Summary
हम माउस भ्रूण संस्कृति और इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं के 3 डी + टाइम इमेजिंग को सक्षम बनाता है। यह वीडियो-टूलकिट सफल लाइव इमेजिंग के लिए आवश्यक प्रमुख कौशल को संबोधित करता है अन्यथा पाठ-केवल प्रकाशनों से प्राप्त करना मुश्किल है।
Abstract
हृदय के विकास के पहले चरण सेल व्यवहार और भेदभाव में भारी परिवर्तन का संकेत देते हैं। जबकि निश्चित भ्रूण का विश्लेषण अभी भी स्नैपशॉट में विशिष्ट विकास चरणों का विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देता है, लाइव इमेजिंग भ्रूण को विकसित होने पर इमेजिंग करके गतिशील मोर्फोजेनेटिक घटनाओं, जैसे सेल माइग्रेशन, आकार परिवर्तन और भेदभाव को कैप्चर करता है। यह निश्चित विश्लेषण का पूरक है और भ्रूणजनन के दौरान अंगों के विकास की समझ का विस्तार करता है। इसके फायदों के बावजूद, लाइव इमेजिंग का उपयोग शायद ही कभी माउस मॉडल में इसकी तकनीकी चुनौतियों के कारण किया जाता है। प्रारंभिक माउस भ्रूण संवेदनशील होते हैं जब सुसंस्कृत पूर्व विवो होते हैं और कुशल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है। माउस विकास अनुसंधान में लाइव इमेजिंग के व्यापक उपयोग की सुविधा के लिए, यह पेपर दो-फोटॉन लाइव माइक्रोस्कोपी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो माउस भ्रूण में दीर्घकालिक अधिग्रहण की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल के अलावा, भ्रूण हैंडलिंग और संस्कृति अनुकूलन पर सुझाव प्रदान किए जाते हैं। यह प्रारंभिक माउस ऑर्गेनोजेनेसिस में प्रमुख घटनाओं को समझने में मदद करेगा, कार्डियोवैस्कुलर पूर्वज जीव विज्ञान की समझ को बढ़ाएगा।
Introduction
पूरे भ्रूण में पोषक तत्वों को पंप करना शुरू करने के लिए भ्रूणजनन के दौरान हृदय जल्दी बनता है, जबकियह विकसित करना जारी रखता है। माउस भ्रूण में, गैस्ट्रुलेशन की शुरुआत के डेढ़ दिन बाद, एक अल्पविकसित हृदय अंग पूर्ववर्ती ध्रुव 2,3 पर इकट्ठा होता है। प्रारंभिक स्ट्रीक (ईएस) चरण तक, एपिब्लास्ट में कार्डियक पूर्वज आदिम लकीर के माध्यम से नवजात मेसोडर्मल परत 4,5,6 में प्रवेश करते हैं और पूर्ववर्ती ध्रुव पर पलायन करना शुरू करते हैं, जहां वे आदिम हृदय ट्यूब बनाने के लिए अंतर करते हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, प्रारंभिक हृदय पूर्वज माइग्रेशन7 (चित्रा 1) के अलावा सेल पुनर्व्यवस्था, आकार परिवर्तन और भेदभाव से गुजरते हैं।
प्रारंभिक कार्डियक पूर्वजों ने एक साथ एक कार्यात्मक अंग को अलग करने और बनाने की उनकी उल्लेखनीय क्षमता के कारण लगभग एक सदी तक शोधकर्ताओं को आकर्षित किया है। पिछले दो दशकों में, क्लोनल विश्लेषण और सशर्त नॉकआउट मॉडल से पता चला है कि प्रारंभिक हृदय विकास एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया 8,9,10 में अलग-अलग सेल स्रोतों को फंसाता है। हालांकि, आदिम हृदय ट्यूब की 3 डी संरचना और इसके मोर्फोजेनेसिस की गतिशील प्रकृति अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण बनाती है (चित्रा 1), और हम इसकी पूर्ण जटिलता11 को समझने से बहुत दूर हैं।
इन गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, लाइव इमेजिंग विधियां अब एक अभूतपूर्व विवरण 7,12,13,14 प्रदान करती हैं। माउस मॉडल में, लाइव दृष्टिकोण विकास ता्मक विषयों से पूछताछ करने के लिए महत्वपूर्ण रहे हैं जोस्थिर विश्लेषण 7,13,15 द्वारा संबोधित करना मुश्किल है। जबकि दीर्घकालिक पूर्व विवो संस्कृति और मजबूत माइक्रोस्कोप सेटअपतेजी से 16,17 आगे बढ़ रहे हैं, कुछ शोधकर्ताओं के पास लाइव भ्रूण की सफलतापूर्वक छवि बनाने की विशेषज्ञता है। यद्यपि पेपर-आधारित प्रकाशन लाइव इमेजिंग प्रयोगों को पुन: पेश करने के लिए पर्याप्त तकनीकी विवरण प्रदान करते हैं, कुछ कौशल और चालें दृश्य उदाहरणों या सहकर्मी-से-सहकर्मी सहायता के बिना समझना मुश्किल है। इस सीखने की प्रक्रिया में तेजी लाने और प्रयोगशालाओं के बीच लाइव इमेजिंग के उपयोग को फैलाने के लिए, हमने एक वीडियो प्रोटोकॉल (चित्रा 2) इकट्ठा किया जो गैस्ट्रुलेटेड माउस भ्रूण पर लाइव इमेजिंग करने के लिए आवश्यक कौशल इकट्ठा करता है।
चित्रा 1: माउस भ्रूण में कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं का प्रारंभिक विभेदन गैस्ट्रुलेशन की शुरुआत से आदिम हृदय ट्यूब गठन से पहले के चरण तक। कार्डियक पूर्वज कोशिकाएं गैस्ट्रुलेशन की शुरुआत के तुरंत बाद मेसोडर्म में प्रवेश करती हैं, भ्रूण के विपरीत पक्ष में पलायन करती हैं। आरेखों के शीर्ष पर रूपात्मक और भ्रूण दिवस (ई) चरण लिखा गया है। डैश किए गए तीर गैस्ट्रुलेशन के दौरान आदिम हृदय ट्यूब पूर्वजों के प्रवास प्रक्षेपवक्र को दर्शाते हैं। इस आंकड़े को11 से अनुकूलित किया गया था। संक्षिप्तरूप: ईएस = प्रारंभिक स्ट्रीक; एमएस = मध्य स्ट्रीक; ईएचएफ = अर्ली हेड फोल्ड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: प्रारंभिक हृदय पूर्वजों की लाइव इमेजिंग के लिए वर्कफ़्लो आरेख. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं को सीएनआईसी पशु प्रयोग आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, मैड्रिड समुदाय (संदर्भ प्रोईएक्स 220/15) द्वारा और यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63ईयू और प्रयोगात्मक और अन्य वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा के संबंध में सिफारिश 2007/526/ ईसी के अनुरूप, रियल डेक्रेटो 1201/2005 के तहत स्पेनिश कानून में लागू किया गया था।
इस प्रोटोकॉल में फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक माउस लाइन से दो पुरुषों का उपयोग शामिल है जो नॉच गतिविधि टीजी (सीबीएफ: एच 2 बीवेनस, +) 18 की रिपोर्टिंग करते हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों, जानवरों और उपकरणों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. उपकरण और धारक अनुकूलन
- 1 सेमी लंबे टंगस्टन तार के टुकड़ों को काटें और उपलब्ध किसी भी सरल तरीके का उपयोग करके उन्हें 0.02-0.05 मिमी व्यास तक तेज करें, उदाहरण के लिए, संतृप्त सोडियम नाइट्राइट समाधान19 में तार की नोक को डुबोना।
- कोहनी वाली कांच की केशिकाएं तैयार करें।
- एक मानक 1.0 मिमी ग्लास केशिका के मध्य बिंदु को 3-6 सेकंड के लिए बनसेन लाइटर पर रखें, दोनों सिरों से धीरे-धीरे खींचें जब तक कि केशिका पतली और लचीली न हो जाए। उस बिंदु पर, केशिका को आधे में तोड़ें और सिरे से 2 सेमी 90 ° मोड़ उत्पन्न करने के लिए इसे थोड़ी देर के लिए गर्म करें।
- पॉलीमिथाइल मेथैक्रिलेट का एक टुकड़ा देखा जो लगभग 7 मिमी लंबा, 4 मिमी चौड़ा और 2 मिमी मोटा था (चित्रा 3 डी)।
नोट: पॉलीमिथाइल मेथैक्रिलेट शीट या तो पुनर्नवीनीकरण प्रयोगशाला उपकरणों से प्राप्त की जा सकती है या नए ऑर्डर किए जा सकते हैं। - एक बेंच विज़ का उपयोग करके मेथैक्रिलेट टुकड़े को पकड़ें। इसके बाद, पूरे टुकड़े (चित्रा 3 डी) के माध्यम से कस्टम आकार के छेद ों को ट्रांसवर्सल रूप से ड्रिल करें।
नोट: आमतौर पर, ई 6.5 से ई 7.5 माउस भ्रूण को 0.2-0.5 मिमी व्यास ड्रिल का उपयोग करने की आवश्यकता होती है।- कम लेकिन निरंतर दबाव लागू करते हुए ड्रिल को धीरे-धीरे घुमाएं। यदि धारक के अंदर एक ड्रिल टूट जाती है, तो टुकड़े को छोड़ दें, क्योंकि धातु को बाहर नहीं निकाला जा सकता है।
- धारक के किनारों को चिकना करने और इसके आकार को समायोजित करने के लिए एक अच्छी फ़ाइल का उपयोग करें। इसके अतिरिक्त, भ्रूण की स्थिति (चित्रा 3 डी) की सुविधा के लिए धारक के किनारों पर एक हल्की ढलान बनाएं।
- तैयार धारक को कुल्ला करने के लिए आसुत जल के साथ एक डिश में रखें।
- यह देखने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे धारक की जांच करें कि क्या छेद में ड्रिलिंग धूल है। यदि धूल मौजूद है, तो इसे हटाने के लिए टंगस्टन सुइयों का उपयोग करें।
- धारक को निष्फल करने के लिए, इसे आसुत जल से भरे शंक्वाकार ट्यूब में रखें और इसे न्यूनतम 20 वाट बिजली उत्पादन के साथ 20 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
2. मीडिया की तैयारी
- पूरक प्रणाली को गर्म करने के लिए, 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर वाणिज्यिक या घर का बना 20 चूहे सीरम के दो500 μL एलिकोट छोड़ दें।
नोट: चूहे के सीरम को तैयार करने के तरीके पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए,21 देखें। - एक सेल कल्चर हुड में, माइक्रोस्कोप में भ्रूण की खेती के लिए माध्यम के दो एलिकोट तैयार करें। प्रत्येक के लिए, लाइव-सेल इमेजिंग के लिए डीएमईएम के 490 μL, निष्क्रिय चूहे के सीरम के 500 μL, और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 μL को 50 μg / mL पेनिसिलिन और 50 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन22 की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मिलाएं।
नोट: संस्कृति माध्यम की मात्रा सुसंस्कृत होने वाले भ्रूण के समय और संख्या पर निर्भर करती है। अंगूठे के एक नियम के रूप में, इष्टतम विकास के लिए E7.0 भ्रूण में प्रति दिन प्रति भ्रूण न्यूनतम 200 μL की आवश्यकता होती है। - 2 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, 0.22 μm छिद्र आकार झिल्ली फ़िल्टर के माध्यम से माध्यम को एक नई ट्यूब में फ़िल्टर करें और इसे भ्रूण संस्कृति23 से पहले 1 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में ढक्कन-खुलारखें।
- एल-ग्लूटामाइन बोतल के साथ पूरक डीएमईएम के 500 एमएल में जोड़कर विच्छेदन माध्यम तैयार करें: भ्रूण गोजातीय सीरम का 50 एमएल, 25 एमएम एचईपीईएस-एनएओएच का 10 एमएल (पीएच 7.2), और पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन का 10 एमएल (50 मिलीग्राम / एमएल)।
- इसके बाद, इसे 50 एमएल एलिकोट में अलग करें, 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में तीन एलिकोट रखें और बाकी को 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
3. भ्रूण विच्छेदन
- एक E6.75-E7.5 गर्भवती माउस को इच्छामृत्यु करें।
- गर्भाशय निकालें और इसे सूखे और साफ पेपर वाइप पर रखें। फिर, गर्भाशय को काट लें, मेसोमेट्रायल साइड से बारीक कैंची की नोक डालें और निर्णय लेने के लिए ब्लेड को स्लाइड करें और उन्हें विच्छेदन माध्यम में स्थानांतरित करें। विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए,24 देखें।
- एक्टोप्लासेंटल शंकु को बरकरार रखते हुए भ्रूण को विच्छेदित करें (चित्रा 3 ए, बी)। एक विस्तृत विच्छेदन विधि के लिए,25 देखें।
- फिर, रीचर्ट की झिल्ली को छील लें, इसका हिस्सा एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक क्षेत्र (चित्रा 3 बी) पर छोड़ दें।
नोट: इस चरण के लिए फाइन फोर्स आवश्यक हैं। अनुभवहीन उपयोगकर्ता डिश की सतह के खिलाफ फोर्सप्स की युक्तियों को झुकाने से बचने के लिए 2% अगारोस जेल-लेपित व्यंजनों पर भ्रूण का विच्छेदन कर सकते हैं (चित्रा 3 सी)। - विच्छेदन को मध्यम गर्म रखने के लिए, इसे हर 10 मिनट में बदलें। इसके अलावा, 3-4 के समूहों में विच्छेदन निर्णय लें, जबकि बाकी को विच्छेदन माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में रखा जाए। विच्छेदित भ्रूण को तुरंत संस्कृति माध्यम में रखें।
- फ्लोरेसेंस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके वांछित फ्लोरेसेंस विशेषताओं वाले भ्रूण का चयन करें और उन्हें सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कल्चर माध्यम युक्त ट्यूब में रखें।
- यदि भ्रूण E6.5 से E7.0 चरणों में हैं, तो ढक्कन बंद करें और इमेजिंग से पहले भ्रूण को 2 घंटे के लिए ठीक होने के लिए छोड़ दें।
नोट: E6.5 से E7.0 भ्रूण संवेदनशील हैं। उन्हें सीधे माइक्रोस्कोप के नीचे भी रखा जा सकता है, लेकिन प्रीकल्चरिंग उन लोगों के चयन की अनुमति देता है जो विच्छेदन से सबसे अच्छा ठीक हो जाते हैं, जिससे सफलता की संभावना बढ़ जाती है।
4. माइक्रोस्कोप तैयार करना
- लेजर, कंप्यूटर और सॉफ्टवेयर सहित सभी माइक्रोस्कोप घटकों को चालू करें। तापमान नियंत्रकों को चालू करें और संतुलन सुनिश्चित करने के लिए 3 घंटे पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
- यदि विसर्जन का पता लगाने के उद्देश्य का उपयोग कर रहे हैं, तो अवशेष-मुक्त डिस्पोजेबल पोंछे का उपयोग करके इसे साफ करें। 60 मिमी डिश का उपयोग करके डबल-डिस्टिल्ड पानी में उद्देश्य की नोक को डुबोएं और अधिग्रहण शुरू होने तक इसे छोड़ दें।
- सीओ2 नियंत्रक चालू करें और इसे 7% पर सेट करें।
- ग्लास कवरस्लिप बॉटम (14 मिमी व्यास) के साथ 35 मिमी डिश पर उच्च-वैक्यूम सिलिकॉन ग्रीस की एक बूंद रखें, धारक को बूंद के ऊपर रखें, और इसे स्थिर करने के लिए धीरे से दबाएं।
- एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, डिश के ग्लास-बॉटम हिस्से को भरने के लिए कल्चर माध्यम जोड़ें। ऐसा करते समय, धारक के छेदों में हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए धारा का लक्ष्य रखें।
- यदि बुलबुले बने रहते हैं, तो बुलबुले को धीरे से चूसने के लिए, चरण 1.2 में तैयार ग्लास केशिका का उपयोग करें, जो मुखपत्र के साथ सिलिकॉन ट्यूब से जुड़ा हुआ है।
नोट: केशिका का कोहनी वाला छोर छेद के माध्यम से पहुंच की सुविधा प्रदान करेगा।
5. भ्रूण बढ़ रहा है
- इनक्यूबेटर में ठीक होने के लिए छोड़े गए 2-3 भ्रूणों को धारक के साथ डिश में स्थानांतरित करें। बाकी को बैकअप के रूप में इनक्यूबेटर में छोड़ दें।
- बल की एक जोड़ी और एक पतला टंगस्टन सुई का उपयोग करके छेद में भ्रूण सेट करें। एक्टोप्लासेंटल शंकु द्वारा भ्रूण को हुक करने के लिए सुई का उपयोग करें और इसे आकार-मिलान छेद में डालें। भ्रूण को गतिहीन करने के लिए, शंकु को 90-120 ° तक घुमाएं ताकि रीचटर की झिल्ली छेद की दीवारों का पालन करे (चित्रा 3 सी)। वैकल्पिक विवरण के लिए,26 देखें।
- भ्रूण और धारक वाले पकवान को सावधानीपूर्वक माइक्रोस्कोप प्लेट (चित्रा 3 एफ, जी) में ले जाएं।
नोट: यदि लगातार स्थानांतरित नहीं किया जाता है, तो भ्रूण धारक से बाहर निकल सकता है। - मध्यम-उद्देश्य इंटरफ़ेस पर एक तरल मेनिस्कस बनने तक उद्देश्य को कम करें।
- माइक्रोस्कोप दूरबीन के तहत प्रेषित प्रकाश का उपयोग करके भ्रूण का पता लगाएं और भ्रूण को फोकस में रखें।
- इनक्यूबेशन कक्ष को माउंट करें और टेप (चित्रा 3 एफ) का उपयोग करके उद्देश्य के चारों ओर इसे सील करें।
- माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर लाइव कैप्चर का उपयोग करके, लेजर आउटपुट और गेन स्तरों को समायोजित करें।
नोट: ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और टीडीटोमेटो संवाददाताओं के दो-फोटॉन अधिग्रहण के लिए, 980 एनएम पर 30% आउटपुट लेजर पावर और गैर-डिसकैंटेन डिटेक्टरों पर 70% लाभ का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया गया था (चित्रा 3 जी)। - वाष्पीकरण से बचने के लिए, उद्देश्य पर धीरे-धीरे टपकाकर माध्यम को पैराफिन तेल के साथ कवर करें।
नोट: यह अंतिम बिंदु है जहां धारक में अतिरिक्त भ्रूण लगाए जा सकते हैं। एक बार पैराफिन तेल से ढकने के बाद, किसी को धारक को साफ करना होगा और ऐसा करने के लिए माध्यम को बदलना होगा। वैकल्पिक माउंटिंग विधियों के लिए27 देखें।
6. छवि अधिग्रहण
- टाइम-लैप्स रिकॉर्डिंग सेट करें। ढेर के बीच 3-5 μm z-space के साथ 5-10 मिनट का समय अंतराल सेट करें। भ्रूण के विकास का अनुमान लगाने के लिए जेड-स्टैक के शीर्ष पर एक खाली जगह छोड़ दें, न्यूनतम 50 μm, हर घंटे के लिए 30 μm जोड़ने से अधिग्रहण की निगरानी नहीं की जाएगी।
- यदि उपलब्ध हो, तो ऑटो-सेव विकल्प को सक्षम करें ताकि व्यक्तिगत कंप्यूटर से अधिग्रहण के पर्यवेक्षण की अनुमति मिल सके, यदि आवश्यक हो, तो फोकस के भीतर रुचि के क्षेत्र को फिट करने के लिए जेड-स्टैक आकार के समायोजन की अनुमति दे सके।
चित्रा 3: लाइव इमेजिंग टूल और सेटअप। (ए) स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे एक अगारोस-लेपित डिश के साथ माउस भ्रूण का विच्छेदन। (बी) लाइव इमेजिंग के लिए माउस भ्रूण को विच्छेदित करने के चरणों का आरेख। (सी) धारक में भ्रूण की स्थिति। (डी) भ्रूण धारक डिजाइन और विशेषताएं। (च) विसर्जन उद्देश्य के चारों ओर इनक्यूबेटर कक्ष। (छ) टाइम-लैप्स अधिग्रहण के लिए अंतिम सेटअप का आरेख। स्केल बार = 500 μm (A)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Representative Results
हमने प्रारंभिक हृदय पूर्वजों में नॉच सिग्नलिंग सक्रियण की कल्पना करने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग किया, जो आदिम हृदय ट्यूब मोर्फोजेनेसिस के दौरान एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के बारे में था। इसके लिए, हमने पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन वीनस के माध्यम से नॉच गतिविधि की रिपोर्ट करने वाले भ्रूण प्राप्त करने के लिए टीजी (सीबीएफ: एच 2 बीवेनस, +) चूहों18 के साथ जंगली प्रकार के सी 57बीएल / 6-एन चूहों को पार किया। ई 7.5 पर, शुक्र प्रतिदीप्ति पूरे तंत्रिका एक्टोडर्म में मौजूद होती है, जिसमें स्प्लेनिक और एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक मेसोडर्म में कुछ सकारात्मक नाभिक होते हैं। 4 घंटे के बाद, एंडोथेलियल पूर्वज शुक्र को सक्रिय करते हैं और एंडोकार्डियल ट्यूब और अंतर्निहित महाधमनी बनाने के लिए इकट्ठा होते हैं, जो 7 घंटे के बाद संलग्न संरचनाएं बन जाते हैं (चित्रा 4)।
चित्रा 4: मल्टीफोटॉन इमेजिंग द्वारा पूरे भ्रूण के दिल के विकास को लाइव करें। प्रारंभिक कली चरण (E7.5) में CBF: H2BVenus +/- माउस भ्रूण के टाइम-लैप्स वीडियो से चयनित समय बिंदु। (ए) ब्राइटफील्ड ऑप्टिकल सेक्शन। (बी) 480-510 एनएम डिटेक्टर बैंड शुक्र फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखाता है। स्केल सलाखों = 100 μm. पीले तीर के निशान विकासशील एंडोकार्डियल लुमेन और महाधमनी को इंगित करते हैं। समय प्रत्येक छवि के शीर्ष दाईं ओर h:min में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्रारंभिक हृदय पूर्वज एक आदिम हृदय ट्यूब में व्यवस्थित होते हैं जो अभी भी बनने के दौरान धड़कना शुरू कर देता है। यह समझना कि यह प्रक्रिया कैसे होती है, विशिष्ट मोर्फोजेनेटिक घटनाओं के लिए जन्मजात हृदय दोषों के व्यापक स्पेक्ट्रम को इंगित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके लिए, लाइव इमेजिंग बढ़े हुए अस्थायी संकल्प के साथ सामान्य और दोषपूर्ण भ्रूण विकास का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। यह विशेष रूप से प्रारंभिक हृदय पूर्वज कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है क्योंकि वे कई भेदभाव और प्रवासन व्यवहार 7 के माध्यम से जल्दी से संक्रमणकरते हैं।
क्योंकि हम एक ही नमूने में विभिन्न भ्रूण चरणों का अध्ययन कर सकते हैं, यहां प्रस्तुत लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग स्थिर विश्लेषण में अध्ययन किए गए मोर्फोजेनेटिक घटनाओं के प्रक्षेप की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। यह निरंतर तरीके से विकासात्मक घटनाओं के अनुक्रम को समझने में मदद करेगा। इसके अलावा, लाइव विश्लेषण बहु-आयामी डेटा उत्पन्न करता है, जो सेलुलर व्यवहार 28 को मापकर अभूतपूर्व परिशुद्धता के साथ सेल प्रकारों के वर्गीकरण की अनुमतिदेता है।
इसके फायदों के बावजूद, यहां प्रस्तावित विधि की कुछ सीमाएं हैं। यद्यपि भ्रूण माइक्रोस्कोप के अंदर 48 घंटे तक अच्छी तरह से विकसित हो सकते हैं, रुचि का क्षेत्र लंबे अधिग्रहण में फ्रेम से बाहर चला जाता है। ऐसा होने से रोकने के लिए, उपयोगकर्ता को नियमित रूप से अधिग्रहण प्रक्रिया के दौरान भ्रूण के बहाव की जांच करनी चाहिए। यद्यपि नमूना फोकस को सही करने के लिए स्वचालित सिस्टम मौजूद हैं12, इन्हें अधिकांश व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोप में लागू नहीं किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, दो या दो से अधिक उपयोगकर्ता भ्रूण फ्रेम और स्टैक की निगरानी और समायोजन कर सकते हैं, ताकि लंबे अधिग्रहण उतने चुनौतीपूर्ण न हों। हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि लंबे अधिग्रहण में विफलता की काफी संभावना है, खासकर अप्रशिक्षित उपयोगकर्ताओं के लिए। विच्छेदन के दौरान मामूली भ्रूण क्षति और धारक में खराब स्थिति दो मुख्य कारण हैं। इन कौशलों को बेहतर बनाने के लिए, लाइव इमेजिंग प्रयोगों की कोशिश करने से पहले इनक्यूबेटर में माउंटेड भ्रूण की खेती करके शुरू किया जा सकता है। इस तरह, कोई परीक्षण कर सकता है कि माइक्रोस्कोपी संसाधनों को खर्च करने से पहले भ्रूण ठीक से विकसित होते हैं या नहीं।
सारांश में, लाइव इमेजिंग विधियां भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए नए रास्ते खोल रही हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती भ्रूण में फेनोटाइप की उत्पत्ति का विस्तार से विश्लेषण करने या औषधीय हेरफेर के माध्यम से विशिष्ट आणविक मार्गों के कार्य का परीक्षण करने की अनुमति देता है। इस वीडियो टूलकिट के साथ, हम प्रारंभिक हृदय पूर्वजों की जटिलता को समझने की दिशा में इसके व्यापक उपयोग को सुविधाजनक बनाने का लक्ष्य रखते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखक इस पद्धति पर पिछले काम के लिए डॉ केंजो इवानोविच और भ्रूण माउंटिंग पर प्रारंभिक विशेषज्ञता प्रदान करने के लिए डॉ शिगेनोरी नोनाका (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ नेचुरल साइंसेज, जापान) के समूह को स्वीकार करते हैं। इस अध्ययन को स्पेनिश मिनिस्टरियो डी सिएनसिया ई इनोवासियोन से ग्रांट पीजीसी 2018-096486-बी-आई00 और यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 कार्यक्रम से एमटी को ग्रांट एच 2020-एमएससीए-आईटीएन-2016-722427 और जेएनडी को फेडर एंडालुसिया 2014-2020 ऑपरेटिंग प्रोग्राम से अनुदान 1380918 द्वारा समर्थित किया गया था। एमएस को ला कैक्सा फाउंडेशन पीएचडी फैलोशिप (एलसीएफ / बीक्यू / डीई 18 / 11670014) और द कंपनी ऑफ बायोलॉजिस्ट ट्रैवलिंग फैलोशिप (डीईवीटीएफ 181145) द्वारा समर्थित किया गया था। सीएनआईसी स्पेनिश विज्ञान मंत्रालय और प्रोक्निक फाउंडेशन द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
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