Summary
Vi præsenterer en detaljeret protokol for museembryokultur og billeddannelse, der muliggør 3D + tidsbilleddannelse af hjertestamceller. Denne video-værktøjskasse omhandler de nøglefærdigheder, der kræves for vellykket live billedbehandling, der ellers er svært at erhverve fra tekst-only publikationer.
Abstract
De første trin i hjerteudvikling indebærer drastiske ændringer i celleadfærd og differentiering. Mens analyse af faste embryoner gør det muligt at studere detaljerede specifikke udviklingsstadier i et stillbillede, fanger levende billeddannelse dynamiske morfogenetiske begivenheder, såsom cellemigration, formændringer og differentiering, ved at afbilde embryoet, når det udvikler sig. Dette supplerer fast analyse og udvider forståelsen af, hvordan organer udvikler sig under embryogenese. På trods af sine fordele bruges live imaging sjældent i musemodeller på grund af dets tekniske udfordringer. Tidlige museembryoner er følsomme, når de dyrkes ex vivo og kræver effektiv håndtering. For at lette en bredere anvendelse af levende billeddannelse i museudviklingsforskning præsenterer dette papir en detaljeret protokol for to-foton levende mikroskopi, der muliggør langsigtet erhvervelse i museembryoner. Ud over protokollen gives der tip om embryohåndtering og kulturoptimering. Dette vil hjælpe med at forstå nøglehændelser i tidlig museorganogenese og forbedre forståelsen af kardiovaskulær stamfaderbiologi.
Introduction
Hjertet dannes tidligt under embryogenesen for at begynde at pumpe næringsstoffer til hele embryoet, mens det fortsætter med at udvikle1. I museembryoner, halvanden dag efter initiering af gastrulation, samles et rudimentært hjerteorgan ved den forreste pol 2,3. Ved tidlig streak (ES) -stadiet trænger hjerteforfædre i epiblasten gennem den primitive stribe til det spirende mesodermale lag 4,5,6 og begynder at migrere til den forreste pol, hvor de differentierer sig for at danne det primitive hjerterør. Gennem hele denne proces gennemgår tidlige hjerteforfædre celleomlægninger, formtransformationer og differentiering ud over migration7 (figur 1).
Tidlige hjerteforfædre har tiltrukket forskere i næsten et århundrede på grund af deres bemærkelsesværdige evne til at differentiere og opbygge et funktionelt organ samtidigt. I løbet af de sidste to årtier har klonal analyse og betingede knockout-modeller vist, at tidlig hjerteudvikling implicerer forskellige cellekilder i en meget dynamisk proces 8,9,10. Imidlertid gør 3D-strukturen af det primitive hjerterør og den dynamiske natur af dets morfogenese det udfordrende at studere (figur 1), og vi er langt fra at forstå dets fulde kompleksitet11.
For at studere disse dynamiske cellulære processer tilbyder live billeddannelsesmetoder nu en hidtil uset detalje 7,12,13,14. I musemodellen har levende tilgange været nøglen til at undersøge udviklingsmæssige emner, der er vanskelige at adressere ved statisk analyse 7,13,15. Mens langsigtet ex vivo-kultur og robuste mikroskopopsætninger skrider hurtigtfrem 16,17, har få forskere ekspertisen til med succes at afbilde levende embryoner. Selvom papirbaserede publikationer giver tilstrækkelige tekniske detaljer til at gengive levende billeddannelseseksperimenter, er nogle færdigheder og tricks svære at forstå uden visuelle eksempler eller peer-to-peer-hjælp. For at fremskynde denne læringsproces og sprede brugen af levende billeddannelse blandt laboratorier samlede vi en videoprotokol (figur 2), der samler de nødvendige færdigheder til at udføre levende billeddannelse på gastrulating af museembryoner.
Figur 1: Tidlig differentiering af hjertestamceller i museembryoet fra begyndelsen af gastrulation til stadiet forud for primitiv hjerterørsdannelse. Hjertestamceller trænger ind i mesodermen kort efter starten af gastrulation og migrerer til den modsatte side af embryoet. Morfologisk og embryonal dag (E) fase er skrevet oven på diagrammerne. Stiplede pile skildrer migrationsbanen for primitive hjerterørsforfædre under gastrulation. Dette tal blev tilpasset fra11. Forkortelser: ES = tidlig stribe; MS = mellemste stribe; EHF = tidlig hovedfoldning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Workflow diagram for live imaging af tidlige hjerte forfædre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af CNIC's etiske komité for dyreforsøg i Madrid-regionen (reference PROEX 220/15) og i overensstemmelse med EU-direktiv 2010/63EU og henstilling 2007/526/EF om beskyttelse af dyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål, håndhævet i spansk lovgivning i henhold til Real Decreto 1201/2005.
Denne protokol omfatter brugen af to hanner fra den fluorescerende transgene muselinje, der rapporterer NOTCH-aktivitet Tg(CBF:H2BVenus,+)18. Se materialetabellen for detaljer om materialer, dyr og udstyr, der anvendes i denne protokol.
1. Tilpasning af værktøjer og holder
- Skær 1 cm lange wolframtrådstykker og skærp dem til 0,02-0,05 mm diameter ved hjælp af en af de enkle tilgængelige metoder, for eksempel nedsænkning af spidsen af ledningen i en mættet natriumnitritopløsning19.
- Forbered albuede glaskapillærer.
- Placer midtpunktet af en standard 1,0 mm glaskapillær over en bunsenlighter i 3-6 sekunder, træk langsomt fra begge ender, indtil kapillæren bliver tynd og fleksibel. På det tidspunkt skal du bryde kapillæret i to og opvarme det kort for at producere en 90 ° bøjning 2 cm fra spidsen.
- Der blev savet et stykke polymethylmethacrylat, der måler ca. 7 mm i længden, 4 mm i bredden og 2 mm tykt (figur 3D).
BEMÆRK: Polymethylmethacrylatplader kan enten fås fra genanvendt laboratorieudstyr eller bestilles nye. - Hold methacrylatstykket ved hjælp af en bænkskruestik. Bor derefter huller i brugerdefineret størrelse på tværs gennem hele stykket (figur 3D).
BEMÆRK: E6.5 til E7.5 museembryoner kræver typisk brug af bor med en diameter på 0,2-0,5 mm.- Drej boret langsomt, mens du anvender lavt, men konstant tryk. Hvis et bor går i stykker inde i holderen, skal du kassere stykket, da metallet ikke kan tages ud.
- Brug en fin fil til at udjævne holderens kanter og justere dens størrelse. Derudover skal du skabe en mild hældning på holderens kanter for at lette embryopositionering (figur 3D).
- Læg den færdige holder i et fad med destilleret vand for at skylle den.
- Kontroller holderen under stereomikroskopet for at se, om hullerne indeholder borestøv. Hvis støv er til stede, skal du bruge wolframnåle til at fjerne det.
- For at sterilisere holderen skal du placere den i et konisk rør fuld af destilleret vand og sonikere det i 20 minutter med mindst 20 W effekt.
2. Forberedelse af medier
- For at varmeinaktivere komplementsystemet efterlades to 500 μL alikvoter kommercielt eller hjemmelavet 20 rotteserum ved 56 °C i30 minutter.
BEMÆRK: For en detaljeret protokol om, hvordan man tilbereder rotteserum, se21. - I en cellekulturhætte fremstilles to alikvoter af mediet til dyrkning af embryonerne i mikroskopet. For hver blandes 490 μL DMEM til levende cellebilleddannelse, 500 μL inaktiveret rotteserum og 10 μL penicillin-streptomycin for at opnå en slutkoncentration på 50 μg/ml penicillin og 50 μg/ml streptomycin22.
BEMÆRK: Mængden af dyrkningsmedium afhænger af tidspunktet og antallet af embryoner, der skal dyrkes. Som tommelfingerregel kræver optimal vækst minimum 200 μL pr. embryo pr. dag i E7.0-embryoner. - Brug en 2 ml sprøjte til at filtrere mediet gennem et 0,22 μm porestørrelsesmembranfilter i et nyt rør og anbring det med låg åbent i en cellekulturkuvøse ved 37 °C og 7% CO2 i 1 time før embryodyrkning23.
- Forbered dissektionsmediet ved at tilsætte følgende til en 500 ml DMEM suppleret med L-glutaminflaske: 50 ml føtalt bovint serum, 10 ml 25 ml HEPES-NaOH (pH 7,2) og 10 ml penicillin og streptomycin (50 mg / ml).
- Derefter adskilles det i 50 ml alikvoter, anbringes tre delprøver i et 37 °C bad og opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
3. Embryo dissektion
- Aflive en E6.75-E7.5 gravid mus.
- Udtræk livmoderen og læg den på en tør og ren papirserviet. Klip derefter livmoderen, indsæt spidsen af en fin saks fra den metriske side og skub bladet langs for at udsætte deciduae og overføre dem til dissektionsmediet. For en detaljeret protokol, se24.
- Disseker embryonerne, og hold ektoplacentalkeglen intakt (figur 3A, B). For en detaljeret dissektionsmetode henvises til25.
- Skræl derefter Reicherts membran af og efterlad en del af den på det ekstraembryonale område (figur 3B).
BEMÆRK: Finpincet er afgørende for dette trin. Uerfarne brugere kan dissekere embryoner på 2% agarose gelovertrukne skåle for at undgå at bøje tangens spidser mod skålens overflade (figur 3C). - For at holde dissektionsmediet varmt skal du udskifte det hvert 10. minut. Desuden dissekeres deciduae i grupper på 3-4, mens resten holdes i dissektionsmedium placeret i et 37 °C bad. Placer straks de dissekerede embryoner i dyrkningsmedium.
- Vælg embryonerne med de ønskede fluorescensegenskaber ved hjælp af et fluorescensstereomikroskop og placer dem i røret indeholdende kulturmedium i cellekulturinkubatoren.
- Hvis embryonerne er på E6.5 til E7.0 stadier, lukkes låget, og embryonerne lades komme sig i 2 timer, før de billeddannes.
BEMÆRK: E6.5 til E7.0 embryoner er følsomme. De kan også placeres direkte under mikroskopet, men prækulturering giver mulighed for udvælgelse af dem, der bedst kommer sig efter dissektion, hvilket øger chancen for succes.
4. Mikroskop forberedelse
- Tænd for alle mikroskopkomponenter, herunder lasere, computer og software. Tænd temperaturregulatorerne, og indstil dem til 37 °C 3 timer i forvejen for at sikre ligevægt.
- Hvis du bruger et nedsænkningsdetekteringsmål, skal du rengøre det med en engangsserviet uden rester. Dyp målets spids i dobbeltdestilleret vand med en 60 mm skål, og lad den stå, indtil erhvervelsen starter.
- Tænd CO2 -controlleren, og indstil den til 7%.
- Anbring en dråbe højvakuum siliciumfedt på en 35 mm skål med glasdæksel (14 mm diameter), placer holderen oven på dråben, og tryk forsigtigt for at immobilisere den.
- Under et stereomikroskop tilsættes kulturmedium for at fylde glasbunden af skålen. Mens du gør det, skal du rette strømmen mod holderens huller for at forhindre dannelse af luftbobler i dem.
- Hvis boblerne forbliver, skal du bruge glaskapillærrøret, der er fremstillet i trin 1.2, forbundet til et silikonerør med et mundstykke, til at suge boblerne forsigtigt ud.
BEMÆRK: Den albuede ende af kapillæret letter adgangen gennem hullerne.
5. Montering af embryoner
- Overfør 2-3 embryoner, der blev efterladt for at komme sig i inkubatoren til skålen med holderen. Lad resten være i inkubatoren som backup.
- Sæt embryonerne i hullerne ved hjælp af et par tang og en tilspidset wolframnål. Brug nålen til at koble embryoet ved ektoplacentakeglen og indsæt det i et størrelsesmatchende hul. For at immobilisere embryoet drejes keglen 90-120°, så Reichterens membran klæber til hulvæggene (figur 3C). For en alternativ beskrivelse, se26.
- Skålen med embryonerne og holderen flyttes forsigtigt til mikroskoppladen (figur 3F,G).
BEMÆRK: Hvis embryoet ikke flyttes støt, kan det bevæge sig ud af holderen. - Sænk målet, indtil der dannes en flydende menisk ved den mellemobjektive grænseflade.
- Find embryoet ved hjælp af transmitteret lys under mikroskopet kikkert, og placer embryoet i fokus.
- Monter inkubationskammeret og forsegl det omkring målet ved hjælp af tape (figur 3F).
- Brug en Live Capture på mikroskopets kontrolsoftware til at justere laseroutput- og forstærkningsniveauerne.
BEMÆRK: Til to-foton-erhvervelse af grønt fluorescerende protein (GFP) og Tdtomat-reportere blev 30% udgangslasereffekt ved 980 nm og 70% forstærkning på ikke-desscannede detektorer brugt i denne protokol (figur 3G). - For at undgå fordampning skal du dække mediet med paraffinolie ved at dryppe det langsomt på målet.
BEMÆRK: Dette er det sidste punkt, hvor yderligere embryoner kan monteres i holderen. Når den er dækket med paraffinolie, skal man rengøre holderen og udskifte mediet for at gøre det. For alternative monteringsmetoder se27.
6. Optagelse af billeder
- Konfigurer time-lapse-optagelse. Indstil et tidsinterval på 5-10 minutter med 3-5 μm z-mellemrum mellem stakke. Efterlad et tomt rum oven på z-stakken for at forudse embryovækst, mindst 50 μm, og tilføj 30 μm for hver time, erhvervelsen ikke overvåges.
- Hvis den er tilgængelig, skal du aktivere indstillingen Automatisk lagring for at tillade overvågning af anskaffelsen fra en pc for at tillade justering af z-stakstørrelsen, hvis det er nødvendigt, så det passer til interesseområdet inden for fokus.
Figur 3: Live billedbehandlingsværktøjer og opsætning . (A) Dissekering af museembryoner med en agarosebelagt skål under stereomikroskopet. (B) Diagram over trinnene til dissekering af museembryoner til levende billeddannelse. C) embryonplacering i holderen. D) Embryoholderens udformning og karakteristika. F) Inkubatorkammer omkring nedsænkningsmålet. (G) Diagram over den endelige opsætning for time-lapse-erhvervelse. Skalabjælke = 500 μm (A). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brugte protokollen til at visualisere NOTCH-signalaktivering i tidlige hjerteforfædre, der var ved at differentiere sig til endotelceller under primitiv hjerterørmorfogenese. Til det krydsede vi vildtype C57BL/6-N-mus med Tg(CBF:H2BVenus,+) mus18 for at opnå embryoner, der rapporterede NOTCH-aktivitet gennem gult fluorescerende protein Venus. Ved E7.5 er Venus fluorescens til stede i hele neurale ektoderm, med nogle få positive kerner ved den splanchniske og ekstraembryonale mesoderm. Efter 4 timer aktiverer endotelprogenitorer Venus og samles til dannelse af endokardierøret og underliggende aortas, som bliver lukkede strukturer efter 7 timer (figur 4).
Figur 4: Udvikling af levende hele embryohjerter ved multifotonbilleddannelse. Udvalgte tidspunkter fra en time-lapse-video af et CBF:H2BVenus+/- museembryo på et tidligt knoppestadium (E7.5). (A) Brightfield optiske sektioner. B) 480-510 nm detektorbånd, der viser Venus fluorescerende proteinekspression. Skalastænger = 100 μm. Gule pilespidser peger på det udviklende endokardiale lumen og aortas. Tiden er angivet i h:min øverst til højre på hvert billede. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidlige hjerteforfædre organiserer sig i et primitivt hjerterør, der begynder at slå, mens det stadig dannes. At forstå, hvordan denne proces finder sted, er nøglen til at lokalisere det brede spektrum af medfødte hjertefejl til specifikke morfogenetiske hændelser. Til det giver levende billeddannelse mulighed for at studere normal og defekt embryonal udvikling med øget tidsmæssig opløsning. Dette er især nyttigt til at studere tidlige hjertestamceller, da de hurtigt overgår gennem multipel differentiering og migrationsadfærd7.
Fordi vi kan studere forskellige embryonale stadier i en enkelt prøve, kan den levende billeddannelsesprotokol, der præsenteres her, bruges til at bekræfte interpolationen af morfogenetiske begivenheder undersøgt i statisk analyse. Dette vil hjælpe med at forstå rækkefølgen af udviklingsmæssige begivenheder på en kontinuerlig måde. Desuden giver live analyse multidimensionelle data, som muliggør klassificering af celletyper med hidtil uset præcision ved at måle cellulær adfærd28.
På trods af sine fordele har den her foreslåede metode nogle begrænsninger. Selvom embryonerne kan udvikle sig godt op til 48 timer inde i mikroskopet, har interesseområdet tendens til at bevæge sig ud af rammen i lange erhvervelser. For at forhindre, at dette sker, skal brugeren regelmæssigt kontrollere embryoets drift under erhvervelsesprocessen. Selvom der findes automatiske systemer til korrektion af prøvefokus12, kan disse ikke implementeres i de fleste kommercielt tilgængelige mikroskoper. Alternativt kan to eller flere brugere skiftes til at overvåge og justere embryorammen og stakken, så lange erhvervelser ikke er så udfordrende. Det skal dog huskes, at lange erhvervelser har en betydelig chance for fiasko, især for uuddannede brugere. Mindre embryoskader under dissektion og dårlig placering i holderen er to af hovedårsagerne. For at forbedre disse færdigheder kan man starte med at dyrke monterede embryoner i inkubatoren, før man prøver levende billeddannelseseksperimenter. På den måde kan man teste, om fostre udvikler sig ordentligt, før man bruger mikroskopiressourcer.
Sammenfattende åbner levende billeddannelsesmetoder nye veje til at studere embryonal udvikling. Protokollen, der præsenteres her, tillader detaljeret analyse af fænotypernes oprindelse i mutante embryoner eller test af funktionen af specifikke molekylære veje gennem farmakologisk manipulation. Med dette videoværktøjssæt sigter vi mod at lette dets brede anvendelse til at forstå kompleksiteten af tidlige hjerteforfædre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Dr. Kenzo Ivanovitch for tidligere arbejde med denne metode og gruppen af Dr. Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Japan) for at levere den indledende ekspertise inden for embryomontering. Denne undersøgelse blev støttet af Grant PGC2018-096486-B-I00 fra det spanske Ministerio de Ciencia e Innovación og Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 fra EU's Horizon 2020-program til MT og Grant 1380918 fra FEDER Andalucía 2014-2020 Operating Program til JND. MS blev støttet af et La Caixa Foundation ph.d.-stipendium (LCF / BQ / DE18 / 11670014) og The Company of Bioologists rejsestipendium (DEVTF181145). CNIC støttes af det spanske videnskabsministerium og ProCNIC Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), Cambridge, England. 1631-1642 (1997).
- Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
- Lawson, K. A.
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
- Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
- McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
- Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
- Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
- Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
- Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- González Hinojosa, F. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental. , Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , Cold Harbor Laboratory Press. 814 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
- Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
- Crainiciuc, G., et al.
