et mål for nedsenkningsdeteksjon, rengjør du det med en restfri engangsserviett. Dypp spissen av målet i dobbeltdestillert vann med en 60 mm tallerken og la den stå til anskaffelsen starter.
- Slå på CO2-kontrolleren og sett den til 7%.
- Legg en dråpe høyvakuum silisiumfett på en 35 mm tallerken med glassdekselbunn (14 mm diameter), plasser holderen på toppen av dråpen, og trykk forsiktig for å immobilisere den.
- Under et stereomikroskop, legg til kulturmedium for å fylle glassbunndelen av fatet. Mens du gjør det, må du rette strømmen mot holderens hull for å forhindre dannelse av luftbobler i dem.
- Hvis boblene forblir, bruk glasskapillæren som ble klargjort i trinn 1.2, koblet til et silikonrør med et munnstykke, for å suge boblene forsiktig ut.
MERK: Den albuede enden av kapillæren vil lette tilgangen gjennom hullene.
5. Montering av embryo
- Overfør 2-3 embryoer som ble igjen for å gjenopprette i inkubatoren til parabolen med holderen. La resten ligge i inkubatoren som en sikkerhetskopi.
- Sett embryoene i hullene ved å bruke et par tang og en konisk wolframnål. Bruk nålen til å hekte embryoet ved ektoplacentalkeglen og sett det inn i et størrelsesmatchende hull. For å immobilisere embryoet, roter kjeglen 90-120° slik at Reichters membran fester seg til hullveggene (figur 3C). For en alternativ beskrivelse, se26.
- Flytt forsiktig fatet som inneholder embryoene og holderen til mikroskopplaten (figur 3F,G).
MERK: Hvis det ikke flyttes jevnt, kan embryoet bevege seg ut av holderen. - Senk målet til en flytende menisk dannes ved det middels objektive grensesnittet.
- Finn embryoet ved hjelp av overført lys under mikroskopets kikkert og plasser embryoet i fokus.
- Monter inkubasjonskammeret og forsegl det rundt målet ved hjelp av tape (figur 3F).
- Bruk en Live Capture på mikroskopkontrollprogramvaren, juster laserutgangs- og forsterkningsnivåene.
MERK: For to-foton oppkjøp av grønt fluorescerende protein (GFP) og Tdtomato-reportere ble 30% utgangslasereffekt ved 980 nm og 70% gevinst på ikke-skannede detektorer brukt i denne protokollen (figur 3G). - For å unngå fordampning, dekk mediet med parafinolje ved å dryppe det sakte på målet.
MERK: Dette er det siste punktet hvor flere embryoer kan monteres i holderen. Når det er dekket med parafinolje, må man rengjøre holderen og erstatte mediet for å gjøre det. For alternative monteringsmetoder, se27.
6. Oppkjøp av bilde
- Sett opp time-lapse-opptak. Sett et 5-10 min tidsintervall med 3-5 μm z-mellomrom mellom stablene. La det være et tomt område på toppen av z-stakken for å forutse embryovekst, minimum 50 μm, og legg til 30 μm for hver time oppkjøpet ikke vil bli overvåket.
- Hvis tilgjengelig, aktiver alternativet Automatisk lagring for å tillate tilsyn med anskaffelsen fra en personlig datamaskin for å tillate justering av z-stakkstørrelsen, om nødvendig, for å passe interesseområdet i fokus.
Figur 3: Live bildeverktøy og oppsett . (A) Dissekere museembryoer med en agarosebelagt tallerken under stereomikroskopet. (B) Diagram over trinnene for å dissekere museembryoer for levende avbildning. (C) Embryoplassering i holderen. (D) Embryoholderens design og egenskaper. (F) Inkubatorkammer rundt nedsenkingsmålet. (G) Diagram over endelig oppsett for time-lapse-anskaffelse. Skala bar = 500 μm (A). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukte protokollen til å visualisere NOTCH-signalaktivering hos tidlige hjerteprogenitorer som var i ferd med å differensiere til endotelceller under primitiv hjerterørmorfogenese. For det krysset vi villtype C57BL/6-N-mus med Tg (CBF: H2BVenus, +) mus18 for å oppnå embryoer som rapporterte NOTCH-aktivitet gjennom gult fluorescerende protein Venus. Ved E7.5 er Venus-fluorescens tilstede gjennom hele nevralektodermen, med noen få positive kjerner ved splanknisk og ekstraembryonisk mesoderm. Etter 4 timer aktiverer endotelprogenitorer Venus og samles for å danne endokardialrøret og underliggende aorta, som blir lukkede strukturer etter 7 timer (figur 4).
Figur 4: Utvikling av hele embryohjerter ved multifotonavbildning. Utvalgte tidspunkter fra en time-lapse-video av et CBF:H2BVenus+/- museembryo på tidlig knoppstadium (E7.5). (A) Optiske seksjoner i Brightfield. (B) 480-510 nm detektorbånd som viser Venus fluorescerende proteinuttrykk. Skalastenger = 100 μm. Gule pilspisser peker på det utviklende endokardiale lumen og aortaer. Tiden er angitt i h:min øverst til høyre i hvert bilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidlige hjerteprogenitorer organiserer seg i et primitivt hjerterør som begynner å slå mens det fortsatt dannes. Å forstå hvordan denne prosessen foregår er nøkkelen til å finne det brede spekteret av medfødte hjertefeil til spesifikke morfogenetiske hendelser. For det gir levende bildebehandling en mulighet til å studere normal og defekt embryonal utvikling med økt tidsmessig oppløsning. Dette er spesielt nyttig for å studere tidlige hjerteprogenitorceller da de overgår raskt gjennom flere differensierings- og migrasjonsatferd7.
Fordi vi kan studere forskjellige embryonale stadier i en enkelt prøve, kan den levende bildebehandlingsprotokollen som presenteres her, brukes til å bekrefte interpoleringen av morfogenetiske hendelser studert i statisk analyse. Dette vil bidra til å forstå sekvensen av utviklingshendelser på en kontinuerlig måte. Videre gir levende analyse flerdimensjonale data, noe som gjør det mulig å klassifisere celletyper med enestående presisjon ved å måle cellulær oppførsel28.
Til tross for fordelene har metoden som foreslås her noen begrensninger. Selv om embryoene kan utvikle seg godt opptil 48 timer inne i mikroskopet, har interesseområdet en tendens til å bevege seg ut av rammen i lange oppkjøp. For å forhindre at det skjer, må brukeren regelmessig sjekke driften av embryoet under oppkjøpsprosessen. Selv om det finnes automatiske systemer for å korrigere prøvefokus12, kan disse ikke implementeres i de fleste kommersielt tilgjengelige mikroskoper. Alternativt kan to eller flere brukere bytte på å overvåke og justere embryorammen og stabelen, slik at lange innsamlinger ikke blir like utfordrende. Det må imidlertid huskes at lange anskaffelser har en betydelig sjanse for å mislykkes, spesielt for utrente brukere. Mindre embryoskader under disseksjon og dårlig plassering i holderen er to av hovedårsakene. For å forbedre disse ferdighetene kan man starte med å dyrke monterte embryoer i inkubatoren før man prøver levende bildeeksperimenter. På den måten kan man teste om embryoer utvikler seg riktig før man bruker mikroskopiressurser.
Oppsummert åpner levende bildebehandlingsmetoder nye veier for å studere embryonal utvikling. Protokollen som presenteres her gjør det mulig å analysere i detalj opprinnelsen til fenotyper i mutante embryoer eller teste funksjonen til spesifikke molekylære veier gjennom farmakologisk manipulasjon. Med denne videoverktøykassen tar vi sikte på å legge til rette for bred bruk mot å forstå kompleksiteten til tidlige hjerteprogenitorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Dr. Kenzo Ivanovitch for tidligere arbeid med denne metoden og gruppen av Dr. Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Japan) for å gi den første ekspertisen på embryomontering. Denne studien ble støttet av Grant PGC2018-096486-B-I00 fra den spanske Ministerio de Ciencia e Innovación og Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 fra EU Horizon 2020-programmet til MT og Grant 1380918 fra FEDER Andalucía 2014-2020 Operating Program til JND. MS ble støttet av et La Caixa Foundation PhD-stipendiat (LCF / BQ / DE18 / 11670014) og The Company of Bioologists traveling fellowship (DEVTF181145). CNIC støttes av det spanske vitenskapsdepartementet og ProCNIC Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), Cambridge, England. 1631-1642 (1997).
- Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
- Lawson, K. A.
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
- Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
- McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
- Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
- Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
- Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
- Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- González Hinojosa, F. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental. , Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , Cold Harbor Laboratory Press. 814 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
- Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
- Crainiciuc, G., et al.
